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Developmental Biology

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

doi: 10.3791/52410 Published: April 12, 2015

Abstract

Células-tronco neurais (NCCC) são capazes de auto-renovação e diferenciação em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos sob microambientes locais específicos. Aqui, apresentamos um conjunto de métodos utilizados para a diferenciação tridimensional (3D) e análise de miRNA de uma célula-tronco neurais (HNSC) linha clonal, atualmente em ensaios clínicos para o AVC deficiência (NCT01151124 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs foram derivadas de um córtex de ética aprovado primeiro trimestre humana fetal e condicionalmente imortalizada usando a integração retroviral de uma única cópia do c-mycER TAM construir. Nós descrevemos como medir processo axônio conseqüência de hNSCs diferenciadas em andaimes 3D e como quantificar mudanças associadas na expressão miRNA usando matriz de PCR. Além disso, somos exemplos de análise computacional com o objetivo de selecionar miRNA possíveis alvos. SOX5 e NR4A3 foram identificados como alvo putativo miRNA adequada de selecionado significativamente sub-regularmiRNAs d no HNSC diferenciado. Validação alvo Mirna foi realizada em SOX5 e NR4A3 3'UTRs por dupla transfecção plasmídeo repórter e ensaio de luciferase dual.

Introduction

Investigação sobre células estaminais desempenha um papel central na medicina regenerativa, que também abrange as disciplinas de engenharia de tecidos, biologia celular do desenvolvimento, terapias celulares, a terapia gênica e biomateriais (andaimes e matrizes). As células-tronco são importantes tanto no órgão reparação tecidual developmentand; a compreensão de como as células-tronco funcionam é fundamental para o desenvolvimento de tratamentos baseados em células estaminais uma nova. CTX0E03 é uma célula estaminal neural humana imortalizadas condicionalmente (HNSC) linha clonal, 2 isolado a partir de córtex primeiro trimestre do feto humano. CTX0E03 definiu características de qualidade que são essenciais para bancos de células clínica em boas práticas de fabricação (BPF) 3. HNSCs pode diferenciar-se espontaneamente em neurônios, glia, e oligodendrócitos e ter sido provada a melhorar déficits neurológicos quando transplantadas em um modelo de roedor de 2,4,5 isquemia focal. O CTX0E03 hNSCs estão actualmente em ensaios clínicos para o AVC disabildade (NCT01151124 6 e NCT02117635, Clinicaltrials.gov).

MiRNAs tem uma média de 22 nucleótidos de comprimento e são comprovados moléculas reguladoras 7, que não codificam proteínas, mas a região não traduzida 3 ligam primordial (3'UTR) de mRNAs, regulando a sua estabilidade e a tradução em proteínas. MiRNAs são relatados para participar na regulação de um número de processos celulares, incluindo o desenvolvimento, proliferação, diferenciação e 8. Vários miARNs têm sido implicados na regulação do destino e especificação de células estaminais neurais 9.

Em bidimensional (2D) meio de cultura padrão a complexidade do ambiente in vivo não é coincidente, e, consequentemente, a indução e regulação da diferenciação HNSC não é óptima. In vivo, as células são rodeados por um microambiente três dimensões (3D), constituído por outros células e ligantes extracelulares, incluindo muitostipos de colagénios, laminina, e outras proteínas da matriz (matriz extracelular, ECM). Estudos anteriores relataram que a topografia arquitetônico dos materiais que imitam as Ações e seu fenótipo celular influência da geometria e destino 10-15. Um certo número de suportes 3D disponíveis comercialmente estão disponíveis; utilizou-se um andaime de poliestireno altamente poroso engenharia com uma arquitetura bem definida e uniforme em uma membrana de 200 um de espessura que proporciona um espaço 3D em células que podem invadir e diferenciar 16-18.

Relata ensaios de diferenciação 2D e 3D são usados ​​para avaliar a excrescência axonprocess. Além disso, nós descrevemos um método para traçar o perfil do miRNA expressão de uma linha HNSC grau clínico para investigar mais profundamente os efeitos de miRNA em sua diferenciação. Os métodos ilustrados aqui são baseadas em que os anteriormente descritos na 19.

Protocol

1. diferenciação HNSC em Tridimensional Cultura (3D)

NOTA: Isolar e derivar hNSCs, a partir de um tecido aprovado ética, descrito na publicação anterior 2. Por favor, siga as diretrizes éticas e institucionais, enquanto seguem este procedimento.

1.1) Cultura 3D Usando de 12 poços

  1. Utilizar técnicas assépticas durante todo o procedimento. Em uma cabine de segurança biológica, andaimes re-hidratar por adição de 2 ml / poço de etanol a 70% preparada com água para irrigação (WFIr). Evite tocar nos andaimes dispensando o etanol a 70% para baixo na parede de cada poço.
  2. Aspirar cuidadosamente o etanol a 70% e lava-se imediatamente os andaimes com 2 ml / poço de DMEM: F12, durante 1 minuto. Repita o procedimento de lavagem duas vezes. Aspirar cuidadosamente o DMEM: F12 após a última lavagem.
  3. Andaimes do revestimento por adição de 2 ml / poço de laminina (10 ug / ml) em meio DMEM: F12. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 humidified incubadora durante um mínimo de 2 horas. Lavar a placa com DMEM quente: F12.
  4. Semente cada andaime com aproximadamente 500.000 hNSCs em um volume de 150 mL de RMM + FG.
  5. Incubar a placa durante 3 horas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora humedecida para permitir que as células em resolver os andaimes.
  6. Adicionar 3,5 ml de RMM para cada cuidado bem tomar para não desalojar as células dos andaimes.
  7. Incubar a placa durante 7 dias; substituir médio RMM (3,5 ml / poço) após um dia (primeira alimentação) e novamente depois de 2-3 dias a partir da primeira alimentação.
  8. Após 7 dias, remova o meio e corrigir as células com 4% de paraformaldeído (PFA) para imunocitoquímica (ICC) ou adicionar 500 mL / poço de reagente de lise para extração de RNA total (loja de placas a ≤ -80 ° C ou proceder à extração de RNA total) .

1.2) A medição da Axon Processo Conseqüência

  1. Mancha 4% PFA fixa hNSCs diferenciadas de acordo com um protocolo padrão ICC 20 utilizando β3-tubulina (TUBB3) anticorpo primário, detectado com um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo. Núcleos celulares contracorante com Hoechst (1 m).
  2. Capturar imagens representativas de células coradas β3-tubulina usando um microscópio de fluorescência; salvar imagens como tiff ou jpeg. Medida do processo axônio excrescência usando uma ferramenta de medição de software (por exemplo, Pro-Imagem Plus).
  3. Abra a imagem, selecione a opção medições na barra de ferramentas e selecione recurso de rastreamento.
  4. Para iniciar o rastreamento, selecione o ponto de partida no crescimento axonal, clicando no botão do mouse. Seguir ao longo de todo o comprimento do crescimento axonal; clique direito para terminar cada traço. Repetir para medir todos outgrowthswith axónio no campo de visão.
  5. Expresse medições como pixels ou um (pendente de calibração configurada). Medidas de comprimento exportar para um programa de planilha eletrônica para análise comparativa e estatística da amostra.

2. Mirna Expression Usando um Células-Tronco eCaminhos do desenvolvimento focada Matriz miRNA PCR

2.1) a extração de RNA total miRNA

  1. Realizar a extração miRNA em andaimes e amostras crescidas 2D (diferenciado e indiferenciado controle, HNSC).
  2. Descongelar andaimes, inserido numa placa de 12 poços, se necessário. Juntar o conteúdo de reagente de lise (500 mL) de 2 poços na mesma 1,5 ml tubo Eppendorf, volume final de 1 ml de reagente de lise. Tome o cuidado de deixar o andaime no poço.
  3. Para celulares peletizada amostras coletadas anteriormente como secas 2D crescido (diferenciadas culturas HNSC 2D e controle indiferenciada) 1 ml de reagente de lise e transferir o conteúdo em 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
  4. Homogeneizar cada amostra de teste utilizando uma seringa de 1 ml e um curta de 20 a 25 agulha de calibre. Passar o lisado através da agulha utilizando seringa de 1 mL até 5 vezes até um lisado homogénea é conseguido.
  5. Adicionar 200 ul de clorofórmio a cada tubo Eppendorf e a tampa firmemente. Tubos invertido e vortex paramisturar o conteúdo.
  6. Centrifugar cada tubo de microcentrífuga de 1,5 ml contendo homogenato durante 15 min a ≥12,000 x g.
  7. Transferir a fase aquosa superior de cada amostra (para evitar a transferência de qualquer interfase, líquido de cor-de-rosa) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml fresco contendo 750 ul de etanol a 100%. Misture bem por inversão.
  8. Pipeta-se 700 ul de cada amostra de teste, incluindo qualquer precipitado, para um mini-coluna em um tubo de recolha de 2 ml. Fechar a tampa e centrifugar a ≥8,000 xg durante cerca de 30 segundos a temperatura ambiente. Descartar o fluxo de passagem. Repetir esta etapa utilizando a parte restante da amostra.
  9. Realizar um resumo DNA para 15 min.
  10. Adicionar 700 ul ERP buffer para o mini coluna e centrifugar por cerca de 30 segundos a ≥8,000 x g. Descartar o fluxo de passagem.
  11. Lavar mini-coluna por adição de 500 ul de tampão EPR e centrifugando durante aproximadamente 30 segundos a ≥8,000 x g. Descartar o fluxo de passagem. Repita wash.Centrifuge em ≥12,000 xg durante 1 min para secar a membrana ainda mais.
  12. Elui-se o ARN total em um tubo Eppendorf de 1,5 ml por adição de 40 ul de água isenta de RNase para o mini-coluna e centrifugando durante 1 min a ≥8,000 x g. Medir a concentração de ARN total com a ajuda de um espectrofotómetro adequado.

2.2) Preparação de cDNA miARN

  1. Prepare a mistura principal transcrição reversa. Cada amostra requer 4 mL de tampão 5x miScript Hispec, 2 l de 10x nucleics mix, 2 ul miScript reverter mix transcriptase.
  2. Aliquota 8 ul de mistura principal em um tubo de PCR, adicionar o volume necessário de ARN total (250 ng), e adicionar água isenta de RNase para um volume final de 20 ul.
  3. Incubar durante 60 minutos a 37 ° C.Incubate durante 5 min a 95 ° C para inactivar miScript Transcriptase Reversa mistura.
  4. Adicionar 200 mL de água livre de RNase para cada reação de 20 ul transcrição reversa, armazenar a -20 ° C, ou prosseguir com o Real-tiPCR me imediatamente.

2.3) Células Estaminais e Desenvolvimento Pathways Focada miRNA PCR Matriz

  1. Prepare a mistura de componentes PCR em um tubo de 15 ml, adicionando 1375 mL de 2x SYBR master mix verde, 100 l preparação miRNA cDNA, 275 mL de 10x miScript Universal Primer, e 1000 mL de água RNase-free (volume total de 2.750 l).
  2. Transferir PCR em uma mistura de componentes de carga do reservatório de PCR. Remova cuidadosamente a placa de 96 poços PCR matriz da embalagem selada.
  3. Adicionar 25 uL de mistura de PCR componentes para cada uma das cavidades da matriz de PCR, utilizando uma pipeta de 8 canais, ou um pipetador de 12 canais usando apenas 8 dicas. Mudar pontas de pipeta depois de cada passo do ensaio, a fim de evitar a contaminação cruzada entre os poços.
  4. Selar placa com película adesiva óptica, e centrifuga-se durante 1 min a 1000 xg à temperatura ambiente (15-25 ° C) para remover as bolhas. Inspecione visualmente a placa de baixo para garantir que não haja bolhas de ar nos poços.
  5. Coloque a placa de 96 poços de PCR de matriz no reciclador em tempo real.
  6. Programa o reciclador em tempo real de acordo com: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 min, e 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C, e 1 minuto a 60 ° C definir um único (recolha de dados de fluorescência).
  7. Exportar os valores Ct para todos os poços para uma planilha do Excel em branco para uso com PCR Matriz de Análise de Dados Template Excel e software baseado na web.
    NOTA: O software está disponível em www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php .

3. Análise computacional para miRNA alvo de Previsão e Validação de mRNAs alvo por Reporter plasmídeo Transfection e Ddual ensaio de luciferase.

3.1) Análise computacional para miRNA alvo Prediction

  1. Navegar PicTar ( http://pictar.mdc-berlin.de/ ) 21, algoritmo disponível on-line para a identificação de miRNA alvo ARNm de predição.
  2. Clique em "clique aqui para previsão PicTar em vertebrados". Uma nova página será aberta.
  3. Na nova página, interface web PicTar, escolha espécies no menu drop-down e inserir miRNA de interesse na caixa de miRNA ID. Clique busca de alvos de um miRNA.
  4. Observe a lista de mRNAs alvo classificados por pontuação aPicTar.
    NOTA: PicTar calcula uma pontuação que reflete a probabilidade de que um determinado UTR será orientado pelo miRNA selecionado, e com base na complementaridade das sementes, termodinâmica e uma previsão combinatória para objectivos comuns em conjuntos de co-expressa miRNAs 22.
  5. Lista de mRNAs alvo Da mesma forma recuperar usando DIANA-LAB ( http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/ ) 23, e TargetScan ( http://www.targetscan.org/ ) 24, alternativa on line disponível algoritmos.
  6. Compilar um quadro comparativo dos miRNAs baseado em classificação obtida utilizando diferentes ferramentas de software. PicTar classifica por pontuação, DianaLab por Precisão (com base na relação sinal-ruído e uma pontuação de precisão para a avaliação da significância dos resultados previstos), e por TargetScan PCT agregado (com base na complementaridade das sementes, energia livre termodinâmica de ligação, conservação ao longo diferentes espécies), ver Tabela 1.

3.2) A validação de Alvo mRNAs por Reporter plasmídeo Transfection e Dual ensaio de luciferase.

NOTA: 3 'UTR repórteres luciferase para a validação de mRNA alvo tem sido descrito anteriormente 25.

  1. Transfection
    1. Semente células HeLa, a uma densidade de 10 5 células / poço em placa de 24 poços.
    2. Após 24 h, co-transfectar células HeLa com 1,5 mL de reagente de transfecção e quer 100 ng de plasmídeo NR4A3 UTR 3 'UTRor SOX5 3', bem como 20 nM imita miARN (HSA-miR-96-5p para SOX5 3217; UTR, e HSA-miR-7-5p, e HSA-miR-17-5p para NR4A3 UTR 3 ', respectivamente) por poço.
    3. Poços de controlo Co-transfectar com NR4A3 3 'UTRor SOX5 3' UTRplasmid e fluorochrome marcado siRNAs controlo negativo. A transfecção de poços de controlo com fluorocromo marcado siRNAs de controlo negativo permite a avaliação da eficiência de transfecção e responde por mímica miRNA 3'UTR ligam especificidade.
  2. Medição da dupla luciferase Atividades
    1. Meça Firefly e Renilla atividades luciferase 24 horas após a transfecção. Remover o meio de crescimento celular.
    2. Preparar uma solução de trabalho I por adição de 50 ul de substrato I em 10 ml de Solução I; homogeneizar. Adicionar 300 uL de solução de trabalho de 24 I em cada poço.
    3. Transfere-se o conteúdo de cada poço 24 em três poços de uma placa branca de 96, 100 ul cada. Espere 10 minutos e medir Firefly luciferase em conjunto luminometer para aquisição de luminescência.
    4. Prepare solut trabalhandoião II pela adição de 50 ul de substrato II em 10 ml de solução II; homogeneizar. Adicionar 100 uL de solução de trabalho de 96 I em cada poço já contendo 100 uL de solução de trabalho I.
    5. Espere 10 minutos e medir Renilla luciferase em conjunto luminometer para aquisição de luminescência. Calcula-se a relação da luminescência da luciferase do vaga-lume para a luciferase de Renilla.

Representative Results

Na Figura 1 é visualizada a investigação e quantificação de diferenciação HNSC em andaimes 3D em comparação com as culturas tradicionais de superfície plana (2D) e expressedas axônio medições processo de crescimento. Na Figura 2 é representedthe fluxo de trabalho e os resultados para a quantificação miRNA usando células-tronco e as vias de desenvolvimento focado matriz miRNA PCR para investigar expressão diferencial de miRNAs em hNSCs diferenciadas em 2D e 3D, em comparação com o controle indiferenciado. Após a análise comparativa entre miRNA hNSCs diferenciadas e indiferenciadas, e análise computacional para predição alvo, SOX5 e NR4A3 (NOR1) foram identificados como mRNAs alvo putativos. Para estudar a interacção directa entre os miARNs e seu local putativo na 3 'UTR do mRNA foram utilizados dois plasmídeos comercialmente disponíveis que contenham quer SOX5 ou sequência 3'UTR NR4A3 inserido a jusante do gene repórter da luciferase de pirilampo, uma nd contendo no mesmo gene de luciferase Renilla plasmídeo de normalização. Os resultados representativos da UTR 3 'de actividade de luciferase a sub-regulação é apresentada na Figura 3.

Figura 1
Figura 1:. Diferenciação de hNSCs sobre andaimes 3D, e medição de processo axônio es excrescência (A) após coloração ICC padrão para β3-tubulina (verde) e núcleos contrastado com Hoechst (azul) microfotografias representativos foram adquiridos e medição dos processos axônio realizada com o auxílio de um software de análise de imagem. (B) Diagrams relatando a medição do processo axônio excrescência realizada em 2D e 3D hNSCs diferenciados para 1 (1W) ou 3 semanas (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Fluxo de trabalho esquemático de miRNA profiling em hNSCs diferenciadas RNA total, incluindo os miRNAs, foi extraído a partir de qualquer hNSCs diferenciadas sobre andaimes 3D e culturas padrão 2D, ou controle indiferenciado. 250 ng de RNA total foram retro-transcrito com um método que facilita a conversão selectiva de miARNs maduros em cDNA adequados para quantificação miARN com diferenciação de células humanas e desenvolvimento matriz miScript miARN PCR. A geo-média de SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A e RNU6-2 foi utilizado para a análise de dados com base no método 2 -ΔΔct. Mudanças significativas foram definidas como +/- 1,5 dobrar e regulação para baixo a um stamedida estatisticamente significativa. Os dados foram analisados ​​por meio de software baseado na web disponível em resultados são expressos como uma clustergrama. Modificado a partir da Figura 3 19. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Validação da miARN alvo previsto ARNm utilizando um ensaio da luciferase dupla relatório. (A) Esquema representativo de um plasmídeo repórter da luciferase dupla utilizada como uma ferramenta para validar a sequência 3'UTR como um alvo directo de um miARN. (B) micrografia representativa mostrando a eficiência da transfecção. (C)   Sinais, expressos como actividade relativa de luciferase, a partir de 3 humano & #39; genes repórteres UTR ofSOX5 e NR4A3 foi eliminado significativamente para baixo, na presença de HSA-miR-96, e HSA-miR-7 e 17 imita miARN respectivamente. Modificado de Figura 5 19. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

<td> 0,94
DIANALAB PicTar TargetScan
miRNA Gene alvo Sites de destino / genes encontrados Precisão Ponto Aggregate P CT
HSA-miR-96 SOX5 1214/763 1 6,74
HSA-miR-183 DUSP10 302/190 0,72 4.75 0,85
HSA-miR-302a NR4A3 863/473 0,84 3.05 NF
HSA-miR-182 FOXN3 1358/794 0,94 NF 0,96
HSA-miR-7 NR4A3 NF NF 1.61 0,17
HSA-miR-7 FOXN3 399/136 0,17 NF 0,88
hsa-miR-20a NR4A3 1650/841 0,85 5,87 0.63
NR4A3 1955/973 0,9 5,87 0.63
HSA-miR-17 NR4A3 1928/961 0,9 5,38 0,63 + 0,37
hsa-miR-20a EIF4G3 1650/841 0,97 NF NF
HSA-miR-20b EIF4G3 1955/973 0,94 NF NF
HSA-miR-17 EIF4G3 1928/961 0,94 NF NF

Tabela 1: Lista de miRNA mRNAs previsão alvo. Representante da tabela miRNAs, alvo genes preditivos, e análise de algoritmos (predizerion / pontuação / agregado fornecido usando Diana Lab, PicTar e TargetScan respectivamente). Modificada a partir da Tabela 3 19.

Discussion

O desenvolvimento de novos ensaios in vitro para avaliar e melhorar a diferenciação de células-tronco sempre apresentou um desafio para a investigação de suas funcionalidades e capacidades terapêuticas. A longo prazo e de fixação estável de hNSCs, necessária para o desenvolvimento de um ensaio em 3D robusto diferenciação in vitro, foi tratada por meio de testes de vários substratos em 3D com características diferentes em termos de materiais e estruturas. Como parte do desenvolvimento do ensaio, também avaliamos concentração semeadura de células ideal e identificou a necessidade de os andaimes para ser laminina revestido. Embora nossos hNSCs pode diferenciar espontaneamente ao 4-OHT e fator de crescimento de remoção, a implementação de um sistema de cultura 3D mostrou uma melhora significativa em sua capacidade de diferenciação medida pelo axônio processo de crescimento quando comparado com hNSCs 2D diferenciado padrão.

Para investigar o efeito da difere induzida 3Dntiation na expressão HNSC miRNA foi utilizada uma matriz de PCR. Comparado com o chip de microarray padrão matriz PCR oferece as vantagens de uma quantificação direta e validação de miRNA de interesse. Embora a matriz de PCR é limitado em termos de número total de miARN por matriz, por exemplo, em menos do que 96 aqui, ele pode ser adaptado para incluir especificamente miARNs de interesse, no nosso caso anteriormente reportado no desenvolvimento de células estaminais. A expressão da via focada miRNAs foi perfilado em 3D e 2D hNSCs diferenciados em comparação com hNSCs indiferenciadas. Os miRNAs mais significativamente regulada foram selecionadas e analisadas para avaliar seus mRNAs alvo putativos com o intuito de determinar a sua funcionalidade e interpretação biológica usando algoritmos disponíveis on-line (DIANA Lab, PicTar e TargetScans).

Um único miRNA pode reconhecer centenas de alvos e por esta razão nós validado interações miRNA com 3 'UTR mRNAsthat podem ser candidatos apropriados, em umaregulação xonal. NR4A3, um alvo do hsa-miR-7 e miR-17 da família, é um membro da família de receptores nucleares NR4A que, dependendo do seu nível de expressão, estão envolvidos na diferenciação, sobrevivência, apoptose e regulação do axônio do hipocampo orientação 26. Da mesma forma SOX5, uma meta de hsa-miR-96, é relatado para controlar a progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais 27 de comprimento axônio 28, migração, diferenciação pós-migratório, e projeções de neurônios 29. Ambos SOX5 e NR4A3 foram identificados como um ARNm alvo directo de HSA-miR-96, e HSA-miR-7 e 17, respectivamente, por ensaios de luciferase repórter duplo. Duplo de luciferase (Firefly e da Renilla) baseia-se em dois genes repórter diferentes no mesmo plasmídeo e oferece um sistema melhorado que permite a normalização para efeitos causados ​​por transfecção subóptima e efeitos citotóxicos em comparação com um único sistema de plasmídeo da luciferase. Como parte do nosso desenvolvimento do ensaio também otimizado nosso conditi transfecçãoons, a fim de obter alta eficiência.

O protocolsdescribed aqui podem ser exploradas para otimizar ainda mais e caracterizar in vitro HNSC diferenciação que pode beimplemented protocolos intransplantation para estudos pré-clínicos e futuras aplicações clínicas.

Disclosures

Todos os autores são funcionários, estoque e / ou detentores de opções de ações em ReNeuron Ltd ou sua empresa-mãe. Este estudo foi apoiado por ReNeuron (RENE.L).

Acknowledgments

Reconhecemos Julie Heward para ajudar na preparação de hNSCs e Lavaniya Thanabalasundaram pelo apoio técnico com HeLa cultura e transfecção.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM:F12 Invitrogen 21331-020 For RMM medium preparation
Human Albumin Solution  Baxter health care limited  1501052 For RMM medium used at a final concentration of  0.03%
Transferrin, Human recombinant Sigma T8158 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Putrescine DiHCl  Sigma P5780 For RMM medium used at a final concentration of  16.2 µg/ml
Insulin, Human recombinant   Sigma I9278 For RMM medium used at a final concentration of  5 µg/ml
Progesterone  Sigma P6149 For RMM medium used at a final concentration of  60 ng/ml
L-Glutamine  Invitrogen 25030-24 For RMM medium used at a final concentration of  2 mM
Sodium Selenite   Sigma S9133 For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml
bFGF      Peprotech AF-100-15 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml
EGF        Peprotech AF-100-188 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml
4-OHT Sigma H7904 To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM
Laminin AMS Biotech 3400-010-10
TrypZean/EDTA Lonza  BE02-034E
Water for irrigation Baxter Healthcare UKF7114
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) Invitrogen R007-100
Alvetex 12 well plate  Reinnervate Ltd AVP002
Ethanol  Merck  1.00986.1000
βIII tubulin antibody Sigma T8660
Hoechst Sigma B2261
miRNeasy mini kit Qiagen  217004
RNase free DNase  Qiagen  79254
Chloroform Sigma C7559-5VL
miScript II RT Kit  Qiagen  218160
SYBR green PCR kit Qiagen  218073
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array Qiagen/ SABiosciences MIHS-103Z
Lightcycler 480 white 96 plate Roche  4729692001
Lightcycler 480  sealing foil Roche  4729757001
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT019538-MT0
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones  GeneCopeia HmiT017632-MT01
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). Qiagen  1027284 MiRNA transfection control
Luc-Pair miR Luciferase Assay GeneCopeia LPFR-M010
Lightcycler 480  Roche
GloMax 96 microplate luminometer  Promega

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References

  1. Falanga, V. Stem cells in tissue repair and regeneration. J Invest Dermatol. 132, (6), 1538-1541 (2012).
  2. Pollock, K., et al. A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke. Exp Neurol. 199, (1), 143-155 (2006).
  3. Hodges, H., et al. Making stem cell lines suitable for transplantation. Cell Transplant. 16, (2), 101-115 (2007).
  4. Smith, E. J., et al. Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke. Stem Cells. 30, (4), 785-796 (2012).
  5. Stroemer, P., et al. The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair. 23, (9), 895-909 (2009).
  6. Kalladka, D., Muir, K. W. Brain repair: cell therapy in stroke. Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, (6669), 806-811 (1998).
  8. Anokye-Danso, F., et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 8, (4), 376-388 (2011).
  9. Li, X., Jin, P. Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 329-338 (2010).
  10. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Semin Cell Dev Biol. 13, (5), 377-383 (2002).
  11. Buxboim, A., Discher, D. E. Stem cells feel the difference. Nat Methods. 7, (9), 695-697 (2010).
  12. Li, W. J., et al. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials. 26, (6), 599-609 (2005).
  13. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, (7272), 433-441 (2009).
  14. Ortinau, S., et al. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed Eng Online. 9, (1), 70 (2010).
  15. Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. Designing synthetic materials to control stem cell phenotype. Curr Opin Chem Biol. 11, (4), 381-387 (1016).
  16. Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture. Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).
  17. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity. J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).
  18. Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354, (4), 1095-1100 (2007).
  19. Stevanato, L., Sinden, J. D. The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures. Stem Cell Res Ther. 5, (2), 49 (2014).
  20. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number. J Vis Exp. (45), (2010).
  21. Chen, K., Rajewsky, N. Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data. Nat Genet. 38, (12), 1452-1456 (2006).
  22. Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37, (5), 495-500 (2005).
  23. Maragkakis, M., et al. Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels. BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).
  24. Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 120, (1), 15-20 (2005).
  25. Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells. J Vis Exp. (55), (2011).
  26. Ponnio, T., Conneely, O. M. nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility. Mol Cell Biol. 24, (20), 9070-9078 (2004).
  27. Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway. EMBO Rep. 11, (6), 466-472 (2010).
  28. Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (41), 16021-16026 (2008).
  29. Lai, T., et al. SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes. Neuron. 57, (2), 232-247 (2008).
Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo
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Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).More

Stevanato, L., Hicks, C., Sinden, J. D. Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (98), e52410, doi:10.3791/52410 (2015).

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