With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.
Neurale stamceller (NSC) er i stand til selv-fornyelse og differentiering til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter under særlige lokale mikromiljøer. Herinde, præsenterer vi en række metoder til tredimensional (3D) differentiering og miRNA-analyse af en klonal humane neurale stamceller (hNSC) linje, der i øjeblikket i kliniske forsøg for slagtilfælde handicap (NCT01151124 og NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs blev afledt fra et etisk godkendt første trimester human føtal cortex og betinget udødeliggjort hjælp retroviral integration af en enkelt kopi af c-mycER TAM konstruere. Vi beskriver, hvordan man måler axon proces udvækst af hNSCs differentierede på 3D stilladser og hvordan at kvantificere tilhørende ændringer i miRNA-ekspression ved hjælp af PCR array. Derudover eksemplificerer vi beregningsanalyse med henblik på at udvælge miRNA formodede mål. SOX5 og NR4A3 blev identificeret som egnet miRNA formodede mål for udvalgte markant nedregulereU-miRNA i differentieret hNSC. Mirna målvalidering blev udført på SOX5 og NR4A3 3'UTRs ved dobbelt reporterplasmidet transfektion og dobbelt luciferaseassayet.
Stamcelleforskning spiller en central rolle i regenerativ medicin, som også strækker sig over disciplinerne tissue engineering, udviklingsmæssige cellebiologi, cellulære Therapeutics, genterapi og biomaterialer (stilladser og matricer). Stamceller er vigtige i både orgel udviklingog væv reparation; forstå, hvordan stamceller fungerer, er afgørende for at udvikle nye stamcelle baserede behandlinger 1. CTX0E03 er en klonal, betinget udødeliggjort human neural stamcelle (hNSC) linje 2 isoleret fra første trimester human føtal cortex. CTX0E03 har defineret kvalitetsegenskaber, der er afgørende for klinisk celle bank under god fremstillingspraksis (GMP) 3. HNSCs kan spontant differentiere til neuroner, glia, og oligodendrocytter og har vist sig at forbedre neurologiske underskud, når transplanteret i en gnaver-model af fokal iskæmi 2,4,5. Den CTX0E03 hNSCs er i øjeblikket i kliniske forsøg for slagtilfælde disability (NCT01151124 6 og NCT02117635, Clinicaltrials.gov).
MiRNA har en gennemsnitlig 22 nukleotider i længden og har vist regulatoriske molekyler 7, behøver de ikke koder for proteiner, men snarere binder 3 prime utranslaterede region (3'UTR) af mRNA'er, regulering deres stabilitet og translation i proteiner. MiRNA er rapporteret til at deltage i reguleringen af en række cellulære processer, herunder udvikling, proliferation og differentiering 8. Flere miRNA har været impliceret i reguleringen skæbne og specifikation af neurale stamceller 9.
I todimensionale (2D) standard kultur miljø kompleksiteten af in vivo miljø ikke matches, og dermed induktion og regulering af hNSC differentiering er ikke optimal. In vivo celler omgivet af en tredimensional (3D) mikromiljø komponeret af andre celler og ekstracellulære ligander, herunder mangetyper af collagener, laminin og andre matrixproteiner (ekstracellulær matrix, ECM). Tidligere undersøgelser har rapporteret, at den arkitektoniske topografi materialerne efterligner ECM'er og deres geometri indflydelse cellefænotype og skæbne 10-15. Et antal kommercielt tilgængelige 3D stilladser er til rådighed; brugte vi en meget porøs polystyren stillads manipuleret med en veldefineret og ensartet arkitektur til en 200 um tyk membran, som tilvejebringer et 3D-rum, i hvilket celler kan invadere og differentiere 16-18.
Heri 2D og 3D differentiering assays anvendes til at vurdere axonprocess udvækst. Desuden beskriver vi en metode til at profilere miRNA udtryk for en klinisk kvalitet hNSC linje for yderligere at undersøge miRNA virkninger på sin differentiering. Metoderne i her illustrerede, er baseret på dem, der oprindeligt er beskrevet i 19.
Udviklingen af nye in vitro assays til at vurdere og forbedre differentieringen af stamceller har altid været en udfordring for undersøgelse af deres funktioner og terapeutiske kapaciteter. Langsigtet og stabil fastgørelse af hNSCs, der kræves for at udvikle en robust 3D in vitro differentiering assay blev behandlet ved at teste flere 3D-substrater med forskellige karakteristika i sigt af materialer og konstruktioner. Som en del af analysen udvikling, vi også vurderet optimal celle seeding koncentration og identificerede kravet til stilladser skal laminin belagt. Selv om vores hNSCs spontant kan differentiere på 4-OHT og vækstfaktor fjernelse, gennemførelse af en 3D-dyrkningssystem viste en signifikant forbedring i deres differentiering kapacitet målt ved Axon proces udvækst i forhold til standard 2D differentieret hNSCs.
For at undersøge effekten af 3D induceret Forskelntiation på hNSC miRNA udtryk vi brugte en PCR array. Sammenlignet med standard chip microarray-PCR-antenne giver fordelene ved en direkte kvantificering og validering af miRNA af interesse. Selvom PCR array er begrænset på sigt af det samlede antal miRNA per array, for eksempel i her under 96, kan det være skræddersyet til specifikt omfatte miRNA af interesse, i vores tilfælde tidligere rapporteret i stamceller udvikling. Ekspressionen af pathway fokuseret miRNA blev profileret i 3D og 2D differentierede hNSCs sammenlignet med udifferentierede hNSCs. De mest markant ned-regulerede miRNA blev udvalgt og analyseret for at vurdere deres formodede target mRNA med den hensigt at bestemme deres funktionalitet og biologisk fortolkning ved hjælp af online tilgængelige algoritmer (DIANA Lab, PicTar og TargetScans).
En enkelt miRNA kan genkende hundredvis af mål og derfor vi validerede miRNA interaktioner med 3'UTR mRNAsthat kan være egnede kandidater i enxonal regulering. NR4A3, et mål for HSA-miR-7, og miR-17 familien, er medlem af NR4a familie nukleare receptorer, som, afhængigt af deres niveau af udtryk, der er involveret i differentiering, overlevelse, apoptose og regulering af hippocampus axon vejledning 26. Tilsvarende SOX5, et mål om HSA-miR-96, er rapporteret at styre cellecyklusprogression i neurale stamceller 27 Axon længde 28, migration, post-vandrende differentiering og fremskrivninger af neuroner 29. Både SOX5 og NR4A3 blev identificeret som et direkte mål mRNA af HSA-MIR-96, og HSA-MIR-7 og 17 ved dobbelt luciferase reporter assays. Dual luciferase (Firefly og Renilla) påberåbt sig to forskellige reportergener i samme plasmid og tilbyder et forbedret system tillader normalisering for virkninger forårsaget af suboptimal transfektion og cytotoksiske virkninger sammenlignet med en enkelt luciferase plasmid system. Som led i vores assay udvikling, vi også optimeret vores transfektion conditions for at opnå en høj effektivitet.
Den protocolsdescribed heri kan udnyttes til yderligere at optimere og karakterisere in vitro hNSC differentiering, som kan beimplemented intransplantation protokoller for prækliniske studier og fremtidige kliniske anvendelser.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender Julie Heward for at hjælpe i udarbejdelsen af hNSCs, og Lavaniya Thanabalasundaram for hendes teknisk support med HeLa dyrkning og transfektion.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM:F12 | Invitrogen | 21331-020 | For RMM medium preparation |
Human Albumin Solution | Baxter health care limited | 1501052 | For RMM medium used at a final concentration of 0.03% |
Transferrin, Human recombinant | Sigma | T8158 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
Putrescine DiHCl | Sigma | P5780 | For RMM medium used at a final concentration of 16.2 µg/ml |
Insulin, Human recombinant | Sigma | I9278 | For RMM medium used at a final concentration of 5 µg/ml |
Progesterone | Sigma | P6149 | For RMM medium used at a final concentration of 60 ng/ml |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-24 | For RMM medium used at a final concentration of 2 mM |
Sodium Selenite | Sigma | S9133 | For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml |
bFGF | Peprotech | AF-100-15 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml |
EGF | Peprotech | AF-100-188 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml |
4-OHT | Sigma | H7904 | To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM |
Laminin | AMS Biotech | 3400-010-10 | |
TrypZean/EDTA | Lonza | BE02-034E | |
Water for irrigation | Baxter Healthcare | UKF7114 | |
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20°C) | Invitrogen | R007-100 | |
Alvetex 12 well plate | Reinnervate Ltd | AVP002 | |
Ethanol | Merck | 1.00986.1000 | |
βIII tubulin antibody | Sigma | T8660 | |
Hoechst | Sigma | B2261 | |
miRNeasy mini kit | Qiagen | 217004 | |
RNase free DNase | Qiagen | 79254 | |
Chloroform | Sigma | C7559-5VL | |
miScript II RT Kit | Qiagen | 218160 | |
SYBR green PCR kit | Qiagen | 218073 | |
Cell Development & Differentiation miScript miRNA PCR Array | Qiagen/ SABiosciences | MIHS-103Z | |
Lightcycler 480 white 96 plate | Roche | 4729692001 | |
Lightcycler 480 sealing foil | Roche | 4729757001 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
Vector NR4A3 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT019538-MT0 | |
Vector SOX5 miRNA 3' UTR target clones | GeneCopeia | HmiT017632-MT01 | |
Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen). | Qiagen | 1027284 | MiRNA transfection control |
Luc-Pair miR Luciferase Assay | GeneCopeia | LPFR-M010 | |
Lightcycler 480 | Roche | ||
GloMax 96 microplate luminometer | Promega |