Heligmosomoides polygyrus er et mus nematode med kraftige immunmodulerende evner som tett ligner de av svært utbredt menneskelig helminth infeksjon. Her beskriver vi en protokoll for langvarig opprettholdelse av H. polygyrus livssyklus.
Heligmosomoides polygyrus (tidligere kjent som Nematospiroides dubius, og også referert til av noen som H. bakeri) er en gastrointestinal helminth som sysselsetter flere immunmodulerende mekanismer for å etablere kronisk infeksjon i mus og ligner utbredte menneskelige helminth infeksjoner. H. polygyrus har blitt studert i stor utstrekning innen helminth-avledet immunregulering og har blitt funnet å potent undertrykke eksperimentelle modeller av allergi og autoimmunitet (begge med aktiv infeksjon og isolerte utskilte produkter). Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen skisserer forvaltning av H. polygyrus livssyklus for konsistent produksjon av L3 larver, gjenvinning av voksne parasitter, og innsamling av sine excretory-sekretorisk produkter (HMS).
Heligmosomoides polygyrus er en naturlig murine gastrointestinal helminth som er nært knyttet til svært utbredte menneskelige nematode parasitter 1. I motsetning til andre nematoder modeller som Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus gående etablerer kronisk infeksjon i mus som en direkte følge av flere kraftige immunmodulerende mekanismer benytter det til å undertrykke vertens immunrespons 2.
H. polygyrus har en direkte livssyklus: infeksiøs L3 larvene blir inntatt av feco-oral overføring (eller administreres av oral sonde i laboratoriet innstillingen), hvorpå de vandrer til subserosal lag av tolvfingertarmen og encyst før retur til tarmlumen som voksne ormer omtrent åtte dager etter første infeksjon. Parring og eggproduksjon skjer ved dag 10, og det er mulig å høste voksne ormer for kultur og innsamling av ekskretorisk-sekretoriske produkter fra day 14 og utover tre. H. polygyrus interagerer med det kommensal mikroflora, med økt Lactobacilli stede i infiserte mottakelige mus 4-6, og økte nivåer av H. polygyrus infeksjon etter eksponering av mus til Lactobacilli 6.
Aktiv infeksjon med H. polygyrus er blitt vist å beskytte mot immunpatologi i mange dyremodeller av autoimmunitet 7-10, kolitt 11,12 og allergi 13-16. Det har derfor vært stor interesse for potensialet i Excretory-Sekretoriske molekyler fra denne parasitten ("HMS") til down-modulere patologi in vivo 17,18. Faktisk er beskyttende effekt sett etter behandling av mus med HMS-produkter 19 gjennom trasé som nå blir identifisert 18,20. Her beskriver vi en protokoll for pålitelig produksjon av Heligmosomoides polygyrus og utvinning av sine utskilt produktersom kan bli ytterligere anvendt i en rekke funksjonelle biokjemiske og immunologiske undersøkelser.
Livssyklusen til H. polygyrus fortsetter i en pålitelig konsekvent måte. Etter naturlig inntak eller oral føring av L3 larver på dag 0, cyster begynner å dannes under duodenal serosa etter dag 5, utvikler seg til larver moults og deretter dukker opp som voksne ormer i tarmlumen fra dag 10, kan egg sees i avføring fra dag 14 og granulomer er synlige på duodenal serosale overflate fra dag 21. Den protokoll som er beskrevet ovenfor (og sammenfattet i figur 6) gjør det mulig for high-throughput produksjon av H. polygyrus excretory-sekretorisk produkter (HMS), i tillegg til pålitelig gjenoppretting av levedyktig L3 larver for fremtidige eksperimentelle og livsløps infeksjoner.
H. polygyrus infeksjon har vist seg å være beskyttende i modeller av astma avhengig OVA eller Der p 1 (Husstøvmidd allergen) 14. Videre kan undertrykkelse av luftveisinflammasjon kan overføres med CD4 + CD25 + </sup> regulatoriske T-celler 14 eller CD19 + CD23 hi regulatoriske B-celler 24 fra ikke-sensitivisert, H. polygyrus -infected mus. I modeller av autoimmunitet, H. polygyrus-infeksjon har blitt vist å være undertrykkende i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) modell av multippel sklerose 9, og undertrykkelse kan overføres med enten CD4 + T-celler eller CD19 + B-celler fra infiserte mus 24.
Heligmosomoides polygyrus ekskresjonssystemer-sekretoriske produkter (HES) modulerer vertens immunrespons og undertrykke Th2-mediert inflammasjon av en rekke mekanismer (som er skissert på figur 7), inkludert: a) Inhibering av dendrittisk celle respons på stimulering 25, b) induksjon av CD4 + foxp3 + regulatoriske T-celler 18. og c) blokkering av IL-33 produksjon 20. HMS er blitt vist å være beskyttende når det administreres ent sensibilisering eller utfordring i OVA-alun modell av astma 19 og også når det gis intranasalt med Alternaria ekstrakt allergen 20, gjennom undertrykkelse av tidlig IL-33 release. Unngåelse av LPS kontaminasjon av HMS er ofte avgjørende for å lykkes med fremtidige immunologiske eksperimenter. I protokollen skissert her, de kritiske trinnene i å oppnå dette er å sikre at rusk inneholdt innenfor musselin poser av den Baermann Apparatus ikke går inn i siste HMS-forberedelse (se 2.10) og å sette av ES løsning fra den første 24-timers kultur (se 5.1).
Over de siste årene har HMS blitt grundig karakterisert ved proteomikk nivå med over 370 forskjellige proteiner identifisert 26,27. I tillegg har ES fra det fjerde stadium larver blitt utsatt for proteomikk analyse 28. Pågående arbeid har karakterisere de store sukkerkomponenter av HES, kjent for å være sterkt immunogent 3, og utskilt mikro RNSom det er innkapslet i 50-100 nm vesikler eller exosomes (Buck et al., Innsendt for publisering). Med etableringen av reproduserbare protokoller for innsamling av ES fra denne svært immunmodulerende parasitten, og med omfattende proteomikk data som identifiserer de molekylære komponenter av HMS, scenen er nå satt for identifikasjon og terapeutisk testing av enkeltmolekyler fra H. polygyrus som kan mediere viktige effekter på vertens immunsystem.
The authors have nothing to disclose.
The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Amicon concentrator | Millipore | 5112 | Model 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122 |
Hanks’ buffered salt solution | Sigma | H9394 | 500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en®ion=GB |
Penicillin streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | 100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063 |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081 |
Activated charcoal | Merck | 1.09624.0500 | 18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624 |
Glucose solution | Sigma | G8769 | 100 ml 45% solution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en®ion=GB |
Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | 50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon |
T25 Flasks | Sigma | CLS430639 | 25cm vented flask http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en®ion=GB |
Chromogenic LAL assay | Lonza | 50-647U | QCL-1000 assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx |
Gentamicin | Gibco | 15710-049 | 100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072 |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco | 11875093 | 500 ml; without L-glutamine http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093 |