With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.
तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) विशिष्ट स्थानीय microenvironments तहत न्यूरॉन्स, astrocytes और oligodendrocytes में आत्म नवीकरण और भेदभाव करने में सक्षम हैं। यहाँ में, हम वर्तमान में स्ट्रोक विकलांगता (NCT01151124 और NCT02117635, Clinicaltrials.gov) के लिए नैदानिक परीक्षण में, तीन आयामी (3 डी) भेदभाव और एक प्रतिरूप मानव तंत्रिका स्टेम सेल (hNSC) लाइन की miRNA विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का एक सेट प्रस्तुत करते हैं। HNSCs एक नैतिक अनुमोदित पहली तिमाही के मानव भ्रूण कॉर्टेक्स से ली गई है और सशर्त निर्माण सी-mycER टैम की एक प्रति की रेट्रोवायरल एकीकरण का उपयोग कर अमर हो गया। हम 3 डी scaffolds और कैसे पीसीआर सरणी का उपयोग miRNA अभिव्यक्ति में एसोसिएटेड परिवर्तन यों पर भेदभाव hNSCs के अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम को मापने के लिए कैसे का वर्णन। इसके अलावा हम miRNA के ख्यात लक्ष्य का चयन करने के उद्देश्य से कम्प्यूटेशनल विश्लेषण उदाहरण देना। SOX5 और NR4A3 काफी चयनित की उपयुक्त miRNA के ख्यात लक्ष्य के रूप में पहचान की गई नीचे विनियमितविभेदित hNSC में डी miRNAs। Mirna लक्ष्य सत्यापन दोहरी संवाददाता प्लाज्मिड अभिकर्मक और दोहरी luciferase परख द्वारा SOX5 और NR4A3 3'UTRs पर प्रदर्शन किया गया था।
स्टेम सेल अनुसंधान भी ऊतक इंजीनियरिंग, विकास कोशिका जीव विज्ञान, सेलुलर चिकित्सा विज्ञान, जीन थेरेपी के विषयों तक फैला है जो पुनर्योजी चिकित्सा, में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है, और biomaterials (scaffolds और Matrices)। स्टेम कोशिकाओं दोनों अंग developmentand ऊतकों की मरम्मत में महत्वपूर्ण हैं; स्टेम कोशिकाओं कैसे काम समझने नई स्टेम सेल आधारित उपचार एक के विकास के लिए निर्णायक है। CTX0E03 पहली तिमाही के मानव भ्रूण प्रांतस्था से अलग एक प्रतिरूप, सशर्त अमर मानव तंत्रिका स्टेम सेल (hNSC) पंक्ति 2 है। CTX0E03 अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) 3 के तहत नैदानिक सेल बैंकिंग के लिए आवश्यक हैं कि गुणवत्ता विशेषताओं को परिभाषित किया गया है। HNSCs अनायास न्यूरॉन्स, glia, और oligodendrocytes में अंतर कर सकते हैं और फोकल ischemia के 2,4,5 के कृंतक मॉडल में प्रत्यारोपित जब न्यूरोलॉजिकल घाटा सुधारने के लिए सिद्ध किया गया है। CTX0E03 hNSCs स्ट्रोक disabil के लिए नैदानिक परीक्षण में वर्तमान में कर रहे हैंअल्पसंख्यक (NCT01151124 6 और NCT02117635, Clinicaltrials.gov)।
MiRNAs लंबाई में एक औसत 22 न्यूक्लियोटाइड है और विनियामक अणुओं 7 साबित हो रहे हैं, वे प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में नहीं है, बल्कि प्रोटीन में अपनी स्थिरता और अनुवाद को विनियमित करने, mRNAs का तीन प्रधानमंत्री untranslated क्षेत्र (3'UTR) बाँध। MiRNAs विकास, प्रसार, और भेदभाव 8 सहित सेलुलर प्रक्रियाओं के एक नंबर के नियमन में भाग लेने के लिए रिपोर्ट कर रहे हैं। कई miRNAs तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं 9 के भाग्य और विनिर्देश को विनियमित करने में फंसाया गया है।
मानक संस्कृति वातावरण दो आयामी (2 डी) में vivo वातावरण की जटिलता के अनुरूप नहीं है, और फलस्वरूप hNSC भेदभाव की प्रेरण और विनियमन इष्टतम नहीं है। में vivo, कोशिकाओं अन्य द्वारा रचित एक तीन आयामी (3 डी) microenvironment से घिरे रहे हैं कई सहित कोशिकाओं और बाह्य ligands के,कोलेजन, laminin, और अन्य मैट्रिक्स प्रोटीन (बाह्य मैट्रिक्स, ईसीएम) के प्रकार। पिछले अध्ययनों की सूचना दी है कि ECMs और उनके ज्यामिति प्रभाव सेल phenotype और भाग्य 10-15 नकल उतार सामग्री की स्थापत्य स्थलाकृति। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 3 डी scaffolds के एक संख्या में उपलब्ध हैं; हम कोशिकाओं पर आक्रमण और 16-18 अंतर कर सकते हैं जिसमें एक 3 डी अंतरिक्ष प्रदान करता है जो एक 200 माइक्रोन मोटी झिल्ली में एक अच्छी तरह से परिभाषित किया है और वर्दी वास्तुकला के साथ इंजीनियर एक अत्यंत झरझरा polystyrene के पाड़ प्रयोग किया जाता है।
इस के साथ साथ 2 डी और 3 डी भेदभाव assays के axonprocess परिणाम का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके अलावा, हम आगे अपनी भेदभाव पर miRNA के प्रभाव की जांच के लिए एक नैदानिक ग्रेड hNSC लाइन की miRNA अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए एक विधि का वर्णन। सचित्र यहाँ में तरीकों मूल रूप से 19 में वर्णित लोगों पर आधारित हैं।
आकलन और स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को सुधारने के लिए इन विट्रो assays में नए के विकास को हमेशा अपने functionalities और चिकित्सीय क्षमताओं की जांच के लिए एक चुनौती पेश की है। दीर्घकालिक और इन विट्रो भेदभाव परख में एक मजबूत 3 डी के विकास के लिए आवश्यक hNSCs के स्थिर लगाव, सामग्री और संरचनाओं के कार्यकाल में विभिन्न विशेषताओं के साथ कई 3 डी substrates के परीक्षण के द्वारा संबोधित किया गया था। परख विकास के हिस्से के रूप में हम भी इष्टतम सेल बोने एकाग्रता और मूल्यांकन scaffolds के laminin लेपित किया जा करने के लिए आवश्यकता की पहचान की। हमारे hNSCs अनायास पर अंतर कर सकते हैं हालांकि मानक 2D विभेदित hNSCs की तुलना में जब अक्षतंतु प्रक्रिया परिणाम द्वारा मापा के रूप में चार-OHT और विकास का पहलू को हटाने, एक 3 डी संस्कृति प्रणाली के कार्यान्वयन उनके भेदभाव क्षमता में एक महत्वपूर्ण सुधार दिखाया।
3 डी प्रेरित विभिन्न के प्रभाव की जांच करने के लिएhNSC miRNA अभिव्यक्ति पर ntiation हम एक पीसीआर सरणी का इस्तेमाल किया। मानक चिप माइक्रोएरे मुकाबले के साथ पीसीआर सरणी ब्याज की miRNA का एक सीधा मात्रा का ठहराव और सत्यापन का लाभ प्रदान करता है। पीसीआर सरणी 96 से यहां भी कम समय में, उदाहरण के लिए सरणी प्रति miRNA की कुल संख्या के कार्यकाल में ही सीमित है, यह पहले से स्टेम सेल के विकास में सूचना दी कि हमारे मामले में, विशेष रूप से ब्याज की miRNAs को शामिल करने के आधार पर किया जा सकता है। मार्ग ध्यान केंद्रित miRNAs की अभिव्यक्ति समान hNSCs के साथ तुलना में 3 डी और 2 डी विभेदित hNSCs में profiled गया था। सबसे महत्वपूर्ण नीचे विनियमित miRNAs चयनित और ऑनलाइन उपलब्ध एल्गोरिदम (डायना लैब, PicTar, और TargetScans) का उपयोग कर अपनी कार्यक्षमता और जैविक व्याख्या का निर्धारण करने के इरादे के साथ उनके ख्यात लक्ष्य mRNAs का आकलन करने के लिए विश्लेषण किया गया।
एक एकल miRNA लक्ष्य के सैकड़ों पहचान कर सकते हैं और इस कारण हम एक में उपयुक्त उम्मीदवार हो सकता है 3 'UTR mRNAsthat साथ miRNA बातचीत मान्यxonal विनियमन। NR4A3, HSA-मीर 7, और मीर-17 परिवार का एक लक्ष्य, हिप्पोकैम्पस अक्षतंतु के भेदभाव, अस्तित्व, apoptosis और विनियमन में शामिल कर रहे हैं, अभिव्यक्ति के अपने स्तर पर निर्भर करता है जो NR4A परिवार परमाणु रिसेप्टर्स के एक सदस्य है, मार्गदर्शन 26। इसी प्रकार SOX5, HSA-मीर 96 का लक्ष्य, तंत्रिका progenitors 27 अक्षतंतु लंबाई 28, प्रवास, बाद प्रवासी भेदभाव, और न्यूरॉन्स 29 के अनुमानों में कोशिका चक्र प्रगति को नियंत्रित करने की सूचना दी है। SOX5 और NR4A3 दोनों HSA-मीर 96 का एक सीधा लक्ष्य mRNA के रूप में पहचान है, और दोहरी luciferase संवाददाता assays के द्वारा क्रमशः HSA-मीर 7 और 17 थे। दोहरी luciferase (जुगनू और Renilla) एक ही प्लाज्मिड में दो अलग-अलग संवाददाता जीन पर निर्भर करता है और suboptimal अभिकर्मक और एक एकल luciferase प्लाज्मिड प्रणाली के साथ तुलना में साइटोटोक्सिक प्रभाव की वजह से प्रभाव के लिए सामान्य बनाने की इजाजत दी एक बेहतर प्रणाली प्रदान करता है। हमारे परख विकास के हिस्से के रूप में हम भी अपने अभिकर्मक conditi अनुकूलितआदेश में ons उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए।
protocolsdescribed इस के साथ साथ आगे का अनुकूलन और पूर्व नैदानिक अध्ययन और भविष्य नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए intransplantation प्रोटोकॉल beimplemented सकता है जो इन विट्रो hNSC भेदभाव को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम हेला संवर्धन और अभिकर्मक के साथ उसे तकनीकी सहायता के लिए hNSCs की तैयारी में मदद करने के लिए जूली Heward, और Lavaniya Thanabalasundaram स्वीकार करते हैं।
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM:F12 | Invitrogen | 21331-020 | For RMM medium preparation |
Human Albumin Solution | Baxter health care limited | 1501052 | For RMM medium used at a final concentration of 0.03% |
Transferrin, Human recombinant | Sigma | T8158 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
Putrescine DiHCl | Sigma | P5780 | For RMM medium used at a final concentration of 16.2 µg/ml |
Insulin, Human recombinant | Sigma | I9278 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
Progesterone | Sigma | P6149 | For RMM medium used at a final concentration of 60 ng/ml |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-24 | For RMM medium used at a final concentration of 2 mM |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml |
bFGF | Peprotech | AF-100-15 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml |
EGF | Peprotech | AF-100-188 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml |
4-OHT | Sigma | H7904 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM |
Laminin | AMS Biotech | 3400-010-10 | |
TrypZean/EDTA | Lonza | BE02-034E | |
Water for irrigation | Baxter Healthcare | UKF7114 | |
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) | Invitrogen | R007-100 | |
Alvetex 12 well plate | Reinnervate Ltd | AVP002 | |
Ethanol | Merck | 1.00986.1000 | |
βIII tubulin antibody | Sigma | T8660 | |
Hoechst | Sigma | B2261 | |
miRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 | |
RNase free DNase | Qiagen | 79254 | |
Chloroform | Sigma | C7559-5VL | |
miScript II RT Kit | Qiagen | 218160 | |
SYBR green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array | Qiagen/ SABiosciences | MIHS-103Z | |
Lightcycler 480 white 96 plate | Roche | 4729692001 | |
Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT019538-MT0 | |
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT017632-MT01 | |
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). | Qiagen | 1027284 | MiRNA transfection control |
Luc-Pair miR Luciferase Assay | GeneCopeia | LPFR-M010 | |
Lightcycler 480 | Roche | ||
GloMax 96 microplate luminometer | Promega |