With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.
Neurala stamceller (NSCs) har förmåga att självförnyelse och differentiering till neuroner, astrocyter och oligodendrocyter under specifika lokala mikromiljöer. Här inne, presenterar vi en rad metoder som används för tredimensionell (3D) differentiering och miRNA analys av en klonal human neural stamcell (hNSC) linje, för närvarande i kliniska prövningar för stroke funktionshinder (NCT01151124 och NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs härleddes ur ett etiskt godkänd första trimestern human foster cortex och villkor förevigat med hjälp retroviral integrering av ett enda exemplar av c-mycER TAM konstruera. Vi beskriver hur man mäter axon process utväxt av hNSCs differentierade på 3D byggnadsställningar och hur man kvantifiera tillhörande förändringar i miRNA uttryck använder PCR array. Vidare exemplifierar vi beräkningsanalys i syfte att välja miRNA förmodade mål. SOX5 och NR4A3 identifierades som lämpliga miRNA förmodade målet utvalda betydligt nedreglerad miRNA i differentierad hNSC. Mirna målet validering utfördes på SOX5 och NR4A3 3'UTRs genom dubbel reporter plasmidtransfektion och dubbla luciferasanalys.
Stamcellsforskning spelar en central roll i regenerativ medicin, som också spänner disciplinerna vävnadsteknik, utvecklings cellbiologi, cellulära terapi, genterapi, och biomaterial (byggnadsställningar och matriser). Stamceller är viktiga i både organ developmentand vävnad reparera; förstå hur stamceller fungerar är avgörande för att utveckla nya stamcellsbaserade behandlingar en. CTX0E03 är en klonal, villkor förevigat neurala stamceller människa (hNSC) linje 2 isolerad från första trimestern human foster cortex. CTX0E03 har definierat kvalitetsegenskaper som är väsentliga för klinisk cellbank enligt god tillverkningssed (GMP) 3. HNSCs kan spontant differentiera till neuroner, Glia, och oligodendrocyter och har visat sig lindra neurologiska underskott när transplanterade i en gnagare modell av fokal ischemi 2,4,5. Den CTX0E03 hNSCs är för närvarande i kliniska prövningar för stroke disabillighet (NCT01151124 6 och NCT02117635, Clinicaltrials.gov).
MiRNA har en genomsnittlig 22 nukleotider långa och har visat reglerande molekyler 7, de inte kodar för proteiner, utan snarare binder 3 prime otranslaterad region (3'UTR) i mRNA, som reglerar deras stabilitet och översättning till protein. MiRNA rapporteras att delta i regleringen av ett antal cellulära processer, inklusive utveckling, proliferation och differentiering 8. Flera miRNA har varit inblandade i regleringen öde och specifikation av neurala stamceller 9.
I tvådimensionell (2D) standardkulturmiljön komplexiteten i in vivo miljön inte matchas, och följaktligen induktion och reglering av hNSC differentiering inte är optimal. In vivo celler omgivna av en tredimensionell (3D) mikromiljö bestående av andra celler och extracellulära ligander, däribland mångatyper av kollagener, laminin och andra matrixproteiner (extracellulär matrix, ECM). Tidigare studier har rapporterat att den arkitektoniska topografi materialen härma ECM och deras geometri påverkar cellfenotyp och öde 10-15. Ett antal kommersiellt tillgängliga 3D byggnadsställningar är tillgängliga; vi använde en mycket porös polystyren byggnadsställning konstruerad med en väldefinierad och enhetlig arkitektur i en 200 | im tjockt membran som ger en 3D-utrymme i vilket celler kan invadera och differentiera 16-18.
Häri 2D och 3D differentierings analyser används för att bedöma axonprocess utväxt. Dessutom beskriver vi en metod för att profilera miRNA uttryck för en klinisk kvalitet hNSC linje att närmare undersöka miRNA effekter på dess differentiering. Metoderna på här illustrerade är baserade på vad som tidigare beskrivits i 19.
Utvecklingen av nya in vitro-analyser för att utvärdera och förbättra differentiering av stamceller har alltid inneburit en utmaning för utredning av deras funktioner och terapeutiska möjligheter. Långsiktig och stabil infästning av hNSCs, som krävs för att utveckla en robust 3D i differentiering vitro, togs upp av att testa flera 3D substrat med olika egenskaper vad gäller material och strukturer. Som en del av analysutveckling vi också bedömt optimal cellsådd koncentration och identifierade kravet för byggnadsställningar som ska lamininbelagda. Även våra hNSCs spontant kan skilja på 4-OHT och tillväxtfaktor borttagning, genomförandet av en 3D odlingssystem visade en signifikant förbättring i deras differentiering förmåga mätt med Axon process utväxt jämfört med vanliga 2D differentierade hNSCs.
För att undersöka effekten av 3D inducerad differentiation på hNSC miRNA uttryck vi använde en PCR-array. Jämfört med standard chip microarray-PCR array erbjuder fördelarna med en direkt kvantifiering och validering av miRNA av intresse. Även PCR array är begränsad i tid av totala antalet miRNA per matris, till exempel i här mindre än 96, kan den anpassas till specifikt omfatta miRNA av intresse, i vårt fall som tidigare rapporterats i stamcellsutveckling. Uttrycket av pathway fokuserade miRNA var profilerade i 3D och 2D differentierade hNSCs jämfört med odifferentierade hNSCs. De mest markant nedregleras miRNA valdes ut och analyserats för att utvärdera sina förmodade målgrupp mRNA med avsikt att bestämma deras funktionalitet och biologisk tolkning använder nätet tillgängliga algoritmer (DIANA Lab, PicTar och TargetScans).
En enda miRNA kan känna igen hundratals mål och därför vi validerade miRNA interaktioner med 3 'UTR mRNAsthat kan vara lämpliga kandidater i ettxonal reglering. NR4A3, ett mål av HSA-MIR-7, och MIR-17 familjen, är medlem av NR4A familjen nukleära receptorer som, beroende på deras nivå av uttryck, är involverade i differentiering, överlevnad, apoptos och reglering av hippocampus axon vägledning 26. Likaså SOX5, ett mål av HSA-MIR-96, rapporteras att kontrollera cellcykelprogression hos neurala stamceller 27 Axon längd 28, migration, post vandrande differentiering, och projektioner av nervceller 29. Både SOX5 och NR4A3 identifierades som ett direkt mål mRNA av HSA-MIR-96, och HSA-MIR-7 respektive 17 av dubbla luciferas reporter analyser. Dubbla luciferas (Firefly och Renilla) åberopat två olika rapportgener i samma plasmid och erbjuder ett förbättrat system möjliggör normalisering för effekter orsakade av suboptimal transfektion och cytotoxiska effekter jämfört med en enda luciferas plasmid systemet. Som en del av vår analysutveckling vi optimerat också vår transfektion conditions för att erhålla hög verkningsgrad.
Den protocolsdescribed häri kan utnyttjas för att ytterligare optimera och karakterisera in vitro hNSC differentiering som kan beimplemented intransplantation protokoll för prekliniska studier och framtida kliniska tillämpningar.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner Julie Heward för att hjälpa i beredningen av hNSCs och Lavaniya Thanabalasundaram för hennes teknisk support med HeLa odling och transfektion.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM:F12 | Invitrogen | 21331-020 | For RMM medium preparation |
Human Albumin Solution | Baxter health care limited | 1501052 | For RMM medium used at a final concentration of 0.03% |
Transferrin, Human recombinant | Sigma | T8158 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
Putrescine DiHCl | Sigma | P5780 | For RMM medium used at a final concentration of 16.2 µg/ml |
Insulin, Human recombinant | Sigma | I9278 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
Progesterone | Sigma | P6149 | For RMM medium used at a final concentration of 60 ng/ml |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-24 | For RMM medium used at a final concentration of 2 mM |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml |
bFGF | Peprotech | AF-100-15 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml |
EGF | Peprotech | AF-100-188 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml |
4-OHT | Sigma | H7904 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM |
Laminin | AMS Biotech | 3400-010-10 | |
TrypZean/EDTA | Lonza | BE02-034E | |
Water for irrigation | Baxter Healthcare | UKF7114 | |
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) | Invitrogen | R007-100 | |
Alvetex 12 well plate | Reinnervate Ltd | AVP002 | |
Ethanol | Merck | 1.00986.1000 | |
βIII tubulin antibody | Sigma | T8660 | |
Hoechst | Sigma | B2261 | |
miRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 | |
RNase free DNase | Qiagen | 79254 | |
Chloroform | Sigma | C7559-5VL | |
miScript II RT Kit | Qiagen | 218160 | |
SYBR green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array | Qiagen/ SABiosciences | MIHS-103Z | |
Lightcycler 480 white 96 plate | Roche | 4729692001 | |
Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT019538-MT0 | |
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT017632-MT01 | |
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). | Qiagen | 1027284 | MiRNA transfection control |
Luc-Pair miR Luciferase Assay | GeneCopeia | LPFR-M010 | |
Lightcycler 480 | Roche | ||
GloMax 96 microplate luminometer | Promega |