Abstract
Den kalsineurinhemmerindusert takrolimus er hjørnesteinen i de fleste immunsuppressive behandlingsprotokoller etter solid organtransplantasjon i USA. Takrolimus er et smalt terapeutisk legemiddel og som sådan krever terapeutisk legemiddelmonitorering og dosejustering basert på sine fullblod bunnkonsentrasjoner. For å lette hjem terapeutisk legemiddel og etterlevelse overvåking, er samlingen av tørket blod flekker et attraktivt konsept. Etter en finger stick, samler pasienten en bloddråpe på filterpapiret hjemme. Etter at blodet er tørket, blir det sendt til analyselaboratoriet hvor takrolimus blir kvantifisert ved hjelp av væskekromatografi tandem-massespektrometri (HPLC-MS / MS) i kombinasjon med en enkel manuell protein utfellingstrinnet og nettet kolonne ekstraksjon.
For tacrolimus analyse, blir en 6 mm plate utstanset fra den mettede midten av blod sted. Blodet spot er homogenisert ved hjelp av en kule blender ennd deretter proteiner blir utfelt med metanol / 0,2 M ZnSO4 inneholdende indre standard D-2, 13 c-takrolimus. Etter virvling og sentrifugering, blir 100 ul av supernatanten injiseres i et elektronisk ekstraksjonskolonne og vasket med 5 ml / min på 0,1 maursyre / acetonitril (7: 3, v: v) i 1 min. Heretter er omstillingsventilen aktiveres og analyttene blir tilbake spylt på analytisk kolonne (og separert ved anvendelse av en 0,1% maursyre / acetonitril-gradient). Tacrolimus kvantifiseres i den positive reaksjonen multimodus (MRM) ved hjelp av en tandem-massespektrometer.
Analysen er lineær fra 1 til 50 ng / ml. Inter-assay variasjon (3,6% -6,1%) og nøyaktighet (91,7% -101,6%) som vurderes over 20 dager møtes akseptkriterier. Gjennomsnittlig utvinning utvinning er 95,5%. Det er ingen relevant carry-over, matrise forstyrrelser og matrix effekter. Tacrolimus er stabil i tørket blod flekker på RT og ved 4 ° C i 1 uke. Hentet prøver iautosampler er stabile ved 4 ° C i minst 72 timer.
Introduction
Takrolimus er et potent immonosuppressant 1-7 som har et makrolid struktur 8 (figur 1). På grunn av cis - trans-isomeri av CN bindinger den danner to rotamerer i oppløsningen 9 som kan separeres ved revers fase høy-ytelse væskekromatografi (HPLC) Tacrolimus er lipofilt og oppløselig i alkoholer (metanol: 653 g / l, etanol: 355 g / L), halogenerte hydrokarboner (kloroform: 573 g / l) og eter. Det er tungt oppløselige i alifatiske hydrokarboner (heksan: 0,1 g / l og vann (pH 3.: 0,0047 g / l) 9 Molekylet inneholder ikke kromofor og dens UV-absorpsjonsmaksimum er 192 nm Takrolimus virker via inhibering av calcineurin. . Virkningsmekanismen er blitt anmeldt i referanser 10,11. Det brukes i dag i mer enn 80% av solid-organtransplanterte pasienter i USA 12.
Den terapeutiske indeks av takrolimus er considered å være smal 13. I tillegg er korrelasjonen mellom takrolimusdosen og blodkonsentrasjonene dårlig og farmakokinetikk er variabel 14,15. Terapeutisk legemiddelmonitorering å veilede takrolimus dosering hos transplantasjonspasienter er derfor generell klinisk praksis 16-20. Målet er å holde takrolimus blodkonsentrasjoner innenfor et forhåndsdefinert terapeutisk område. Konsentrasjoner Tacrolimus blod under det terapeutiske området kan føre til økt aktivitet av kroniske eller akutte allo-immune reaksjoner, mens konsentrasjoner over det terapeutiske vinduet øke risikoen for over immunsuppresjon, kreft og toksisitet, slik som nefrotoksisitet, nevrotoksisitet, høyt blodtrykk og diabetes. Høy farmakokinetisk intraindividuelle variasjon av takrolimus kan være skadelig for både transplantasjon orgel og pasient overlevelse 21,22. Mens inter-individuell variasjon av takrolimuskonsentrasjonen farmakokinetikk er hovedsakelig forårsaket av CYP3A5 polymorfismer, årsaker til intra-individuellvariabilitet inkluderer, men er ikke begrenset til, legemiddel, sykdoms narkotika og mat-legemiddelinteraksjoner 14,15. Også mangel på etterlevelse av immunsuppressive terapeutisk legemiddel regime er en medvirkende faktor, og en viktig årsak til graft tap 23,24.
Disse hensyn tilsier at hyppig hjem terapeutisk legemiddel og etterlevelse overvåking av takrolimuskonsentrasjonen i fullblod kan være gunstig for å sikre at pasientene har takrolimuseksponeringen innenfor den ønskede terapeutiske vinduet til alle tider. Men logistikken og kostnadene ved hyppigere terapeutisk overvåkning som det er dagens kliniske praksis 15 er uoverkommelige. En av grunnene er at pasienten må vise en phlebotomist for å ha den nødvendige venøs blodprøve trukket. Tørket blod flekker har nylig dukket opp som et attraktivt konsept 25-28. Etter en enkel finger stikke pasienten samler en bloddråpe på et spesielt filter papir kort og etter blod flekk har dried, kan den bli sendt til et sentralt laboratorium for analyse av takrolimus og andre immunsuppressive legemidler at pasienten kan nå ta. Dette har blitt mulig på grunn av utviklingen av svært sensitive og spesifikke LC-MS / MS-analyser for kvantifisering av takrolimus og andre immunsuppressive midler i meget små blodmengder for eksempel tørket blodflekker (typisk 20 mikroliter blod) 25,29-43. En annen fordel er at minimalt invasive, lave volum prøveinnsamlingsstrategier som tørket blod flekker i stor grad forenkle terapeutisk overvåkning og farmakokinetiske studier hos små barn 28.
Tacrolimus måles vanligvis i venøst fullblod 15 EDTA. Årsakene er at takrolimus omfattende distribueres inn i blodceller, og at kliniske studier har rapportert bedre sammenheng mellom bunnkonsentrasjoner i blodet enn i plasma med kliniske hendelser 15,18. Til sammenligning, analyse av TAcrolimus i tørket blodflekker er basert på kapillær blod som er blandet med filterpapiret matrisen. Dette gir utfordringer i forhold til oppløsningen av takrolimus og potensielle forstyrrelser med LC-MS / MS-analyse. Her presenterer vi et etablert og validert målemetode basert på homogenisering av tørket blod stedet ved hjelp av en kule blender sammen en high-flow online kolonne prøve rydde opp prosedyre og LC-MS / MS-analyse med. Per i dag har denne analysen med hell blitt brukt for kvantifisering av mer enn fem tusen takrolimuspasienter tørket blod stikkprøver for etterlevelse overvåking i kliniske studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De identifiserte blodprøver fra friske personer var fra University of Colorado Hospital (Aurora, Colorado). Bruken av avidentifiserte blod bank prøver for valideringsstudier samt for utarbeidelse av kalibratorer og kvalitetskontroll prøver ble ansett som "fritatt" av Colorado Multi-institusjonelle Review Board (COMIRB, Aurora, Colorado).
1. Utarbeidelse av referanser og løsninger
- Kjøp takrolimus og intern standard D 2, 13 C-takrolimus fra leverandørene oppført i Materials List.
- Forbered stamløsninger i ren metanol ved en konsentrasjon på 1 mg / ml til takrolimus og en konsentrasjon på 10 ug / ml for D2, 13 C-takrolimus. Gjør stamløsninger av referansemateriale basert på tre uavhengige vekter. Alikvote stamløsninger og oppbevares ved -70 ° C eller lavere.
- Forbered løsning for å felle ut proteineneog trekke ut tacrolimus ved bruk av metanol / 0,2 M ZnSO4 i vann (7: 3, v: v). Denne løsningen inneholder også interne standard D-2, 13 c-tacrolimus ved en konsentrasjon på 2,5 ng / ml og anvendt for ekstraksjon av alle prøvene unntatt for utvinning av blanke prøver (se 1.3.3).
- Forbered denne proteinutfelling løsning nystekte på hver ekstraksjon dag og sette utløpet av løsningen på 12 timer.
- Fremstilling av kalibreringskurve og kvalitetskontroll (QC) prøver
- Forbered stamløsninger av takrolimus ved å utføre hensiktsmessige fortynninger av stamløsningen ved bruk av ren metanol.
- For å fremstille kalibratorer og kontrollprøver kvalitet, pigg 20 ul av passende fortynnet lagerløsning i EDTA-fullblod, Inkuber ved 37 ° C under forsiktig rysting i et vannbad for å tillate homogen fordeling av takrolimus i de cellulære blodkomponenter til 20 min og aliquot til 1,5 ml polyppropylene rør med konisk bunn og snap-on lokk. Sørge for at den relative volumet av organisk oppløsningsmiddel ikke overstiger 5%.
- Spot 50 mL av piggete fullblod i midten av hver sirkel på filterkort med en pipette.
- Tørk blod flekker på filterkort ved RT i 3 timer.
- Forbered standarder takrolimus kalibrerings i humant EDTA-fullblod ved takrolimus i konsentrasjoner på 1, 2,5, 5, 10, 25, og 50 ng / ml. Tilbered en blindprøve for ekstraksjon som kalibreringsstandardene med proteinutfelling oppløsningen inneholdende indre standard D-2, 13 c-tacrolimus ("sample zero").
- Forbered prøvene QC i humant EDTA-fullblod i konsentrasjoner på 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Forbered en blindprøve. I motsetning til de QC prøver som ble ekstrahert med utfelling inneholdende indre standard D-2, 13 c-tacrolimus, ekstrahere denne blindprøve med proteinutfelling løsning som gjørikke inneholde intern standard D-2, 13 c-tacrolimus ("blindprøve").
- Innsamling av kliniske prøver
- Samle tørket blod flekker som beskrevet i 43,44.
2. Utvinning av Tacrolimus tørket blod Spot Samples
- Inspiser tørket blod flekk å sikre akseptabel prøve kvalitet og volum 45.
- Punch midten av blod flekk på filteret kortet med en 6 mm hull punch.
Merk: Kvaliteten av slag kan overvåkes ved veiing. En stemplet mettet filter plate veier i gjennomsnitt 5,02 mg ± 0,09 mg (område: 4.83- 5.14 mg, n = 12). - Plasser plater i 1,5 ml polypropylen rør med konisk bunn og snap-on lokk.
- Legg 20-30 kuler i hvert rør.
- Legg 500 mL av proteinutfelling oppløsning (metanol: 0,2 M ZnSO4, 7: 3, volum: volum med 2,5 ng / ml intern standard) i hvert rør. For extrvirkningen av blanke prøver, bruker proteinutfelling løsning uten den interne standarden.
- Homogen skivene i bullet blender i 1 min (maks hastighet, sette "10").
- Rist prøver ved RT på multi-virvelrøret (maksimal hastighet, innstilling "10") i 10 min.
- Sentrifuger prøvene ved 16 000 xg og 4 ° C i 10 min.
- Overfør supernatanten til glassampuller HPLC utstyrt med en 300 pl innsats. Bruk pre-slit Teflon pakninger.
Note: Ekstrahert prøvene kan lagres ved -20 ° C eller lavere inntil LC-MS / MS-analyse.
3. LC-MS / MS-analyse
- Belastnings 100 ul av supernatanten fra den ekstraherte prøven ut på C8 patronen ekstraksjonskolonnen og vaskes med en 7: 3-forhold på 0,1% maursyre i vann: acetonitril ved en strømningshastighet på 5 ml / min i 1 min. Tilkoblingene til omstillingsventilen er vist i figur 2 og gradienten drives av ekstraksjon pumpen i tabell 1
- Heretter aktivere veksling ventil som resulterer i back-flush av analyttene fra pre-kolonnen på den analytiske kolonnen.
- Termostat kolonnen til 65 ° C angitt.
- Eluering av analytter fra analytisk kolonne ved bruk av strømningshastigheter og gradient er vist i tabell 1.
- Koble den analytiske kolonnen i et tandem-massespektrometer via turboelektrospray ionisering-kilde. Juster viktigste parameterne for massespektrometeret ifølge tabell 2.
- Detektere positive ioner ([M + Na] +) i den multiple reaksjonsmetoden (MRM). Bruk følgende ion overganger for kvantifisering: takrolimus: m / z (masse / kostnad) = 826,6 → 616,2 og D 2, 13 C-takrolimus: m / z = 829,6 → 619,2.
Merk: Den totale kjøretid er 4,6 min.
4. Kvantifisering
- For hvert løp, generere en kalibreringskurve basert på kalibratorene utarbeidet i 1.3.5 oginkludere i hver analyse løp.
- Generere en kalibreringskurve ved å avsette nominelle konsentrasjoner versus responsfaktor av analytt (toppareal [Analytt] / toppareal [indre standard]) ved hjelp av massespektrometer-programvaren.
- Monter kalibratorer bruker en kvadratisk form i kombinasjon med 1 / X vekting.
- Til kvantitet takrolimus i tørket blod flekker integrere takrolimus og intern standard toppene i de utpakkede MRM kromatogrammene. Beregn responsfaktor for takrolimus (Peak-området [Analytt] / Peak-området [intern standard]) og sammenligne med kalibreringskurven ved hjelp av massespektrometri programvare.
5. valideringsprosedyrer
- Nedre deteksjonsgrense (LLOD) og nedre grense for kvantifisering (LLOQ).
- Betrakt den laveste takrolimus konsentrasjon med en topp-til-støy-forhold på 4: 1 som den nedre deteksjonsgrense (LLOD). Definerer den nedre grense for kvantifisering (LLOQ) somlaveste konsentrasjon av kalibreringskurven med en nøyaktighet som er lik eller bedre enn ± 20% avvik fra den nominelle konsentrasjon og presisjon som er lik eller bedre enn 20% (koeffisient av varians).
- Intra- og inter-dagers nøyaktighet og presiseringer.
- Test nøyaktighet og presisjon på fire konsentrasjoner av 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) og 40 ng / ml (QC4).
- Forbered QC prøvene på hver validering dag i menneskelig EDTA fullblod, tørr på filterkort, ekstrakt, og analysere som beskrevet ovenfor.
- Bestem intra-dag nøyaktighet og presisjon med 6 prøver per QC konsentrasjonsnivå.
- Vurdere inter-dag nøyaktighet og presisjon i løpet av 20 dager. Måle hver QC nivå med 4 prøver hver dag.
- Analyser to kalibreringskurver sammen med de QC prøvene på hver dag.
- Beregn intra-dag nøyaktighet som% av den nominelle konsentrasjonen (seks prøver per konsentrasjonsnivå, se 5.2.2). CalcUlate presisjon som koeffisienten av varians (CV%).
- Tenk intradag nøyaktighet akseptabelt hvis det faller inn aksept begrenser 85% til 115% av den nominelle konsentrasjonen. Betrakt intra-dagers presisjon akseptabel hvis den er lik eller bedre enn en CV (koeffisient av varians) på 15%.
- Beregn inter-dagers nøyaktighet og presisjon som gjennomsnitt for hvert konsentrasjonsnivå QC analysert i løpet av de 20 validerings dager.
- Tenk gjennomsnittlig inter-dag nøyaktighet akseptabelt hvis det faller inn aksept begrenser 85% til 115% av den nominelle konsentrasjonen. Betrakt inter-dagers presisjon akseptabel hvis den er lik eller bedre enn en CV (koeffisient av varians) på 15%.
- Utelukkelse av matrix forstyrrelser.
- For å utelukke forstyrrelser som kan være forårsaket av matrise signaler, analysere tomme tørket blod flekker (8 forskjellige individer, fortrinnsvis 4 hanner og 4 kvinner).
- Inspiser ionekromatogrammer. Hvis topper innen retensjonstidvindu av takrolimus blir oppdaget, integrere og sammenligne sine områder under kurven med de av takrolimuskonsentrasjonen toppene i tomme prøvene tilsatt takrolimus på LLOQ. Arealet av toppene i de tomme prøvene er ikke ment å overstige 15% av de av takrolimus på LLOQ.
- Ion undertrykkelse / ion ekstrautstyr.
- Bruk en post-kolonne infusjon protokoll som beskrevet 45 for å vurdere eventuelle forstyrrelser av ion undertrykkelse / ion forbedringen skyldes co-eluering matrikskomponenter.
- Tilfører takrolimus i en konsentrasjon på 10 ug / ml oppløst i 0,1% maursyre: metanol (30:70, v / v) post-kolonne med en hastighet på 10 mL / min.
- Koble en sprøytepumpe via T-stykket mellom analytisk kolonne og elektrospray kilde massespektrometer.
- Overvåke MS / MS-signalintensiteten av MRM overganger for takrolimus og den indre standard (m / z = 826,6 → og 616,2 m / z = 829,6 → 619,2) etter injeksjon av extracted tomme prøver (n = 8 prøver fra ulike individer).
Merk: I fravær av ion undertrykkelse / ion forbedringen det kontinuerlige signal forårsaket ved infusjon av analyttene ikke skal påvirkes ved injeksjon av emnet matrisen, samtidig som ion undertrykkelse bevirker en dip av signalet og ion forbedring en topp.
- Bære over.
- Vurdere potensialet carry-over ved å analysere hentet tomme prøver etter de høyeste kalibratorer (50 ng / ml, n = 6).
- Inspiser ionekromatogrammer. Hvis toppene innenfor oppholdstid vindu av takrolimus blir oppdaget, integrere og sammenligne sine områder under kurven med de av takrolimuskonsentrasjonen toppene i tomme prøvene tilsatt takrolimus på LLOQ. Arealet av toppene i de tomme prøvene er ikke ment å overstige 15% av de av takrolimus på LLOQ.
- Utvinnings inngang.
- Bestemme gjenvinninger ved å sammenligne signalene fra analyttene etter ekstraksjon av QC samsipper på alle fire konsentrasjonsnivåer (n = 6 per konsentrasjon) med de av tomme tørket blod flekker spiked med tilsvarende mengder av takrolimus etter utvinning.
- Forbered fire sett av QCs (konsentrasjonsnivåer: 2, 4, 20, 40 ng / ml).
- Tilbered en annen 4 sett av tilsvarende "recovery" testprøver ved å fange opp 50 ul blank EDTA fullblod på filterpapiret kortene og tørking i 2 timer.
- Heretter, for både KS og tomme "recovery stikkprøvene", kuttet ut hele blod flekk på filteret kort med saks og plasser de resulterende plater i en polypropylen rør med konisk bunn og snap-on lokk.
- Pakk alle prøvene.
- Overfør supernatanten (400 mikroliter) i glass HPLC hetteglass.
- Legg takrolimus stamløsning til de tomme "ekstrahert" recovery testprøver for å nå konsentrasjoner på 2, 4, 20 og 40 ng / ml (4 ul 200, 400, 2000, 4000 ng / ml tacrolimus lager solutions til 400 mL av supernatant).
- Etter LC-MS / MS-analyse, sammenligner signalene i begge QC prøver og testprøver "recovery" av den tilsvarende konsentrasjon (% = gjenvinning av signalsampler tilsatt før ekstraksjon / signalsampler tilsatt etter ekstraksjon x 100).
- Fortynning integritet.
- Etablere fortynning integritet ved hjelp av prøvene tilsatt analyttene på 500, 250 og 100 ng / ml.
- Etter ekstraksjon, fortynnes prøver ved hjelp proteinutfelling løsning (01:10, n = 3 per konsentrasjonsnivå).
- Beregne avvik fra de nominelle konsentrasjoner. Vurdere resultatene som faller innenfor 85% -115% av nominell akseptabelt.
- Stabiliteter.
- Undersøke stabiliteter ved hjelp av QC prøvene ved alle fire konsentrasjonsnivåer (n = 4 pr konsentrasjon) analysert ved forskjellige tidspunkter og under forskjellige lagringsbetingelser.
- Sammenligne resultater etter lagring med pålydende verdier. Tenk rESULTATER som faller innenfor 85% -115% av nominell akseptabelt.
- Etablere prøven stabilitet i 1 uke ved omgivelsestemperatur, en uke ved 4 ° C, 1 måned ved -20 ° C og en måned ved -80 ° C.
- Test fryse-tine-stabilitet over tre sykluser (-20 ° C). Test ekstraheres prøven og autosampler stabilitet ved å plassere prøvene i det termostat prøvetageren justert til 4 ° C. Injisere prøver etter 72 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representative ionekromatogrammer av en blindprøve ble en prøve tilsatt ved den nedre grense for kvantifisering og en pasientprøve er vist i figur 3.
Kalibrerings Curves
Den nedre grensen for deteksjon var 0,5 ng / ml og den nedre grense for kvantifisering var 1,0 ng / ml. Femti ng / ml ble valgt som den høyeste kalibrator som høyere konsentrasjoner er neppe nås på klinikken under normale omstendigheter.
Kalibreringskurver ble tilberedes på hver validering dag i humant EDTA-fullblod, tørket på filterkort og ekstrahert med metanol / 0,2 M ZnSO4 (70:30 v / v) + intern standard (sluttkonsentrasjon av intern standard: 2,5 ng / ml ). For dagen en validerings (n = 6 for kalibratorer og n = 6 for QC nivå) og i dager 2 - 20 (n = 2 for kalibratorer og n = 4 for hver QC nivå) ble analysert med konsentrasjoner 1, 2,5, 5, 10, 25, 50 ng / ml for CALIBrators. En typisk kalibreringskurve er vist i figur 4. Midlere nøyaktighet på 85% til 115% av nominell, innenfor arbeidsområdet for 2/3 av kalibratorene (med et minimum 6 ikke-null-kalibrator) ble vurdert som akseptabel. Den midlere korrelasjonskoeffisienten var (r) = 0,999 (n = 40 kalibreringskurver).
Nøyaktighet og presiseringer
Resultatene er vist i detalj i tabell 3.
Utvinning Recovery
Gjennomsnittlig utvinningsføringer var 98,2% (2 ng / ml), 92,2 (4 ng / ml), 95,5 (20 ng / ml), 96,2 (40 ng / ml).
Matrix Interferens, Ion Suppression / Ion Enhancement Testing Bruk av kontinuerlig Post-kolonne Infusion og Carry-over
Analyse av blanke prøver fra åtte forskjellige individer (n = 4 kvinnelige og mannlige n = 4) viste signaler mindre enn 15% av den LLOQ (1 ng / ml) ved retensjonstid svarende tiltacrolimus topp som indikerer at den detekterte takrolimus topp kan betraktes bestemt. Et representativt eksempel er vist i figur 3. Potensielle forstyrrelser fra ion undertrykkelse / ion forbedring ble testet ved bruk av tomme tørkede blodprøver fra åtte forskjellige friske individer. En representant eksperiment er vist i figur 5. Ingen indikasjoner på betydelig ion undertrykkelse / ion forbedringen ble observert. Ingen relevant overheng som resulterer i toppene ved LLOQ overstiger 15% av signalet ble påvist.
Fortynning Integrity
Fortynning integritet ble undersøkt ved å analysere prøver fremstilt ved konsentrasjoner over høyeste kalibrator (100, 250 og 500 ng / ml) og fortynnet 1:10 i proteinutfelling løsning etter ekstraksjon for å nå målet konsentrasjoner av: 10, 25, og 50 ng / ml. Mean nøyaktighet måtte falle innenfor akseptkriteriene på 85% til 115% av den nominelle konsentrasjoner. Alle fortynninger tested møtte akseptkriterier (tabell 4).
Stabiliteter
Stabilitet av takrolimus i tørket blod flekker ble undersøkt ved å analysere QC prøver på alle fire nivåer (n = 4 / konsentrasjon nivå), som ble lagret under varierende forhold.
Mean nøyaktighet måtte falle innenfor akseptkriteriene på 85% til 115% av den nominelle konsentrasjoner. Resultater er vist i detalj i tabell 5. Ingen tap etter en ukes lagring ved romtemperatur, etter en uke med lagring ved 4 ° C, etter en måneds lagring ved -20 ° C, etter en måneds lagring ved -80 ° C, etter tre fryse og tinesykluser, og etter 72 timer utklippede prøver i auto sampler ved 4 ° C var tydelige.
| Utvinning Pump | Analytisk (Elusjon) Pump | ||||||
| Vann + 0,1% maursyre | Acetonitril | Strømningshastighet [ul / min] | [Min] | Vann + 0,1% maursyre | Acetonitril | Strømningshastighet [ul / min] | |
| 0 | 70 | 30 | 5000 | 0 | 1. 3 | 87 | 1000 |
| 1 | 70 | 30 | 5000 | 2 | 2 | 98 | 1200 |
| 1.1 | 2 | 98 | 100 | 3.5 | 2 | 98 | 1200 |
| 3 | 2 | 98 | 100 | 3.6 | 1. 3 | 87 | 1000 |
| 3.1 | 20 | 80 | 2000 | 4.6 | 1. 3 | 87 | 1000 |
| 4 | 70 | 30 | 5000 | ||||
| 4.6 | 70 | 30 | 5000 | ||||
Tabell 1. Gradient Program for Utvinning og Analytisk HPLC pumper.
| Parameter | Innstilling |
| Kollisjon gass (CAD) | 10 |
| Gardin gass (CUR) (psi) | 30 |
| Ion Source gass 1 (GS1) (psi) | 50 |
| Ionekilde gass 2 (GS2) (psi) | 30 |
| Forstøveren strøm (NC) (V) | 1 |
| Temperatur (TEM) (° C) 600 | |
| IonSpray Spenning (IS) (V) | 5500 |
| Interface varmeapparat (IHE) | På |
| Declustering potensial (DP) (V) | 136 |
| Inngang potensial (EP) (V) | 10 |
| Kollisjonsenergi (CE) (V) | 47 |
| Kollisjon celle exit potensial (CXP) (V) | 16 |
Tabell 2. Turbo Elektro Grensesnitt og massespektrometer Parametere. Nomenklaturen tilsvarer det som brukes i massespektrometri programvare (for produsentens informasjon, vennligst se Materials List).
| Validering Day | QC nivå [% av nominell konsentrasjon] | |||
| 2 | 4 | 20 | 40 | |
| Dag 1 | 93.0 | 86.3 | 88.9 | 93.4 |
| 101 | 90.4 | 95.3 | 100 | |
| 85.6 | 95.9 | 99.0 | 97.5 | |
| 88.6 | 93.6 | 105 | 103 | |
| 85.0 | 97,4 | 97.2 | 109 | |
| 89.1 | 96.7 | 100 | 101 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 90.4 | 93.4 | 97.6 | 100,7 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 6.6 | 4.6 | 5.5 | 5.2 |
| Dag 2 | 92.8 | 86.0 | 103 | |
| 91.1 | 88.8 | 94.7 | 87.0 | |
| 88.6 | 90.9 | 92.8 | 94.2 | |
| 97.2 | 93,7 | 94.2 | 115 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 92.4 | 89.9 | 96.2 | 97.9 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 3.9 | 3.6 | 4.8 | 12.2 |
| Dag 3 | 97.6 | 101 | 98,4 | 112 |
| 104 | 85.6 | 102 | 110 | |
| 99,2 | 88.4 | 99.4 | 105 | |
| 96,3 | 87.2 | 108 | 117 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 99.3 | 90,6 102,0 | 111,0 | |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 3.4 | 7.8 | 4.2 | 4.5 |
| Dag 4 | 95.2 | 88.6 | 112 | 94.5 |
| 105 | 87.3 | 93.2 | 116 | |
| 99,8 | 96.2 | 103 | 103 | |
| 100 | 104 | 97.2 | 99.4 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 100,0 | 94.0 | 101,4 | 103.2 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 4.0 | 8.2 | 8.1 | 8.9 |
| Dag 5 | 106 | 90.4 | 101 | 106 |
| 108 | 89.0 | <td> 106100 | ||
| 102 | 101 | 96.6 | 128 | |
| 105 | 88.8 | 105 | 107 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 105,3 | 92.3 | 102,2 | 110,3 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 2.4 | 6.3 | 4.2 | 11.1 |
| Dag 6 | 90.9 | 93,7 | 119 | 106 |
| 98,8 | 88.1 | 96,4 | 110 | |
| 94.6 | 96,3 | 99.1 | 108 | |
| 108 | 100 | 102 | 102 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 98.1 | 94.5 | 104,1 | 106.5 |
| 7.5 | 5.3 | 9.8 | 3.2 | |
| Dag 7 | 85.1 | 87.5 | 99.5 | 95,4 |
| 86.4 | 85.4 | 94.7 | 101 | |
| 94.5 | 87.3 | 98.9 | 94.6 | |
| 85.5 | 97.0 | 101 | 99,6 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 87.9 | 89.3 | 98,5 | 97.7 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 5.1 | 5.8 | 2.7 | 3.2 |
| Dag 8 | 86.1 | 92.5 | 91.9 | 102 |
| 87.5 | 91.5 | 95.2 | 88.5 | |
| 115 | 85.6 | 92.1 | 102 | |
| 85.8 | 85,9 | 95,4 | 108 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 93.6 | 88.9 | 93,7 | 100,1 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 15.3 | 4.1 | 2.0 | 8.2 |
| Dag 9 | 88.9 | 91.4 | 96,9 | 100 |
| 90,0 | 89.8 | 95.0 | 100 | |
| 69.7 | 85,9 | 95.8 | 109 | |
| 91.9 | 87.0 | 105 | 101 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 85.1 | 88.5 | 98.2 | 102,5 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 12.2 | 2.9 | 4.7 | 4.3 |
| Dag 10 | 90.9 | 91.3 | 96.2 | 100 |
| 97.7 | 89.5 | 94.4 | 100 | |
| 99.9 | 109 | 98.7 | 96,8 | |
| 99.1 | 90,0 | 95.7 | 96.1 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 96,9 | 95.0 | 96,3 | 98.2 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 4.2 | 9.9 | 1.9 | 2.1 |
| Dag 11 | 92,7 | 91.9 | 88.2 | 104 |
| 96.6 | 91.2 | 97.0 | 110 | |
| 109,0 | 92.8 | 970,6 | 102 | |
| 98.3 | 107 | 93,7 | 111 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 99,2 | 95.7 | 94.1 | 106,8 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 7.0 | 7.9 | 4.6 | 4.1 |
| Dag 12 | 87.7 | 85.5 | 105 | 95.3 |
| 112 | 88.1 | 101 | 96.1 | |
| 102 | 89.1 | 89,7 | 97.5 | |
| 106 | 92.5 | 102 | 104 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 101,9 | 88.8 | 99.4 | 98.2 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 10.1 | 3.3 | 6.7 | 4.0 |
| Dag 13 | Mislyktes | 85,7 | 93.3 | 102 |
| 101 | 105 | 88.0 | 93.9 | |
| 112 | 98.0 | 91.4 | 102 | |
| 104 | 113 | 104 | 101 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 105,7 | 100,4 | 94.2 | 99,7 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 5.4 | 11.5 | 7.3 | 3.9 |
| Dag 14 | 91.5 | 89.1 | 97,4 | 93.1 |
| 90.4 | 87.1 | 93.9 | 99,8 | |
| 89,7 | 97.0 | 94.8 | 106 | |
| 97,4 | 86.8 | 89.9 | Mislyktes | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 92.3 | 90,0 | 94.0 | 99,6 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 3.8 | 5.3 | 3.3 | 6.5 |
| Dag 15 | 92.8 | 92.8 | 92.5 | 95,4 |
| 97.5 | 96,3 | 96.2 | 95.5 | |
| 95.5 | 108 | 97.3 | 99.3 | |
| 110 | 109 | 115 | 113 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 99.0 | 101,5 | 100,3 | 100,8 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 7.7 | 8.1 | 10,0 | 8.3 |
| Dag 16 | 93,7 | 97.8 | 90,7 | 112 |
| 90.3 | 87.1 | Mislyktes | 101 | |
| 97.9 | 88.3 | 95.5 | 107 | |
| 91.4 | 85,7 | 89.3 | 96.7 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 93.3 | 89,7 | 91.8 | 104,2 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 3.6 | 6.1 | 3.5 | 6.4 |
| Dag 17 | 88.0 | 86.0 | 93,7 | 103 |
| 89.8 | 90.8 | 94.8 | 93.2 | |
| 85,9 | 91.1 | 99,7 | 94.8 | |
| 86.7 | 88.1 | 95,6 | 91.7 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 87.6 | 89.0 | 96,0 | 95.7 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 1.9 | 2.7 | 2.7 | 5.3 |
| Dag 18 | 89.6 | 85.8 | 91.0 | 98.3 |
| 89.6 | 86.2 | 88.3 | 93.6 | |
| Mislyktes | 86.7 | 96,8 | 104 | |
| 88.1 | 85.8 | 95.2 | 111 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 89.1 | 86.1 | 92.8 | 101,7 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 1.0 | 0.5 | 4.2 | 7.4 |
| Dag 19 | 98.0 </ td> | 89,7 | 94.2 | 102 |
| 88.3 | 86.0 | 97.6 | 102 | |
| 91.6 | 88.1 | 95.8 | 97.5 | |
| 90,7 | 90.1 | 92.8 | 88.3 | |
| Intradag Nøyaktighet [%] | 92.2 | 88.5 | 95.1 | 97.5 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 4.5 | 2.1 | 2.2 | 6.6 |
| Dag 20 | 93.0 | 87.0 | 99.4 | 101 |
| 97.3 | 87.6 | 95.5 | 91.9 | |
| 89.0 | 88.4 | 91.2 | 93,5 | |
| 104 | 90,7 | 97.7 | 115 | |
| Intra-dag Nøyaktighet[%] | 95.8 | 88.4 | 96,0 | 100,4 |
| Intra-Day upresisjon [CV%] | 6.7 | 1.8 | 3.7 | 10.5 |
Inter-Day Nøyaktighet og upresisjon | ||||
| Inter-dag Nøyaktighet | 95.2 | 91.7 | 97.2 | 101,6 |
| Inter-Day upresisjon | 6.1 | 4.5 | 3.6 | 4.2 |
Tabell 3. Resultater av kvalitetskontrollprøver over 20 dager. Data blir presentert som% av pålydende. Prøvene som er oppført som "feilet" er prøver som ble tapt til laboratoriet / instrumentfeil. I de fleste cases ble ingen topper oppdaget i det hele tatt eller intern standard peak manglet.
| Fortynning | 01:10 |
| Nominell målet konsentrasjon etter fortynning | 50 ng / ml |
| 98,6 | |
| 94.5 | |
| 91.4 | |
| Nøyaktighet [%] | 94.8 |
| Unøyaktighet [CV%] | 3.6 |
| Fortynning | 01:10 |
| Nominell målet konsentrasjon etter fortynning | 10 ng / ml |
| 103 | |
| 99.5 | |
| 101 | |
| Nøyaktighet [%] | 101,2 |
| Unøyaktighet [CV%] | 1.8 |
| Fortynning | 01:10 |
| Nominell målet konsentrasjon etter fortynning | 25 ng / ml |
| 91.7 | |
| 98.2 | |
| 103 | |
| Nøyaktighet [%] | 97.6 |
| Unøyaktighet [CV%] | 5.7 |
Tabell 4. Resultater av fortynning Integrity Testing. Data blir presentert som% av pålydende.
| A | ||||
| Stabilitet ved RT, dag 1 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 91.9 | 85.8 | 86.0 | 102 | |
| 86.7 | 85,7 | 88.5 | 102 | |
| 86.0 | 85,9 | 90.1 | 103 | |
| 89.2 | 98.0 | 90.8 | 112 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 88.5 | 88.9 | 88.9 | 104,8 |
| Unøyaktighet [% CV] | 2.7 | 6.1 | 2.1 | 4.9 |
| Stabilitet ved romtemperatur, Dag 3 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 88.6 | 105 | 101 | 113 | |
| 94.1 | 100 | 98,5 | 103 | |
| 100 | 101 | 106 | 109 | |
| 99.5 | 102 | 102 | 108 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 95,6 | 102,0 | 101,9 | 108,3 |
| Unøyaktighet [% CV] | 5.3 | 2.2 | 3.1 | 4.1 |
| Stabilitet ved romtemperatur, Dag 7 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 105 | 103 | 91.7 | 109 | |
| 101 | 107 | 100 | 110 | |
| 102 | 108 | 107 | 105 | |
| 93,8 105 | 109 | 111 | ||
| % Av nominell konsentrasjon | 100,5 | 105,8 | 101,9 | 108,8 |
| Unøyaktighet [% CV] | 4.7 | 2.2 | 7.8 | 2.6 |
| B | ||||
| Stabilitet ved 4 ° C, dag 1 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 101 | 89.9 | 95.8 | 100 | |
| 88.9 | 91.0 | 94.1 | 99.0 | |
| 96.2 | 100 | 102 | 96.7 | |
| 89.5 | 87.8 | 95,4 | 88.6 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 93.9 | 92.2 | 96,8 | 96.1 |
| Unøyaktighet [% CV] | 5.8 | 5.4 | 3.5 | 5.2 |
| Stabilitet ved 4 ° C, Dag 3 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87.3 | 85.2 | 105 | 95.3 | |
| Mislyktes | 87.8 | 101 | 96 | |
| 101 | 88.8 | 89.6 | 97.5 | |
| 106 | 92.2 | 102 | 104 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 98.1 | 88.5 | 99.4 | 98.2 |
| Unøyaktighet [% CV] | 9.7 | 2.9 | 6.8 | 4.0 |
| Stabilitet ved 4 ° C, Dag 7 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 94.0 | 98,5 | 96.1 | 110 | |
| 92.9 | 96,4 | 109 | 109 | |
| 91.7 | 96,3 | 97.9 | 115 | |
| 94.7 | 96,9 | 99,8 | 113 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 93.3 | 97.0 | 100,7 | 111,8 |
| Unøyaktighet[%CV] | 1. 3 | 1.0 | 5.7 | 2.8 |
| C | ||||
| Stabilitet ved -20 ° C, Dag 3 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 87.3 | 98.7 | 111 | 111 | |
| 93,5 | 89.6 | 108 | 105 | |
| 89.5 | 91.5 | 107 | 112 | |
| 88.2 | 99.1 | 108 | 92.4 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 89.6 | 94.7 | 108,5 | 105,1 |
| Unøyaktighet [% CV] | 2.7 | 4.9 | 1.7 | 9.0 |
| Stabilitet ved -20 ° C, Dag 7 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96.5 | 98.7 | 102 | 109 | |
| 94.8 | 94.6 | 114 | 106 | |
| 95.5 | 102 | 98.1 | 108 | |
| 107 | 99.5 | 115 | 105 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 98,5 | 98.7 | 107.3 | 107 |
| Unøyaktighet [% CV] | 5.7 | 3.1 | 8.5 | 1.8 |
| </ td> | ||||
| Stabilitet ved -20 ° C, dager 30 | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 82.3 | 83.1 | 90.4 | 93.2 | |
| 87.9 | 85.8 | 85.3 | 97.9 | |
| 85,7 | 88.6 | 98.3 | 98.0 | |
| 92.0 | 95,6 | 110 | 103 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 87.0 | 88.3 | 96,0 | 98.0 |
| Unøyaktighet [% CV] | 4.1 | 5.4 | 10.8 | 4.0 |
| D </ td> | |||||||||
| Stabilitet ved -80 ° C, Dag 3 | |||||||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | |||||
| 87.5 | 96.5 | 96.7 | Mislyktes | ||||||
| Mislyktes | 97.6 | 98.7 | 110 | ||||||
| 88.8 | 96,4 | 106 | 109 | ||||||
| 87.3 | 101 | 96.5 | 109 | ||||||
| % Av nominell konsentrasjon | 87.9 | 97.9 | 99.5 | 109,3 | |||||
| Unøyaktighet [% CV] | 0.8 | 2.2 | 4.5 | 0.6 | |||||
| Stabilitet ved -80 ° C, Dag 7 | QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 | ||||
| Mislyktes | 98.0 | 105 | 99,8 | ||||||
| 97,1 | 106 | 104 | 105 | ||||||
| 99,7 | 102 | 99.3 | 102 | ||||||
| 101 | 99.9 | 109 | 106 | ||||||
| % Av nominell konsentrasjon | 99.3 | 101,5 | 104,3 | 103.2 | |||||
| Unøyaktighet [% CV] | 2.0 | 3.4 | 4.0 | 2.8 | |||||
| Stabilitet ved -80 ° C, dager 30 | |||||||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | | 20 | 40 | | |||||
| 88.2 | 85.3 | 89.6 | 96.7 | ||||||
| 96.2 | 92.6 | 85.8 | 94.1 | ||||||
| 83.9 | 93,7 | 91.0 | 105 | ||||||
| 95,6 | 94.0 | 98.9 | 102 | ||||||
| % Av nominell konsentrasjon | 91.0 | 91.4 | 91.3 | 99.5 | |||||
| Unøyaktighet [% CV] | 6.0 | 4.1 | 5.5 | 4.9 | |||||
| E | ||||
| Fryse tine stabilitet, -20 ° C, en syklus | ||||
| QC nivå [ng / ml] </ td> | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 92.5 | 86.2 | 90.2 | 94.3 | |
| 89.8 | 90.5 | 85.4 | 104 | |
| 94.7 | 88.6 | 93.4 | 104 | |
| 101 | 89.2 | 93,7 | 96,3 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 94.5 | 88.6 | 90,7 | 99,7 |
| Unøyaktighet [% CV] | 4.8 | 1.8 | 3.9 | 5.1 |
| Fryse tine stabilitet, -20 ° C, 2 sykluser | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 99.1 | 97.6 | Mislyktes | 85.3 | |
| 93.1 | 88.1 | 93.4 | 92.0 | |
| 94.9 | 91.5 | 85.8 | 93.9 | |
| Mislyktes | 90.5 | 86.8 | 85.4 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 95.7 | 91.9 | 88.7 | 89.2 |
| Unøyaktighet [% CV] | 3.1 | 4.0 | 4.1 | 4.5 |
| Fryse tine stabilitet, -20 ° C, 3 sykluser | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 95.7 | Mislyktes | 86.0 | 93.3 | |
| 95.5 | 87.4 | 85.0 | 91.3 | |
| 90.5 | 89.1 | 86.0 | 86.0 | |
| 96,9 | 85,7 | 90.2 | Mislyktes | |
| % Av nominell konsentrasjon | 94.7 | 87.4 | 86.8 | 90.2 |
| Unøyaktighet [% CV] | 2.8 | 1.7 | 2.3 | 3.8 |
| F | ||||
| Utklipt stabilitet ved 4 ° C, 24-timers | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 122 | 112 | 91.0 | 104 | |
| 93,5 | 106 | 91.8 | 96.1 | |
| 111 | 94.8 | 98.2 | 93,5 | |
| 98,4 | 97.6 | 91.3 | 89.8 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 106,2 | 102,6 | 93.1 | 95.9 |
| Unøyaktighet [% CV] | 12.8 | 7.9 | 3.4 | 6.0 |
| Utklipt stabilitet ved 4 ° C, 48 timer | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 106 | 108 | 93,7 | 110 | |
| 105 | 98.1 | 94.6 | 98.9 | |
| 103 | 98,4 | 95.0 | 92.6 | |
| 108 | 93.1 | 89,7 | 85.5 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 105,5 | 99.4 | 93.3 | 96,8 |
| Unøyaktighet [% CV] | 2.1 | 6.2 | 2.4 | 10.4 |
| Utklipt stabilitet ved 4 ° C, 72 timer | ||||
| QC nivå [ng / ml] | 2 | 4 | 20 | 40 |
| 96.5 | 112 | 96,4 | 104 | |
| 101 | 95.3 | 103 | 95.2 | |
| 94.2 | 105 | 93,5 | 99.5 | |
| 100 | 96,9 | 92.6 | 89.3 | |
| % Av nominell konsentrasjon | 97.9 | 102,3 | 96,4 | 97.0 |
| Unøyaktighet [% CV] | 3.1 | 7.7 | 4.7 | 6.3 |
Tabell 5. Resultater fra stabilitetstesting. A: Stabilitet av takrolimus på tørket blod flekker på RT over 7 dager, B: Stabilitet av takrolimus på tørket blod flekker i kjøleskapet (4 ° C) over 7 dager, C: Stabilitet av takrolimus på tørket blod flekker ved -20 ° C i løpet av en måned, D: Stabilitet av takrolimus på tørket blod flekker ved -80 ° C i løpet av en måned, E: Stabilitet av takrolimus på tørket blod flekker over tre fryse-tine sykluser (-20 ° C), F : Hentet sample / autosampler stabilitet ved 4 ° C i løpet av 72 timer. Dataene er presentert som% av nominell konsentrasjon. Prøvene som er oppført som "feilet" er prøver som ble tapt til laboratoriet / instrumentfeil. I de fleste tilfeller ingen topper ble påvist i det hele tatt, eller den indre standard topp manglet.
Figur 1. Struktur Tacrolimus. Atom Nummereringen følger International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) nomenklatur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Tilkobling av Switching Valve.424fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Representative ionekromatogrammer. (A) Representant ion kromatogram av en tomme blodprøver oppdaget på filterpapir (for produsentens informasjon, vennligst se Materials List) og tørket. Pilen markerer retensjonstiden for takrolimus peak, (B) Representative ion kromatogram av en tom blodprøver tilsatt ved den nedre grensen for kvantifisering (1 ng / ml) flekket på filterpapir og tørket, og (C) Representative ion kromatogram av en prøve samlet inn av en transplantasjon pasient på filterpapiret. Dette er et trau prøve og den målte tacrolimus-konsentrasjonen var 2,1 ng / ml. Denne prøven ble innhentet av pasienten hjemme og er fra en klinisk studie som var godkjent av University of Cincinnati Institutional Review Board (Cincinnati, OH). Alle pasienter ga sin passende skriftlige samtykke. Ionekromatogrammer er originale utskrifter som genereres av massespektrometri programvare (for produsentens informasjon, vennligst se Materials List). Blå og røde linjer i ionekromatogrammer representerer intern standard D 2, 13 C-takrolimus og tacrolimus, henholdsvis. Toppen eluering foran hoved takrolimus og intern standard topper er de rotamerer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En original print-out som genereres av massespektrometri programvaren er vist. Figur 4. Representant kalibreringskurven.424 / 52424fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Representant Ion Kromatogrammet målt under Post-kolonne Infusion av Tacrolimus og Injeksjon av en ekstrahert Blank blodprøve for å vurdere en potensiell Matrix Effect (Ion Suppression / Ion Enhancement). Pilen markerer oppholdstid av takrolimus peak. Matrise virkning testing var basert på fremgangsmåten beskrevet i 46. Ingen relevant matrix effekt ble oppdaget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om, som tidligere nevnte, er begrepet terapeutisk legemiddel og overholdelse overvåking av takrolimus basert på tørkede blodflekker attraktiv, er det analytiske utfordringer som går utover de som typisk er forbundet med LC-MS / MS-analyse av takrolimus i venøst EDTA hele blodprøver. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, det faktum at matrisen er kapillært helblod gjennomvåt ned i bomullslinters materialet i filter kortet materialet som brukes her og den lave blodvolumet (20 ul). Ikke desto mindre, high-throughput-analyse i et sentralt laboratorium krever en rask og pålitelig ekstraksjon metode som resulterer i prøver som mangler matrise forstyrrelser og matrise effekter i kombinasjon med en robust, spesifikk og meget følsom LC-MS / MS-analyse. Påliteligheten av analysen er kritisk så er det vanligvis ikke nok materiale på den allerede stemplet filter kort igjen for re-analyse ved ekstraksjon / LC-MS / MS-analyse svikter.
Den filter kort som brukes i denne studien (for produsentens informasjon, vennligst se Materials List) ble valgt da dette er en FDA godkjent klasse II-enhet, er i samsvar med NCCLS veiledning LA4-A5 44 og er CE-merket i Europa. Hvis helt fylt, en sirkel på Whatman 903 filter kortet inneholder ≈50 mL blod 46. Men størrelsen av bloddråper som samles inn av den enkelte pasient varierer og trening i riktig prøvetakingsteknikk er essensielt 46.
Den første viktige skrittet å utvinne en utstanset tørket blod flekk prøven er homogenisering. Basert på vår erfaring, er bruken av en kule blender mer effektiv og bedre reproduserbare enn andre metoder som benyttes for å forbedre utvinningseffektiviteten for eksempel sonikering. Bruken av kulen blender var nødvendig for å konsekvent oppnå utvinning gjenvinninger over 90%. For påliteligheten til utvinning prosedyren, var det også viktig å sikre at alle sentrifuger ble Temperature kontrollert (4 ° C), og at det virvling trinn var ikke kortere enn 10 minutter, noe som resulterte i mer variable og lavere utvinning inngang. I tillegg er det viktig at metanol / ZnSO4-forhold ikke endres som takrolimus utvinning er svært følsom for den korrekte sammensetning av proteinutfelling løsningen.
Den neste utfordring er å oppnå en ren ekstrakt ideelt sett fri for materialer som kan føre til forstyrrelser og matrise effekter. Således kan en enkel ett-trinns proteinutfelling trinn som ofte brukes til utvinning av takrolimus fra EDTA-blodprøver ble ikke ansett som et levedyktig alternativ. Etter proteinutfelling ved hjelp av ZnSO4 (inkludert tilsetning av en isotop-merket intern standard), virvling og sentrifugering ble supernatanten injiseres i et 2D-HPLC-system, og på en elektronisk ekstraksjonskolonne. Online kolonne ekstraksjon ved hjelp av høye strømmer av 5 ml / min på konvensjonelle pre-kolonne patronene ved hjelp av en enkel seks-portOmkoblingsventil for analyse av takrolimus er beskrevet før 47. Den mobile fasen ble valgt slik at takrolimus og den interne standard konsentrert i fronten av ekstraksjonskolonnen, og ikke migrere over kolonnen i løpet av rensetrinnet. Den elektroniske ekstraksjon anvendt i den foreliggende protokoll hadde flere fordeler, inkludert injeksjon av relativt store prøvevolumer uten negativt å påvirke HPLC-analyse. Baksiden i flukt etter berikende analyttene på toppen av ekstraksjonskolonnen ("peak fokusering") resulterte i en skarpere topper som åpner for mer pålitelig integrasjon av programvarealgoritme spesielt for prøver med lave takrolimuskonsentrasjonen. 48 Den elektroniske rensetrinnet ikke bare fjerne potensielt forstyrrende matriksforbindelser, men også avsaltet prøven. En viktig, men sjelden omtalt problem for høyt volum, med høy gjennomstrømning LC-MS / MS-analyser er gradvis tap av følsomhet av LC-MS / MS-system på grunn av økendeforurensning av det elektrospray kilde ved analyse av store partier. Ingen signifikante matrix effekter (ion undertrykkelse / ion ekstrautstyr) ble observert. Den negative effekten av potensielle matriseeffektene ble redusert / unngått ved kombinasjon av følgende: effektiv proteinutfelling ved bruk av metanol / ZnSO4, sentrifugering etter proteinutfelling ved 16 000 xg, med høy strømnings nettet ekstraksjon, klar kromatografisk separasjon av takrolimus fra mulige forstyrrelser tidlig eluerte fra det analytisk kolonne og bruken av isotop-merket takrolimus som indre standard i stedet for strukturelt beslektede interne standarder som askomycin.
Den nedre grense for kvantifisering var 1 ng / ml, og dermed lavere enn for de fleste immunoanalyser som i dag hyppig anvendes for terapeutisk overvåkning av takrolimus i EDTA blodprøver. Denne nedre grense for kvantifisering er tilstrekkelig selv for såkalt lav kalsineurinhemmer langtids immunosuppressive vedlikeholds protokoller.
Sammenlignet med tidligere beskrevet LC-MS / MS analyser for å kvantifisere takrolimus i tørket Bloods ble 29-34,36,39,41,42, dagens analyse kampene eller overgår deres prestasjoner i form av lavere kvantifiseringsgrensen, utvinning utvinning, nøyaktighet og presisjon samtidig unngå potensielt risikable begreper som ett-trinns protein nedbørs prosedyrer og ultra-korte kromatografi ganger, noe som vanligvis gir akseptable resultater under validering basert på blodprøver fra friske individer. Men transplanterte pasienter har en svært sammensatt gruppe av pasienter som har sykdommer som påvirker sammensetningen av blod og som tar flere medisiner. Dette gjør det praktisk talt umulig å utelukke alle potensielle forstyrrelser som kan være til stede i den enkelte pasient under validering og den eneste levedyktige strategi er å sette opp analysen på en måte som det reduserer risikoen for slike potensielle forstyrrelser. Tørket blod spots har utfordringer som for eksempel effekten av hematokritt på blod viskositet og dermed diffusjonsegenskaper i blod påført på filterpapir 49. Dette ble ikke testet her igjen som slike effekter er allerede beskrevet ikke å påvirke takrolimus analyse i tørket blod flekker på hematocrits og takrolimuskonsentrasjonen innenfor klinisk rimelighetens grenser 29,32. Også stabiliteten av takrolimus i tørket blodflekker ved forhøyede temperaturer har allerede blitt studert av andre og takrolimus i tørket blod flekker ble funnet å være stabil i 5 dager ved 37 ° C og til og med 60 ° C 32, noe som er viktig for forsendelse av tørket blod flekker under ikke temperaturregulerte forhold spesielt om sommeren.
Denne analyse bygger på en kombinasjon av kule blender homogenisering, kan høy-flow nettet kolonne opprydding og LC-MS / MS-analyse gir en plattform strategi for utvikling av Bioanalytical analyser for kvantifisering av andre immunosuppressants, alene eller samtidig, samt av andre legemidler i tørket blod stikkprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 | |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 | |
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V | |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q | |
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% | Sigma-Aldrich | 439126-4 L | |
| Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 | |
| Isopropanol 99.9%, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 | |
| Methanol Optima LC/MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 | |
| Water Optima LC/MS, UHPLC-UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 | |
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 | |
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 | |
| 1.5 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 | |
| 10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 | |
| 10 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 | |
| 100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 | |
| 100 μl pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 | |
| 1,000 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 | |
| 2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 | |
| 2 ml Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 | |
| 20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 | |
| 20 μl pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 | |
| 200 μl pipet tips with filter | Multimax | 2938T | |
| 200 μl pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 300 μl inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 | |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 | |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 | |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 | |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 | |
| Glass v ials, 4 ml | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 | |
| Glass vials, 20 ml | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 | |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S | |
| HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 | |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B | |
| Needle, 18 G 1.5 | Precision Glide | 305196 | |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 | |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 | |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B | |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 | |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 | |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 | |
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 | |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B | |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A | |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 | |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C | |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C | |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 | |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 | |
| Tandem Mass Spectrometer | |||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 | |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
References
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
- Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
- Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
- A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
- Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
- Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
- Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
- Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
- Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
- Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
- Annual Data Report. , Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
- Draft Guidance on Tacrolimus. , Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
- Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
- Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb , 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
- Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
- Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
- Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
- Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
- Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
- Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
- Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
- Kelly, D. A.
- Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
- Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
- Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
- Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
- Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
- Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
- Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
- Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
- Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
- Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
- Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
- Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
- Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
- Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
- Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
- Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
- Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
- Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
- Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
- Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. , Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
- Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
- Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
- Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
- Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).
