Summary
Ce bio-essai emploie un poisson prédateur de modèle pour évaluer la présence de métabolites alimentation-dissuasion à partir d'extraits organiques des tissus d'organismes marins à des concentrations naturelles en utilisant une matrice d'aliments comparable nutritionnel.
Introduction
l'écologie chimique développé grâce à la collaboration de chimistes et écologistes. Alors que le sous-discipline de l'écologie terrestre chimique a été autour depuis un certain temps, celle de l'écologie marine chimique est âgé de seulement quelques décennies, mais a fourni des informations importantes sur la structure des organismes marins 1-8 l'écologie et de la communauté de l'évolution. Profitant des technologies émergentes de plongée sous-marine et la spectroscopie RMN, chimistes organiques générés rapidement un grand nombre de publications décrivant de nouveaux métabolites invertébrés et les algues marines benthiques dans les années 1970 et 1980 9. En supposant que les métabolites secondaires doivent servir à quelque chose, beaucoup de ces publications attribuées propriétés écologiquement importantes à de nouveaux composés, sans preuves empiriques. À peu près au même moment, les écologistes ont également été profitent de l'avènement de la plongée sous-marine et en décrivant les distributions et l'abondance d'animaux et de plantes benthiques déjà connus from méthodes d'échantillonnage relativement inefficaces comme le dragage. L'hypothèse de ces chercheurs était que tout sessiles et corps mou doivent être défendus chimiquement pour éviter la consommation par les prédateurs 10. Dans un effort pour introduire l'empirisme à ce qui était contraire travail descriptif sur l'abondance des espèces, certains écologistes ont commencé à extrapoler défenses chimiques à partir de tests de toxicité 11. La plupart des tests de toxicité en cause l'exposition des poissons entiers ou autres organismes à des suspensions aqueuses d'extraits organiques bruts de tissus d'invertébrés, avec la détermination ultérieure des concentrations d'extraits secs de masse responsables de la mort de la moitié des organismes d'essai. Cependant, des essais de toxicité ne imitent la manière dont les prédateurs potentiels perçoivent proies dans des conditions naturelles, et des études ultérieures ne ont trouvé aucune relation entre la toxicité et la palatabilité 12-13. Il est surprenant que les publications dans des revues prestigieuses ont utilisé des techniques ayant peu ou pas ecological pertinence 14-15 et que ces études sont toujours largement cités aujourd'hui. Il est encore plus alarmant de constater que les études basées sur des données de toxicité continuent d'être publiés 16-18. La méthode d'analyse biologique décrit ici a été développé à la fin des années 1980 pour fournir une approche écologiquement pertinentes pour les écologistes chimiques marines pour évaluer défenses chimiques antiprédatrices. La méthode nécessite un prédateur de modèle pour déguster un extrait organique brut de l'organisme cible à une concentration naturelle dans une matrice alimentaire comparables sur le plan nutritionnel, fournissant des données d'appétence qui sont écologiquement plus significative que les données de toxicité.
L'approche générale pour évaluer l'activité antiprédatrices des tissus d'organismes marins comprend quatre critères importants: (1) un prédateur généraliste approprié doit être utilisé dans des essais d'alimentation, (2) métabolites organiques de toutes les polarités doivent être exhaustive extraites du tissu de la cibler organisme, (3) les métabolites doivent be mélangé dans un aliment nutritionnellement expérimental approprié à la même concentration volumétrique que l'on trouve dans l'organisme à partir duquel ils ont été extraits, et (4) la conception expérimentale et approche statistique doivent fournir un paramètre significatif pour indiquer distastefulness relative.
La procédure décrite ci-dessous est conçu spécifiquement pour évaluer défenses chimiques antiprédatrices chez les invertébrés marins des Caraïbes. Nous employons le labre bluehead, Thalassoma bifasciatum, comme un poisson prédateur modèle, car cette espèce est commune sur les récifs coralliens des Caraïbes et est connu pour déguster un large assortiment des invertébrés benthiques 19. Le tissu de l'organisme cible est d'abord extrait, puis combiné avec un mélange de nourriture, et enfin offert à des groupes de T. bifasciatum d'observer se ils rejettent les aliments extrait traité. Données test en utilisant cette méthode ont fourni des renseignements importants sur la chimie de défense des organismes marins 12,20-21, ll'histoire de l'IFE compromis 22-24, 25-26 et l'écologie des communautés.
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Protocol
REMARQUE: L'étape 3 de ce protocole implique des sujets sur des animaux vertébrés. La procédure a été conçu afin que les animaux bénéficient d'un traitement le plus humain possible et a été approuvé par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'Université de Caroline du Nord Wilmington.
1) Extraction de tissus
- Utilisez tissu qui est dans son état naturel d'hydratation et pas pressé, desséché ou trop humide que ceci modifie la concentration volumétrique de métabolites secondaires. Couper ou couper le tissu en morceaux ou en tranches qui peuvent être insérés dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Remarque: tissu frais peut être utilisé dans certains cas, mais il est souvent préférable de couper ou hacher tissu congelé, qui ne est pas soumis à presser quand on les coupe.
- Ajouter les morceaux de tissu de 30 ml d'un mélange 1: 1 de dichlorométhane (DCM) et du methanol (MeOH) dans un tube à centrifuger gradué jusqu'à un volume final de 40 ml est atteinte. Assurez-vous de procéder à toutes les étapes impliquant le transfert desolvant dans une hotte avec une ventilation adéquate.
- Boucher le tube et inverser plusieurs fois, puis agiter à plusieurs reprises pendant une période d'extraction de 4 heures. Remarque: Au cours de cette période, l'eau se combine avec le MeOH et le MeOH en résulte: la phase aqueuse se sépare de la phase DCM. Le tissu est exposé alternativement à DCM et du MeOH: eau, une émulsion telle que les tubes sont agités.
- Transférer l'extrait DCM à un ballon à fond rond et évaporer à sec sur un évaporateur rotatif, à feu doux (<40 ° C). Utilisation minimale de solvant, transférer l'extrait séché à une 20 ml flacon à scintillation. Monter le flacon avec un adaptateur évaporateur rotatif et à nouveau évaporer à sec sur un évaporateur rotatif, à feu doux (<40 ° C).
Note: La prochaine étape nécessite l'utilisation d'un instrument de compression maison qui peut être assemblé par vissage les éléments suivants dans l'ordre séquentiel sur l'extrémité d'une tige filetée: (1) écrou, (2) la rondelle, et (3) écrou borgne. La rondelle doit soit être perforé oumonté de sorte qu'il soit inférieur au diamètre interne d'un tube de centrifugation de 50 ml. - En revenant au tube à centrifuger gradué qui contient le tissu et le MeOH: extrait de l'eau, presser le milieu d'extraction hors du tissu lors de la compression. Transférer le MeOH: extrait de l'eau à la même ballon à fond rond et stocker refroidie (<10 ° C).
- Ajouter MeOH dans le tube à centrifuger gradué jusqu'à ce que le tissu est immergé maintenant déshydraté pour une seconde extraction de durée de 2 à 6 h, puis transférer le nouveau MeOH extrait dans le ballon à fond rond contenant le réfrigérées MeOH: extrait de l'eau. Se il ya une inquiétude que le tissu n'a pas été complètement extraite, répéter l'extraction de MeOH 2-6 h.
- Séchez le MeOH sur un évaporateur rotatif, à feu doux (<40 ° C). Transférer l'extrait aqueux restant dans le ballon à fond rond dans le flacon de scintillation contenant l'extrait séché non polaire, en utilisant un volume minimal de MeOH pour rincer le ballon à fond rond.
- Evaporate l'extrait aqueux à sec utilisant la chaleur faible (<40 ° C) sur un concentrateur sous vide. Le flacon de scintillation contient maintenant l'extrait sec organique brut total de 10 ml de tissu. Évacuer l'espace du flacon avec du gaz N 2 pour éviter l'oxydation de la tête, fermer hermétiquement et congelez (-20 ° C).
2) Préparation des aliments
- Préparer calmars poudre de manteau lyophilisée.
Remarque: manteau de calmar est une source d'alimentation qui est comparable à celle d'autres invertébrés benthiques, et sera utilisé comme ingrédient dans les sous-étapes de 2,2.- Anneaux Décongeler du manteau calmars dans déminéralisée chaude (DI) de l'eau, puis les réduire en purée au mélangeur à haute vitesse.
- Versez une fine couche de purée calmars manteau sur une plaque à biscuits peu profonde et le gel (-20 ° C), puis casser la feuille de purée calmars congelés en petits morceaux pour être lyophilisée.
- Lyophiliser le manteau calmars congelés purée en suivant les procédures de fonctionnement de la freeze-cheveux.
- Pulvériser les pièces lyophilisés de calmars manteau purée dans un mélangeur à haute vitesse pour former une poudre.
- Dans une hotte, versez le manteau de calmar en poudre dans une farine tamis rotatif et tamiser pour séparer de grands morceaux de tissu de la poudre fine.
- Transférer le manteau calmars fine poudre dans un récipient hermétique. Évacuer l'espace de tête de récipient avec du gaz N 2 pour éviter l'oxydation et les conserver congelés (-20 ° C).
- Préparer le mélange de nourriture.
Remarque: Lorsque vous exécutez plusieurs essais consécutifs, il est pratique pour préparer ~ 100 ml de mélange de nourriture, cependant cette recette peut être adapté à de plus petits volumes si nécessaire.- Moissonneuse un mélange de 3 g d'acide alginique et 5 g de poudre lyophilisée du manteau calmar avec 100 ml d'eau désionisée dans un bêcher de 150 ml. Remuer vigoureusement avec une microspatule pendant quelques minutes jusqu'à ce que la poudre est entièrement hydraté et le mélange est homogène.
Remarque: Si vous le souhaitez, colorant alimentaire peut être ajoutée à ce stPE: il est plus facile d'ajouter un colorant au mélange de la nourriture qui va générer les deux mélanges traités et témoins (masquant le pigment naturel de l'extrait dans le mélange de l'extrait traité) plutôt que d'essayer de faire correspondre la couleur du mélange d'extraction traité par addition de colorant au mélange de commande. Un colorant alimentaire verdâtre ou brunâtre est souvent souhaitable pour masquer des pigments dans l'extrait brut. - Chargez exactement 10 ml de mélange de la nourriture dans une seringue graduée. Prenez soin d'éviter l'inclusion de bulles d'air lors de ce processus.
- Retirez le flacon à scintillation de 20 ml avec de l'extrait organique brut sec du congélateur. Ajouter une ou deux gouttes de MeOH, puis incorporer l'extrait dans un mélange homogène avec une microspatule.
- Éjecter le chargé seringue de 10 ml de la matrice alimentaire dans le flacon à scintillation de 20 ml et remuez avec une microspatule pour homogénéiser le mélange alimentaire extrait traité.
Remarque: Il peut être utile pour éjecter la seringue par incréments plus petits (ce est à dire, éjecter 2 ml et homogénéiser, alors r.épéter jusqu'à ce que tous les 10 ml ont été homogénéisé).
- Moissonneuse un mélange de 3 g d'acide alginique et 5 g de poudre lyophilisée du manteau calmar avec 100 ml d'eau désionisée dans un bêcher de 150 ml. Remuer vigoureusement avec une microspatule pendant quelques minutes jusqu'à ce que la poudre est entièrement hydraté et le mélange est homogène.
- Préparer les granulés de dosage.
- Chargez un très petit volume du mélange d'extrait (~ 1 ml) dans une seringue, et plonger la pointe de la seringue dans une solution de 0,25 M CaCl 2. Ejecter le contenu de la seringue pour former un long brin de spaghetti-like.
- Après quelques minutes, retirer le brin durci, couper en 4 mm de long pastilles sur une planche à découper en verre avec une lame de rasoir, puis rincer à l'eau de mer.
- Répétez les étapes 2.3.1 et 2.3.2 sans inclure extrait de tissu pour fabriquer des pastilles de contrôle. Assurez-vous de traiter les pastilles de contrôle avec un volume équivalent de solvant (voir addition de MeOH au mélange traité à l'étape 2.2.3) pour contrôler les plus solvant. Si un contrôle négatif désire confirmer que les poissons d'essai peut être dissuadée de l'alimentation, le benzoate de dénatonium ajouter à une concentration de 2 mg ml -1 au mélange de la nourriture crue 27.
3) appétenceBioassays
- Effectuer des essais d'alimentation avec du jaune phase labre bluehead capturés dans la nature, Thalassoma bifasciatum, gardé par groupes de trois dans les compartiments opaque-verso de laboratoire aquariums.
- Délivrer boulettes de nourriture à partir d'un bêcher d'eau de mer en utilisant une pipette en verre avec une poire en caoutchouc. Remarque: Il peut prendre quelques jours pour former poisson pour recevoir de la nourriture de cette manière. Un stimulus conditionné (par exemple à quelques robinets de la pipette sur la vitre de l'aquarium) qui précède la livraison de nourriture peut être utile de former le poisson de se attendre à l'ajout de boulettes de nourriture.
- Marquant pellets. Envisager une pastille accepté si facilement consommé par les poissons. Envisager une pastille rejetée si pas mangé après un minimum de trois tentatives par un ou plusieurs poissons à prendre dans leur cavité buccale, ou si le culot est approché et a ignoré après une telle tentative.
- Échantillons notation. Remarque: La procédure de test est dépeint comme un organigramme de la figure 1 Groupes de poissons qui refusent de manger.pastilles de contrôle à ne importe quelle étape dans le protocole ne sont pas considérées. Il ya deux résultats potentiels d'un seul passage de l'essai: l'échantillon est accepté ou rejeté.
- Commencez avec une pastille de contrôle pour confirmer que le groupe de poissons est coopérative. Offrez une pastille traitée. Si les poissons acceptent le culot traité, marquer l'échantillon comme acceptée. Si les poissons rejettent le culot traité, offrir une pastille de contrôle a posteriori afin de déterminer si les poissons ont cessé l'alimentation. Si les poissons acceptent la pastille de contrôle a posteriori, marquer l'échantillon comme rejetée.
- Replication. Répétez la procédure de test avec dix groupes indépendants de poissons pour chaque extrait.
4) Importance évaluation
- Évaluer l'importance des différences dans la consommation du contrôle vs granulés traités avec une version modifiée du test exact de Fisher 26. Modifier le test de sorte que les totaux marginaux pour le contrôle et granulés traités sont fixés, Les traiter deux échantillons aléatoires. Remarque: Cette offre p = 0,057 lorsque sept pastilles sont consommés; donc, tout extrait est considéré comme dissuasif si les six ou moins pellets sont consommés, et agréable au goût si 7 ou plusieurs pastilles sont consommés.
- Pour comparer l'appétence rapport entre les groupes d'extraits, calculer un nombre moyen de pellets consommés au sein de chaque groupe. Gardez le seuil à 6 pastilles ainsi un groupe d'extraits répétées sont considérées comme dissuasif si le nombre moyen de pellets mangé + erreur standard (SE) ≤6. NOTE: Dans les résultats représentatifs, l'affectation de groupe est l'espèce, de sorte répliquant extraits proviennent d'individus distincts et la palatabilité rapport peuvent être comparés entre les espèces.
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Representative Results
Nous rapportons ici les résultats de cet essai biologique pour six espèces d'éponges commun des Caraïbes (figure 2). Ces données ont été initialement publiés en 1995 par Pawlik et al. 12 et démontrent la puissance de cette approche pour étudier les différences dans les stratégies de défense chimiques entre taxons concomitants. Les résultats ont été rapportés comme un nombre moyen de pastilles d'aliments consommés + erreur standard (SE) pour chaque espèce. Presque pas de pastilles ont été consommés dans des essais avec des extraits organiques bruts de clathrodes Agelas, Amphimédon compressa, et cauliformis Aplysina. En revanche, les granulés fabriqués avec des extraits de Callyspongia vaginalis, Geodia gibberosa et Mycale laevis ont été facilement consommés dans l'essai 12. Moins de six pastilles ont été consommés pour les trois premières espèces, de sorte qu'ils ont été considérés comme nettement dissuasif. En revanche, les secondes trois espèces ne étaient pas significativement différents des témoins, et étaientconsidéré comme acceptable.
Figure 1:. Schéma de la procédure de test À toutes les étapes, le rejet d'une pastille de contrôle indique que cet ensemble de poissons d'essai sont non coopératif ou rassasié et ne peut être utilisé par la suite. Le protocole commence en offrant à chaque ensemble de poissons un à granulés de contrôle suivi d'une pastille traitée. Ensuite, si le culot traité est accepté l'échantillon est marqué comme acceptée. Si la pastille traitée est rejetée, mais le culot de contrôle ultérieur est accepté, l'échantillon est marqué comme rejetée.
Figure 2: Consommation par Thalassoma bifasciatum des boulettes de nourriture (moyenne + SE) contenant des extraits organiques bruts d'éponges à des concentrations naturelles, rapportées en 1995 par Pawlik
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Discussion
La procédure décrite ici fournit un protocole de laboratoire relativement simple, écologiquement pertinent pour évaluer défenses chimiques antiprédatrices dans les organismes marins. Ici nous passons en revue les critères importants qui sont satisfaits par cet ensemble de méthodes:
(1) prédateur appropriée. Ce test alimentation utilise le labre bluehead, Thalassoma bifasciatum, l'un des poissons les plus abondantes sur les récifs coralliens dans les Caraïbes. Le bluehead est un carnivore généraliste connu pour déguster un large assortiment des invertébrés benthiques 19. Prédateurs généralistes sont le meilleur choix pour ces premiers essais car la majorité des poissons prédateurs sur les récifs sont des généralistes, et on pourrait se attendre que les défenses antiprédatrices seraient largement dirigés contre eux, par opposition aux prédateurs spécialistes qui peuvent ont développé des mécanismes pour contourner les défenses. enquêtes de laboratoire de défenses chimiques en utilisant un seul prédateur potentiel sont desdix suivie par plus de temps et de terrain compliquée expériences qui se appuient sur les réponses d'un effectif complet de prédateurs potentiels dans des conditions de terrain 28-33.
(2) Procédure d'extraction. La première étape d'extraction de tissu, qui utilise un mélange de parties égales de solvant dichlorométhane (DCM) et du methanol (MeOH), pénètre rapidement les tissus, membranes et solubilisation de la matière cellulaire de déshydratation. Le tissu est déshydraté après cette étape, de sorte que les étapes ultérieures d'extraire les métabolites restants de tous les polarités dans MeOH. Répétition de l'extraction dans du MeOH jusqu'à ce que le tissu est entièrement extrait constitue une procédure d'extraction exhaustive. Des variations mineures sur ce système d'extraction sont acceptables, comme la substitution d'un solvant d'extraction pour une autre de la même polarité, mais l'extraction de tissu peut être incomplète si un solvant est utilisé inappropriée. Pièges potentiels de procédures d'extraction de tissus incorrecte sont discutés en détail ailleurs <sup> 8.
(3) Préparation de l'alimentation expérimentale. La matrice de nourriture artificielle doit simuler le tissu de l'organisme cible à la fois la qualité nutritionnelle et la concentration des métabolites secondaires. Il est probable que les mêmes processus sensoriels que les prédateurs utilisent pour rejeter métabolites alimentation dissuasives sont également impliqués dans la perception de la qualité nutritionnelle des aliments. Les aliments à faible valeur nutritive peuvent être rejetées à des niveaux beaucoup plus faibles de la défense chimique, et inversement, métabolites secondaires ne peuvent exercer un effet dissuasif à des concentrations supérieures à la naturelle si ces métabolites sont présentés dans un aliment artificiel qui est plus nutritif que le tissu à partir duquel il a été dérivé. En poudre, le manteau de calmar lyophilisé est un substitut nutritionnel utile car il est facilement disponible, facile à mesurer, et de ses caractéristiques nutritionnelles ont déjà été déterminé 34.
La deuxième considération dans la préparation du alimentaire expérimentale concerne la détermination de la concentration de l'extrait, ce qui doit être fait sur la base du volume, pas de masse. Prédateurs mangent tissu humide, et les tissus des organismes marins varient considérablement la teneur en eau. Du point de vue d'un prédateur, une morsure d'une méduse ou anémone de mer devrait contenir beaucoup plus d'eau par unité de masse sèche que la même morsure taille d'un calmar ou limace de mer. Pour les tissus fortement hydratées, la concentration du métabolite par unité de masse sèche serait beaucoup plus élevé que par unité de volume, mais le volume (piqûres) est la mesure qui est écologiquement pertinente. En outre, les tissus d'organismes marins peuvent avoir des densités très différentes parce que d'éléments squelettiques minérales. Détermination de la concentration de métabolite en volume résout les deux problèmes et ce est la mesure la plus pertinente du point de vue de la consommation de tissu par un prédateur potentiel. Ce sujet, y compris des exemples de la littérature, est discuté en détail ailleurs 8.
.. contenu "> (4) la conception expérimentale et approche statistique conception expérimentale appropriée et analyses statistiques des données sont aussi importantes pour les essais de comportement que pour toute autre recherche scientifique qui consiste à déterminer l'importance des différences dans les résultats expérimentaux L'analyse décrit ici est simple: différences sont déterminées avec une table de contingence modifié. La méthode exige que toutes les offrandes de nourriture de contrôle être consommés parce que l'enquêteur ne utiliserait pas les prédateurs expérimentales qui ne ont pas nourrissent sur les aliments de contrôle 8. Bien que l'utilisation du test exact de Fisher a été modifié depuis sa première utiliser par Pawlik et al. 12, la valeur de seuil de 6 pastilles traités mangé reste inchangé. Au fil des ans, d'autres tests statistiques ont été suggérés comme substituts, mais jetés après consultation avec le collaborateur James E. Blum (UNCW Département de mathématiques et de statistique ). Par exemple, le test de McNemar a été suggéré,mais est inappropriée, à la fois parce qu'il manque un ensemble de données appariées, et parce que une rangée de la table de contingence est fixé à 10 pastilles de contrôle mangé.Malgré notre expérience que cette méthode d'essai fournit des résultats remarquablement claires, il se appuie néanmoins sur une réponse comportementale. Si les poissons sont privés de nourriture pendant une période de temps avant l'essai, ils peuvent manger plus de plombs traités qu'ils ne le feraient si les poissons ont été bien nourris, en particulier si un métabolite défensive est présente dans les granulés alimentaires traitées à une concentration proche-seuil d'activité. Pour ces raisons, les résultats de tests d'alimentation ne doivent pas être sur-interprétés. Par exemple, une différence entre deux échantillons de tissus de 10.01 vs 10.09 boulettes mangées indique le premier échantillon est dissuasif et la seconde l'est pas, mais une différence de 10.3 vs 10.5 boulettes mangées peut être due à des variations de comportement entre les dosages, et le premier échantillon ne est pas nécessairement plus dissuasive que la seconde.
Un Applicat cléion de cet essai biologique est son utilisation dans bioessai fractionnement, lequel partitions successives de l'extrait brut sont testés sur les poissons d'isoler les composés chimiques responsables de l'activité d'alimentation-dissuasion 29,32-33,35-38. Une fois que la présence d'une défense chimique a été constatée, l'extrait organique brut est Chromatographie fractionnée en petits sous-ensembles de composés qui forment le mélange, et ces sous-ensembles sont alimentés à pêcher dans le même essai d'alimentation. Encore une fois, cela devrait être fait sur une base volumétrique, en utilisant "équivalents" ml d'extrait de tissus plutôt que les équivalents de masse. Comme la séparation produit, les fractions sont dosées comme meilleur une dilution en série par rapport à la concentration volumique naturel: 4 ×, 2 ×, 1 et x. Ce laps de concentrations tient compte de la réduction probable de l'activité de dissuasion qui vient de diviser les métabolites actifs sur deux ou plusieurs fractions chromatographiques ou de la perte de métabolites actifs through décomposition, réaction, ou un accessoire pour chromatographique médias. Une fois les métabolites actifs ont été isolés par fractionnement de bioessai, l'enquêteur peut les identifier en utilisant des techniques spectroscopiques standard et devrait également faire la même chose pour les fractions inactives qui peuvent avoir des métabolites secondaires. Il est tout aussi important de savoir quels métabolites secondaires sont actives dans des expériences écologiquement pertinents pour savoir qui métabolites ne sont pas 8.
Les éléments de ce mode opératoire peuvent également être utilisés pour concevoir de nouvelles techniques expérimentales. Par exemple, cet essai biologique a été adapté pour les prédateurs d'invertébrés (crabes par exemple 39 et 40 étoiles de mer), pour d'autres régions géographiques 41, et même à répondre à d'autres questions de recherche (par exemple défenses structurelles 31,34,42 et aposematism 27). Les quatre critères doivent servir de guide pour les adaptations futures de cette méthode. En résumé, cet essai biologique procédure provides une méthode plus écologique pertinent pour évaluer les défenses chimiques antiprédatrices à partir de tissus d'organismes marins. Les études utilisant cette procédure ont fait progresser notre compréhension des facteurs qui contrôlent la distribution et l'abondance des invertébrés marins sur les récifs coralliens des Caraïbes (par exemple, plus récemment, Loh et Pawlik 26) et peut informer enquêtes dans divers domaines d'enquête, y compris la pharmacologie, de la biotechnologie, et écologie évolutive.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-20 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A41220 | |
| Anhydrous Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Cryocool Heat Transfer Fluid | Fisher Scientific | 20-548-146 | For vacuum concentrator |
| Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity | MP Biomedicals | 154723 | |
| Squid mantle rings | N/A | N/A | Can be purchased at grocery store |
| Denatonium benzoate | Aldrich | D5765 | |
| 50 ml graduated centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | |
| Disposable Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Rubber bulbs for Pasteur pipets | Fisher Scientific | 03-448-24 | |
| Red bulbs for pellet delivery | Fisher Scientific | 03-448-27 | |
| 250 ml round-bottom flask | Fisher Scientific | 10-067E | |
| Scintillation vial adapter for rotavap | Fisher Scientific | K747130-1324 | |
| Weightboats | Fisher Scientific | 02-202B | |
| Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| 5 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-53 | |
| 10 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-54 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | S17302 |
References
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