With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.
Neurale stamceller (NSC) er i stand til selvfornyelse og differensiering til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter på bestemte lokale mikromiljøer. Her presenterer vi et sett av metoder som brukes for tredimensjonal (3D) differensiering og miRNA analyse av en klonal menneskelig nevrale stamcelle (hNSC) linje, for tiden i kliniske studier for hjerneslag uførhet (NCT01151124 og NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs ble avledet fra et etisk godkjent første trimester human foster cortex og betinget udødeliggjort ved hjelp av retroviral integrering av en enkelt kopi av c-mycER TAM konstruere. Vi beskriver hvordan måle axon prosess utvekst av hNSCs differensierte på 3D stillaser og hvordan å kvantifisere tilhørende endringer i miRNA uttrykk ved hjelp av PCR array. Videre kan vi eksemplifisere beregnings analyse med sikte på å velge miRNA mulige mål. SOX5 og NR4A3 ble identifisert som egnet miRNA antatte målet for valgt betydelig ned-regulered mirnas i differensiert hNSC. MiRNA mål validering ble utført på SOX5 og NR4A3 3'UTRs av dual reporter plasmid transfeksjon og dual luciferase assay.
Stamcelleforskning spiller en sentral rolle i regenerativ medisin, som også spenner over fagområdene tissue engineering, utviklingscellebiologi, celle therapeutics, genterapi, og biomaterialer (stillaser og matriser). Stamceller er viktig i begge organ developmentand vev reparasjon; forstå hvordan stamceller fungerer er avgjørende for utvikling av ny stamcellebaserte behandlinger en. CTX0E03 er en klonal, betinget udødelig menneskelig nevrale stamcelle (hNSC) linje 2 isolert fra første trimester human foster cortex. CTX0E03 har definert kvalitet egenskaper som er avgjørende for klinisk cellen banktjenester i henhold til Good Manufacturing Practice (GMP) 3. HNSCs kan spontant differensiere i nevroner, gliaceller, og oligodendrocytter og har vist seg å lindre nevrologiske utfall når transplantert i en gnager modell av fokus iskemi 2,4,5. Den CTX0E03 hNSCs er for tiden i kliniske studier for hjerneslag funksjonshemminger;ligheten (NCT01151124 6 og NCT02117635, Clinicaltrials.gov).
Mirnas har en gjennomsnittlig 22 nukleotider i lengde og er bevist regulatoriske molekyler 7, har de ikke koder for proteiner, men heller binde tre prime uoversatt region (3'UTR) av mRNA, regulere sin stabilitet og oversettelse til proteiner. Mirnas er rapportert til å delta i reguleringen av en rekke cellulære prosesser, blant annet utviklingen, proliferasjon og differensiering 8. Flere mirnas har vært innblandet i regulering skjebnen og spesifisering av nevrale stamceller 9.
I to-dimensjonale (2D) standard kulturmiljøet kompleksiteten av in vivo miljøet ikke er tilpasset, og følgelig induksjon og regulering av hNSC differensiering er ikke optimal. In vivo, blir celler omgitt av en tre-dimensjonal (3D) mikromiljø bestående av annen celler og ekstracellulære ligander, inkludert mangetyper av kollagener, laminin og andre matriksproteiner (ekstracellulær matriks, ECM). Tidligere studier har rapportert at den arkitektoniske topografi av materialene mimicking ECM'er og deres geometri innflytelse cellefenotype og skjebne 10-15. En rekke kommersielt tilgjengelige 3D stillasene er tilgjengelige; vi brukt et høyporøst polystyren stillaset konstruert med en godt definert og ensartet arkitekturen til en 200 um tykk membran som gir en 3D-rom i hvilket cellene kan invadere og differensiere 16-18.
Heri 2D og 3D differensieringsanalyser brukes til å vurdere axonprocess utvekst. Videre beskriver vi en metode for å profilere miRNA uttrykk for en klinisk klasse hNSC linje til videre undersøke miRNA effekter på sin differensiering. Metodene i her illustrert er basert på de som opprinnelig ble beskrevet i 19.
Utviklingen av nye in vitro å vurdere og forbedre differensiering av stamceller har alltid presentert en utfordring for etterforskningen av sine funksjoner og terapeutiske evner. Langtids og stabil festing av hNSCs, som kreves for utvikling av en robust 3D in vitro differensiering assay ble adressert ved å teste flere 3D-substrater med forskjellige egenskaper i begrepet av materialer og konstruksjoner. Som en del av analysen utvikling vi også vurdert optimal celle seeding konsentrasjon og identifisert kravet til stillasene som skal belegges laminin. Selv om våre hNSCs kan spontant skille ved 4-OHT og vekstfaktor-fjerning, gjennomføring av en 3D-kultur-system viste en betydelig forbedring i deres differensiering evne som målt ved axon prosessen utvekst i forhold til standard 2D differensiert hNSCs.
For å undersøke effekten av 3D-indusert differentiation på hNSC miRNA uttrykket vi brukte en PCR array. Sammenlignet med standard chip microarray PCR matrise tilbyr fordelene ved en direkte kvantifisering og validering av miRNA av interesse. Selv om PCR matrisen er begrenset på sikt av totalt antall miRNA per rekke, for eksempel i her mindre enn 96, kan det være skreddersydd for å spesifikt omfatter mirnas av interesse, i vårt tilfelle tidligere rapportert i stamcelle utvikling. Uttrykket av pathway fokusert mirnas ble profilert i 3D og 2D differensierte hNSCs sammenlignet med udifferensierte hNSCs. De mest signifikant nedregulert mirnas ble valgt ut og analysert for å vurdere deres antatte målet mRNA med den hensikt å bestemme deres funksjonalitet og biologisk tolkning ved hjelp av online tilgjengelige algoritmer (DIANA Lab, PicTar, og TargetScans).
En enkelt miRNA kan gjenkjenne hundrevis av mål og av denne grunn vi validert miRNA interaksjoner med 3 'UTR mRNAsthat kan være egnede kandidater i enxonal regulering. NR4A3, et mål av HSA-Mir-7, og Mir-17-familien, er medlem av NR4A familiens kjernereseptorer som, avhengig av deres nivå av uttrykk, er involvert i differensiering, overlevelse, apoptose og regulering av hippocampus axon veiledning 26. Tilsvar SOX5, et mål av HSA-Mir-96, er rapportert å kontrollere cellecyklusprogresjonen i nevrale stamceller 27 axon lengde 28, migrasjon, etter vandrende differensiering, og projeksjoner av nevroner 29. Både SOX5 og NR4A3 ble identifisert som et direkte mål mRNA av HSA-Mir-96, og henholdsvis HSA-Mir-7 og 17 av dual luciferase reporter analyser. Dual luciferase (Firefly og Renilla) er avhengig av to forskjellige reportergener på det samme plasmid, og gir et forbedret system som tillater normalisering av effekter forårsaket av suboptimal transfeksjon og cytotoksiske effekter sammenlignet med et enkelt plasmid luciferase-systemet. Som en del av analysen vår utvikling vi også optimalisert vår transfeksjon conditions for å oppnå god effekt.
Den protocolsdescribed her, kan utnyttes til å optimalisere og karakter in vitro hNSC differensiering som kan beimplemented intransplantation protokoller for pre-kliniske studier og fremtidige kliniske applikasjoner ytterligere.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner Julie Heward for å hjelpe i utarbeidelsen av hNSCs, og Lavaniya Thanabalasundaram for henne teknisk støtte med HeLa dyrkning og transfeksjon.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM:F12 | Invitrogen | 21331-020 | For RMM medium preparation |
Human Albumin Solution | Baxter health care limited | 1501052 | For RMM medium used at a final concentration of 0.03% |
Transferrin, Human recombinant | Sigma | T8158 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
Putrescine DiHCl | Sigma | P5780 | For RMM medium used at a final concentration of 16.2 µg/ml |
Insulin, Human recombinant | Sigma | I9278 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
Progesterone | Sigma | P6149 | For RMM medium used at a final concentration of 60 ng/ml |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-24 | For RMM medium used at a final concentration of 2 mM |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml |
bFGF | Peprotech | AF-100-15 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml |
EGF | Peprotech | AF-100-188 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml |
4-OHT | Sigma | H7904 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM |
Laminin | AMS Biotech | 3400-010-10 | |
TrypZean/EDTA | Lonza | BE02-034E | |
Water for irrigation | Baxter Healthcare | UKF7114 | |
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) | Invitrogen | R007-100 | |
Alvetex 12 well plate | Reinnervate Ltd | AVP002 | |
Ethanol | Merck | 1.00986.1000 | |
βIII tubulin antibody | Sigma | T8660 | |
Hoechst | Sigma | B2261 | |
miRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 | |
RNase free DNase | Qiagen | 79254 | |
Chloroform | Sigma | C7559-5VL | |
miScript II RT Kit | Qiagen | 218160 | |
SYBR green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array | Qiagen/ SABiosciences | MIHS-103Z | |
Lightcycler 480 white 96 plate | Roche | 4729692001 | |
Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT019538-MT0 | |
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT017632-MT01 | |
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). | Qiagen | 1027284 | MiRNA transfection control |
Luc-Pair miR Luciferase Assay | GeneCopeia | LPFR-M010 | |
Lightcycler 480 | Roche | ||
GloMax 96 microplate luminometer | Promega |