Heligmosomoides polygyrus er en muse nematode med magtfulde immunmodulerende kapaciteter, som svarer bedre til dem af meget udbredt menneskelig helminth-infektion. Her beskriver vi en protokol til vedligeholdelse af H. langsigtet polygyrus livscyklus.
Heligmosomoides polygyrus (tidligere kendt som Nematospiroides dubius, og også nævnt af nogle som H. Bakeri) er en gastrointestinal helminth, der beskæftiger flere immunmodulerende mekanismer til at etablere kronisk infektion i mus og ligner fremherskende humane helminthinfektioner. H. polygyrus blevet omfattende undersøgt med hensyn til helminth-afledte immune regulering og er blevet fundet at kraftigt undertrykke eksperimentelle modeller af allergi og autoimmunitet (begge med aktiv infektion og isolerede udskilte produkter). Beskrevet i dette papir protokol beskriver styring af H. polygyrus livscyklus for ensartet produktion af L3 larver, genvinding af voksne parasitter, og indsamling af deres ekskretionsorganerne-sekretoriske produkter (HES).
Heligmosomoides polygyrus er en naturlig murine gastrointestinal helminth der er nært beslægtet med højt fremherskende humane nematode parasitter 1. I modsætning til andre nematoder modeller som Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus konsekvent etablerer kronisk infektion i mus som et direkte resultat af flere magtfulde immunmodulerende mekanismer den beskæftiger at undertrykke værtens immunrespons 2.
H. polygyrus har en direkte livscyklus: infektiøse L3 larver indtages af FeCO-oral transmission (eller administreres af oral sonde i indstillingen laboratorium), hvorefter de vandrer til subserosal lag af duodenum og encyst før han vendte tilbage til tarmlumen som voksne orme cirka otte dage efter indledende infektion. Parring og ægproduktion sker ved dag 10, og det er muligt at høste voksne orme for kultur og indsamling af ekskretionsorganerne-sekretoriske produkter fra day 14 og fremefter 3. H. polygyrus også interagerer med kommensal mikroflora, med øget Lactobacilli stede i inficerede modtagelige mus 4-6 og øgede niveauer af H. polygyrus infektion efter eksponering af mus til Lactobacilli 6.
Aktiv infektion med H. polygyrus har vist sig at beskytte mod immunpatologi i mange dyremodeller for autoimmunitet 7-10, colitis 11,12 og allergi 13-16. Der har derfor været stor interesse for mulighederne i Ekskretionsorganerne-Sekretoriske molekyler fra denne parasit ("HES") til ned-modulere patologi in vivo 17,18. Faktisk er beskyttende virkninger ses efter behandling af mus med HES-produkter 19 gennem veje som nu identificeret 18,20. Her beskriver vi en protokol for pålidelig produktion af Heligmosomoides polygyrus og inddrivelse af sine udskilte produkterder kan yderligere anvendes til en række af funktionelle biokemiske og immunologiske undersøgelser.
Livscyklus H. polygyrus provenuet i et pålideligt konsekvent. Efter naturlig indtagelse eller oral sonde af L3 larver på dag 0, cyster begynder at danne under duodenal serosa ved dag 5, udvikler sig til larver fælder og så fremstår som voksne orme i tarmen lumen fra dag 10, kan æg ses i afføring fra dag 14 og granulomer er synlige på den duodenale serøse overflade fra dag 21. Den ovenfor beskrevne (og opsummeret i figur 6) protokol giver mulighed for high-throughput produktion af H. polygyrus ekskretionsorganerne-sekretoriske produkter (HES), foruden pålidelig inddrivelse af levedygtige L3 larver for fremtidige forsøg og livscyklus infektioner.
H. polygyrus infektion har vist sig at være beskyttende i modeller for astma afhængige OVA eller Der p 1 (husstøvmideallergen) 14. Endvidere kunne undertrykkelse af luftvejsinflammation overføres med CD4 + CD25 + </sup> regulatoriske T-celler 14 eller CD19 + CD23 hi regulatoriske B-celler 24 fra ikke-lysfølsomme, H. polygyrus inficerede mus. I modeller af autoimmunitet, H. polygyrus infektion har vist sig at være undertrykkende i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) model for dissemineret sklerose 9 og undertrykkelse kan overføres med enten CD4 + T-celler eller CD19 + B-celler fra inficerede mus 24.
Heligmosomoides polygyrus udskillelsesvej-sekretorisk produkter (HES) modulere værtens immunrespons og undertrykke Th2-medieret inflammation af en række mekanismer (beskrevet i figur 7), herunder: a) Inhibering af dendritisk celle respons på stimulering 25, b) induktion af CD4 + Foxp3 + regulatoriske T-celler 18. og c) blokade af IL-33 produktion 20. HES har vist sig at være beskyttende, når de indgives ent sensibilisering eller udfordring i OVA-alun astmamodel 19 og også, når det indgives intranasalt med Alternaria ekstrakt allergen 20 gennem suppression af tidlig IL-33 release. Undgåelse af LPS forurening af HES er ofte afgørende for succes i fremtidige immunologiske eksperimenter. I protokollen beskrevet her, de kritiske trin i at opnå dette er at sikre, at affald indeholdt i musselin sække af Baermann apparatet ikke komme ind i sidste HES forberedelse (se 2.10), og at afsætte ES løsning fra de første 24 timer af kultur (se 5.1).
I de seneste år har HES blevet grundigt karakteriseret ved proteomisk niveau med over 370 forskellige proteiner identificeret 26,27. Desuden har ES fra 4. stadie larver blevet underkastet proteomanalyse 28. Igangværende arbejde omfatter karakterisering af store glycan komponenter HES, der vides at være stærkt immunogene 3 og udskilles mikro-RNDa der er indkapslet i 50-100 nm vesikler eller exosomer (Buck et al., Der er indsendt til publikation). Med etableringen af reproducerbare protokoller for indsamling af ES fra denne meget immunmodulerende parasit, og med omfattende proteomiske data, der identificerer de molekylære komponenter i HES, er scenen nu indstillet til identifikation og terapeutiske test af individuelle molekyler fra H. polygyrus der kan mediere vigtige virkninger på værtens immunsystem.
The authors have nothing to disclose.
The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Amicon concentrator | Millipore | 5112 | Model 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122 |
Hanks’ buffered salt solution | Sigma | H9394 | 500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en®ion=GB |
Penicillin streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | 100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063 |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081 |
Activated charcoal | Merck | 1.09624.0500 | 18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624 |
Glucose solution | Sigma | G8769 | 100 ml 45% solution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en®ion=GB |
Falcon tubes | Sarstedt | 62.547.254 | 50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon |
T25 Flasks | Sigma | CLS430639 | 25cm vented flask http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en®ion=GB |
Chromogenic LAL assay | Lonza | 50-647U | QCL-1000 assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx |
Gentamicin | Gibco | 15710-049 | 100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072 |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco | 11875093 | 500 ml; without L-glutamine http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093 |