Heligmosomoides polygyrus är en mus nematod med kraftfulla immunmoduler funktioner som liknar dem för högt utbrett mänskligt helmintinfektion. Här beskriver vi ett protokoll för det långsiktiga underhållet av H. polygyrus livscykel.
Heligmosomoides polygyrus (tidigare känt som Nematospiroides dubius, och även kallad av vissa som H. bakeri) är en gastrointestinal inälvsmask som sysselsätter flera immunmoduler mekanismer för att etablera kronisk infektion hos möss och liknar förhärskande mänskliga helmintinfektioner. H. polygyrus har studerats ingående inom inälvsmask-derived immunreglering och har visat sig kraftigt undertrycka experimentella modeller av allergi och autoimmunitet (båda med aktiv infektion och isolerade utsöndrade produkter). Det protokoll som beskrivs i detta dokument beskriver hanteringen av H. polygyrus livscykel för konsekvent produktion av L3 larver, återvinning av vuxna parasiter, och insamling av deras utsöndrings-sekretoriska produkter (HES).
Heligmosomoides polygyrus är en naturlig mus gastrointestinal inälvsmask som är nära besläktat med högt förhärskande humana nematod parasiter 1. I motsats till andra nematod modeller såsom Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus etablerar konsekvent kronisk infektion hos möss som ett direkt resultat av flera kraftfulla immunmodulermekanismer sysselsätter att undertrycka värdens immunsvar 2.
H. polygyrus har en direkt livscykel: smitt L3 larver har förtärts av FeCo-muntlig överföring (eller administreras genom oral sondmatning i laboratoriemiljö), varefter de flyttar till subserosal lagret av tolvfingertarmen och encyst innan han återvände till tarmlumen som vuxna maskar cirka åtta dagar efter första infektionen. Parning och äggproduktion sker dag 10 och det är möjligt att skörda vuxna maskar för kultur och insamling av utsöndrings-sekretoriska produkter från day 14 och framåt tre. H. polygyrus samverkar dessutom med kommensalism mikroflora, med ökad laktobaciller närvarande i infekterade mottagliga möss 4-6, och ökade nivåer av H. polygyrus infektion efter exponering av möss för laktobaciller 6.
Aktiv infektion med H. polygyrus har visat sig skydda mot immunopatologi i många djurmodeller för autoimmunitet 7-10, kolit 11,12 och allergi 13-16. Det har därför varit stort intresse för de möjligheter som Uttagsklemmor-Sekretoriska molekyler från denna parasit ("HES") till ner-modulera patologi in vivo 17,18. Faktum är skyddande effekter ses efter behandling av möss med HES-produkter 19 genom vägar som nu identifierats 18,20. Här beskriver vi ett protokoll för tillförlitlig produktion av Heligmosomoides polygyrus och återvinning av dess utsöndrade produktersom kan utnyttjas ytterligare för en rad funktionella biokemiska och immunologiska undersökningar.
Livscykeln för H. polygyrus skrider i ett tillförlitligt konsekvent sätt. Efter naturligt intag eller oral sondmatning av L3 larver på dag 0, cystor börjar bildas under duodenal serosa dag 5, utvecklas till larver moults och sedan fram som vuxna maskar i tarmlumen från dag 10, kan ägg ses i avföring från dag 14 och granulom är synliga på duodenal serosala ytan från dag 21. Protokollet som beskrivs ovan (och sammanfattas i figur 6) tillåter hög genomströmning produktion av H. polygyrus exkretoriska-sekretoriska produkter (HES), utöver tillförlitlig återvinning av livskraftig L3 larver för framtida experimentella och livscykel infektioner.
H. polygyrus infektion har visat sig vara skyddande i modeller av astma beroende OVA eller Der p 1 (Hus husdammskvalsterallergen) 14. Dessutom kunde undertryckande av luftvägsinflammation överföras med CD4 + CD25 + </sup> regulatoriska T-celler 14 eller CD19 + CD23 hi regulatoriska B-celler 24 från icke-sensibiliserade, H. polygyrus infekterade möss. I modeller av autoimmunitet, H. polygyrus infektionen har visats vara suppressiv i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) modell för multipel skleros 9, och undertryckande kan överföras med antingen CD4 + T-celler eller CD19 + B-celler från infekterade möss 24.
Heligmosomoides polygyrus exkretoriska-sekretoriska produkter (HES) modulera värdens immunsvar och undertrycka Th2-medierad inflammation av ett antal mekanismer (som beskrivs i figur 7), inklusive: a) Hämning av dendritiska celler lyhördhet för stimulering 25, b) induktion av CD4 + Foxp3 + regulatoriska T-celler 18. och c) blockad av IL-33 produktion 20. HES har visat sig vara skyddande när det administreras ent sensibilisering eller utmaning i OVA-alum modell av astma 19 och även när de administreras intranasalt med Altern extrakt allergen 20, genom undertryckande av tidiga IL-33 release. Undvikande av LPS förorening av HES är ofta avgörande för att lyckas med framtida immunologiska experiment. I det protokoll som beskrivs här, de kritiska stegen i att uppnå detta är att se till att skräp som finns i de muslin påsar i Baermann Apparatus inte kommer in i sista HES beredningen (se 2.10) och att avsätta ES-lösning från första 24 h av kultur (se 5.1).
Under de senaste åren har HES noggrant karakteriseras på proteomic nivå med över 370 olika proteiner identifierats 26,27. Dessutom har ES från den 4: e larvstadiet utsatts för proteomik analys 28. Pågående arbete ingår karakterisera de stora glycan komponenterna i HES, kända för att vara starkt immunogent 3, och utsöndras mikro RNEftersom det är inkapslade i 50-100 nm vesiklar eller exosomes (Buck et al., Som lämnats in för publicering). Med etableringen av reproducerbara protokoll för insamling av ES från denna mycket immunmoduler parasit, och med omfattande proteomik uppgifter som identifierar de molekylära komponenterna i HES, är scenen nu inställd för identifiering och terapeutiska testning av enskilda molekyler från H. polygyrus som kan mediera centrala effekter på värdens immunsystem.
The authors have nothing to disclose.
The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Amicon concentrator | Millipore | 5112 | Model 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122 |
Hanks’ buffered salt solution | Sigma | H9394 | 500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en®ion=GB |
Penicillin streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | 100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063 |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081 |
Activated charcoal | Merck | 1.09624.0500 | 18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624 |
Glucose solution | Sigma | G8769 | 100 ml 45% solution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en®ion=GB |
Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | 50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon |
T25 Flasks | Sigma | CLS430639 | 25cm vented flask http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en®ion=GB |
Chromogenic LAL assay | Lonza | 50-647U | QCL-1000 assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx |
Gentamicin | Gibco | 15710-049 | 100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072 |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco | 11875093 | 500 ml; without L-glutamine http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093 |