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Environment

海洋生物の組織からの二次代謝産物のAntipredatory活性を評価するために魚の供給研究所バイオアッセイ

doi: 10.3791/52429 Published: January 11, 2015

Summary

このバイオアッセイは、栄養的に同等の食品マトリックスを使用して、天然の濃度での海洋生物の組織の有機抽出物からの給電抑止代謝産物の存在を評価するためのモデル捕食魚を用いる。

Introduction

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化学生態学は、化学者と生態学者のコラボレーションにより開発された。地上波化学生態学のsubdisciplineがしばらくの周りされているが、海洋化学生態学のはわずか数十年古いですが、海洋生物1-8の進化生態学と社会構造に重要な洞察を提供してきた。スキューバダイビングとNMR分光法の緊急の技術を利用して、有機化学者は急速に1970年代と1980年代9底生海洋無脊椎動物と藻類由来の新規の代謝産物を記述する出版物を多数生成した。二次代謝産物は、経験的証拠なしに新しい化合物に生態学的に重要な特性を帰さこれらの出版物の多くは、いくつかの目的を果たす必要があることを仮定する。約同時に、生態学者は、以前あちこちに知られているスキューバダイビングの出現を利用することと底生動物や植物の分布と存在量を記述したそのような浚渫などの比較的効果サンプリング方法をメートル。これらの研究者の仮定が固着し、ソフトボディの何かが化学的に捕食者10によって消費を避けるために擁護しなければならないということでした。種の存在量にそうでなければ説明的な作業だったものに経験主義を導入するための努力では、いくつかの生態毒性アッセイ11からの化学防御を外挿する開始しました。最も毒性アッセイは半アッセイ生物を死滅させるために責任の抽出物の乾燥質量濃度の後続の決定に、脊椎動物の組織の粗有機抽出物の水性懸濁液に、魚全体、または他の生物の曝露を含んでいた。しかし、毒性アッセイは、潜在的な捕食者は、自然条件の下で獲物知覚している様子をエミュレートしていない、とその後の研究では、毒性や嗜好性12-13の間には何の関係は認められません。それは、権威ある雑誌に出版物はほとんど、あるいは全くecologicaを持つ技術を使用していることは驚くべきことであるLの関連性14-15、これらの研究はまだ広く引用されている今日。これは、毒性データに基づいて、研究は16〜18を発表され続けることに注意することは、さらに憂慮すべきである。明細書に記載のバイオアッセイ法は、antipredatory化学防御を評価するために、海洋化学生態学者のための生態学的に関連したアプローチを提供するために、1980年代後半に開発されました。方法は、より生態学的に意味のある毒性データよりも嗜好性データを提供する、栄養的に同等の食品マトリックス中の天然の濃度で標的生物からの粗有機抽出物をサンプリングするために、モデル捕食者を必要とする。

海洋生物の組織のantipredatory活性を評価する一般的なアプローチは、4つの重要な基準は、(1)適切なジェネラリスト捕食者は、摂食アッセイにおいて使用されなければならない、(2)すべての極性の有機代謝産物は徹底的の組織から抽出されなければならない生物体を標的とする、(3)代謝産物をbしなければならないeは、それらを抽出した生物に見られるのと同じ体積濃度で栄養的に適切な実験食品に混入、及び(4)実験デザインと統計的アプローチは、相対的なdistastefulnessを示すために意味のある測定基準を提供する必要があります。

以下に概説する手順は、カリブ海の海洋無脊椎動物でantipredatory化学防御を評価するために特別に設計されています。この種はカリブ海のサンゴ礁に一般的であり、底生無脊椎動物19の幅広い品揃えをサンプリングすることが知られているので、私たちはモデル捕食魚として、blueheadベラ、Thalassoma bifasciatumを採用。標的生物由来の組織は、まず、抽出された食品の混合物と混合し、最終的にTのグループに提供されbifasciatumは、それらが抽出処理された食品を拒否するかどうかを観察した。この方法を用いたアッセイのデータは、海洋生物12,20-21、Lの防御的な化学に重要な洞察を提供してきたIFE履歴トレードオフ22-24、およびコミュニティ生態学25-26。

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Protocol

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注:このプロトコルのステップ3は、脊椎動物動物被験体を伴う。手順は、動物は、可能な限り最も人道的な扱いを受けるように設計されており、ノースカロライナ州ウィルミントンの大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1)組織の抽出

  1. これは二次代謝産物の体積濃度が変更されますように絞った、乾燥したアウトまたは過度に湿った水和のその自然の状態ではないです組織を使用してください。 50mlの遠心管に挿入することができる断片またはスライスに組織を切断またはチョップ。注:新鮮な組織は、いくつかのケースで使用することができるが、それは時カットを圧迫を受けない凍結組織を、切断又は切るほうが良い場合が多い。
  2. 40ミリリットルの最終体積に達するまで目盛り遠沈管にジクロロメタンの1:1混合物(DCM)およびメタノール(MeOH)で30 mlに1の組織片を追加する。移転すべてのステップを実施するようにしてください適切な換気と換気フード中の溶剤。
  3. チューブに蓋をし、それを数回転倒し、4時間の抽出期間中に繰り返し攪拌する。注:この期間中、水はMeOHで結合し、得られたメタノール:水相をDCM相から分離する。組織を交互DCMおよびMeOHにさらされる:チューブなどのエマルジョン等の水が攪拌される。
  4. 丸底フラスコにDCM抽出物を移し、低熱を使用して、ロータリーエバポレーターで乾燥するまで蒸発させ(<40℃)。最小限の溶媒を用いて20mlのシンチレーションバイアルに乾燥した抽出物を移す。ロータリーエバポレーターアダプタでバイアルを取り付け、再び弱火を使用して、ロータリーエバポレーターで蒸発乾固する(<40℃)。
    注:(1)ナット(2)、ワッシャー、および(3)ドングリナット:次のステップでは、ねじロッドの端部上に順番に以下の項目をねじ込むことによって組み立てることができる自家製圧迫器の使用を必要とする。ワッシャーは、穿孔またはいずれかでなければなりませんそれを50mlの遠心分離管の内径よりも小さくなるように嵌め込ま。
  5. 圧縮により組織から抽出媒体を絞る、水抽出:組織およびMeOHを含んで目​​盛り遠心管に戻る。 MeOHを転送:同じ丸底フラスコに、水抽出物を、冷却保存(<10℃)。
  6. 水抽出物:今、脱水組織は2から6時間の期間の第二の抽出のために水没されるまで、新たなMeOHをメタノールを含む冷却丸底フラスコに抽出転送した後、卒業した遠心管にメタノールを追加します。組織が完全に抽出されなかったことをいずれかの懸念がある場合は、2〜6時間のメタノール抽出を繰り返す。
  7. 低熱を使用して、ロータリーエバポレーターでメタノールを乾燥(<40℃)。丸底フラスコをすすぎ、MeOH中の最小体積を用いて、乾燥した非極性抽出物を含有するシンチレーションバイアルに丸底フラスコから残りの水性抽出物を移す。
  8. E真空濃縮器で弱火(<40℃)を使用して乾燥するまで水抽出物をvaporate。シンチレーションバイアルは現在、組織の10ミリリットルの総乾燥粗製の有機抽出物を含有する。密栓し、酸化を防ぐためにN 2ガ ​​スをバイアルのヘッドスペースを排気し、ストアは凍結(-20℃)。

2)食品の準備

  1. 凍結乾燥したイカマントル粉末を準備します。
    注:イカマントルは、他の底生無脊椎動物のものに匹敵する、および2.2のサブ工程の原料として使用される栄養源を提供する。
    1. 温かい脱イオン(DI)水中のイカマントルの融解凍結リングは、その後、高速ブレンダーでそれらをピューレ。
    2. 浅いクッキーシートと凍結にピューレイカマントルの薄層を注ぐ(-20℃)、次いで凍結乾燥される小さな断片に凍結されたイカピューレのシートを破る。
    3. FRの操作方法以下の凍結イカマントルピューレを凍結乾燥eezeドライヤー。
    4. 粉末を形成するために、高速ブレンダー中でイカマントルピューレの凍結乾燥された部分を粉砕する。
    5. ヒュームフードでは、回転小麦粉ふるいに粉末状のイカ外套を注ぐと微粉末から組織の大きな塊を分離するためにふるいにかける。
    6. 密封可能容器に微粉末イカ外套を転送します。酸化を防止し、凍結保存するためのN 2ガ ​​スで容器のヘッドスペースを排気する(-20℃)。
  2. 食品の混合物を準備します。
    注:必要に応じて、複数の連続した​​アッセイを実行するとき、それは〜食品の混合物の100ミリリットルを用意することが現実的である、しかしこのレシピは、より小さなボリュームにスケーリングすることができる。
    1. 3グラムアルギン酸150mlのビーカー中で脱イオン水100mlで5gの凍結乾燥したイカマントル粉末の混合物を組み合わせる。粉末が完全に水和され、混合物が均質になるまで数分間ミクロ激しく攪拌する。
      注:必要に応じて、食品着色料本STで添加することができるEP:それはむしろ追加することによって、抽出物処理混合物の色にマッチしようとするよりも、両方の処置および対照の混合物が生成されます食品混合物(抽出物処理混合物中の抽出物の天然色素をマスキング)に染料を追加する方が簡単です対照混合物に染料。緑がかった、または茶色がかった食品の色、粗抽出物中の任意の顔料をマスクすることが望ましい場合が多い。
    2. 卒業シリンジに食品の混合物の正確に10ミリリットルをロードします。このプロセスの間に気泡の混入を避けるように注意してください。
    3. 冷凍庫からの乾燥原油有機抽出物を20ミリリットルのシンチレーションバイアルを取り外します。その後ミクロとの均一な混合物にエキスをかき混ぜる、メタノールの低下や2を追加します。
    4. 20ミリリットルのシンチレーションバイアルに食品マトリックスのロードを10mlシリンジを取り出し、抽出物処理食品混合物を均質化するためにミクロでかき混ぜる。
      注:小さい増分(IEで注射器を取り出すために役立つことがあり、2ミリリットルを取り出し、均質化する場合、R。すべての10ミリリットルまでのEPEAT)が均質化されています。
  3. アッセイペレットを準備します。
    1. シリンジにエキス混合物(約1 ml)を、非常に小さなボリュームをロードし、0.25 MのCaCl 2溶液にシリンジ先端を水没。長い、スパゲッティのようなストランドを形成するために、シリンジの内容物を取り出します。
    2. 数分後、その後、かみそりの刃でガラスカッティングボード上に4ミリメートル長いペレットにそれをチョップ、硬化ストランドを削除海水をですすぐ。
    3. 繰り返しますコントロールペレットを作るために組織抽出物を含まずに2.3.1と2.3.2を繰り返します。溶剤添加のために制御する(ステップ2.2.3で扱わ混合物にメタノールを添加することを参照のこと)、溶媒の等量の制御ペレットを扱うようにしてください。陰性対照は、そのアッセイの魚を確認することが望まれる場合、給電思いとどまることができ、2 mgのmlの濃度で安息香酸デナトニウムを追加-1生食液27。

3)嗜好性バイオアッセイ

  1. 野生捕獲黄相blueheadベラと摂食アッセイを行う、Thalassomaのbifasciatumは、実験室の水槽の不透明な両面区画に3のグループに保管。
  2. ゴム球付きガラスピペットを用いて、海水のビーカーから食物ペレットを配信。注:この方法で食べ物を受け取るために魚を訓練するために数日かかる場合があります。食品の配達の前に条件刺激(水槽のガラスにピペットの例えば数回タップ)は、食物ペレットの追加を期待する魚を訓練するために役立つことがあります。
  3. スコアリングペレット。容易に魚が消費する場合は、受け入れられたペレットを考えてみましょう。彼らの口腔にそれを取るために1つ以上の魚による3回の試行の最小の後に食べていない場合は、拒否されたペレットを考えて、またはペレットは、そのような試みの後に接近され、無視されている場合。
  4. スコアリングのサンプル。注:アッセイ手順は、 図1のフローチャートとして示されている食べたがらない魚のグループ。プロトコルの任意のステップにおいて、制御ペレットはさらに考慮されない。アッセイの一回の実行の2潜在的な結果があります。サンプルは、承認または拒否されるか。
    1. 魚のグループが協力的であることを確認するために、制御ペレットで始まる。治療ペレットを提供します。魚が扱わペレットを受け入れると受け入れとして、サンプルスコア。魚が扱わペレットを拒否した場合、魚が給餌を中止しているかどうかを判断するために次の制御ペレットを提供します。魚はその後の制御ペレットを受け入れると拒否されたとして、サンプルスコア。
  5. レプリケーション。各抽出物のための魚の10の独立したグループでアッセイ手順を繰り返します。

4)評価の意義

  1. フィッシャーの正確確率検定26の修正バージョンで処理されたペレットVSコントロールの消費量の差の有意性を評価します。制御のための限界​​合計と扱わペレットが固定されているように、テストを変更します、ランダムサンプルとしてそれらの両方を処理する。注:7ペレットを食べているときには、p = 0.057を提供します。 7以上のペレットを食べている場合は、したがって、すべての抽出物は、6個以下のペレットが食べられている場合には抑止力とみなされ、口当たりている。
  2. 抽出物のグループ間の相対的な嗜好性を比較するために、各グループ内で食べられたペレットの平均数を計算します。ペレットの平均数は+標準誤差(SE)≤6を食べている場合ので、反復抽出物のグループが抑止力と考えられている6ペレットしきい値を保管してください。注意:代表的な結果では、グループ割り当ては、種であるので、複製する抽出物は、異なる個体に由来する相対嗜好性は、種間で比較することができる。

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Representative Results

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ここでは、一般的なカリブ海のスポンジの6種( 図2)については、このバイオアッセイの結果を報告する。これらのデータは、最初Pawlik によって1995年に出版された。12と共起する分類群の間で化学防衛戦略の違いを調査するために、このアプローチの力を証明している。結果は、それぞれの種のために、標準誤差(SE)+食べ食物ペレットの平均数として報告した。ほとんどないペレットはAgelasのclathrodes、アムピメドーンcompressa、及びAplysinaのcauliformisからの粗有機抽出物を用いるアッセイで食べました。これとは対照的に、 カリ膣、Geodiaのgibberosa、及びMycaleツメガエルからの抽出物で作られたペレットは容易にアッセイ12で消費された。 6未満のペレットは、最初の3種のために食べられたので、彼らはかなりの抑止力と考えられた。対照的に、第2の3種は、対照からの有意差はなかった、とあった口に合うと考えた。

図1
図1:アッセイ手順の概略は、すべての段階において、制御ペレットの拒絶反応は、アッセイ魚のセットが非協力的または満腹であり、さらに使用することができないことを示している。プロトコルは、処理されたペレットが続く魚制御ペレットの各セットを提供することによって開始されます。処理されたペレットが受け入れられた場合に受け入れ次に、サンプルが獲得される。処理されたペレットが拒否されたが、その後の制御ペレットが受け入れられた場合拒否として、サンプルが獲得される。

図2
図2:最初Pawlikが1995年に報告された自然の濃度でスポンジの粗有機抽出物を含む食物ペレットのThalassomaのbifasciatumによる消費(+ SEを意味する)、 12魚はすべての場合に、すべての10の制御ペレットを消費した。それぞれの種名の後に、反復サンプル数(各スポンジ組織の地理的に異なるサンプルの別々の抽出から複製)が指定されている。グラフ上の点線で示すように個々のアッセイのために、抽出物は、食べられたペレットの数が6以下であった場合た(p = 0.057、フィッシャーの正確確率検定を改変)抑止と考えられた。

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Discussion

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明細書に記載の手順は、海洋生物にantipredatory化学防御を評価するための比較的単純な、生態学的に関連する研究室プロトコルを提供する。ここでは、メソッドのこのセットによって満たされる重要な基準を確認してください。

(1)適切な捕食者をこの送りアッセイはblueheadベラ、Thalassoma bifasciatum、カリブ海全域サンゴ礁上で最も豊富な魚の1を採用しています。 blueheadは底生無脊椎動物19の幅広い品揃えをサンプリングすることが知られてジェネラリスト肉食動物です。ジェネラリスト捕食者は、サンゴ礁上の捕食魚の大半はジェネラリストであるため、これらの初期アッセイのための最良の選択であり、それは防御を回避する機構を進化させてきたことが専門家の捕食者とは対照的に、antipredatory防御が広く、それらに対して向けられることが予想される。シングル潜在的な捕食者を使用する化学防御の実験室での調査はである10現場条件28-33の下で潜在的な捕食者の完全な補完の応答に依存している多くの時間がかかり、複雑なフィールド実験を行った。

(2)抽出手順 、等量のジクロロメタン(DCM)およびメタノール(MeOH)での溶媒の混合物を使用して迅速に膜を可溶化し、細胞物質を脱水する、組織に浸透し、第一の組織抽出工程。組織は、この工程の後に脱水されるため、その後の工程は、MeOH中の全ての極性の残りの代謝物を抽出します。組織が完全に抽出されるまで、MeOH中の抽出を繰り返すことにより、徹底的な抽出手順を構成する。この抽出方式における小さな変化は、同じ極性の別のもの抽出溶媒の置換として、許容されるが、不適切な溶媒を使用する場合は、組織の抽出が不完全であってもよい。不適切な組織抽出手順の潜在的な落とし穴は、他の場所で詳細に考察されている<SUP> 8。

(3)実験的な食品の調製の人工食品マトリックスは、栄養価および二次代謝産物の濃度の両方における標的生物の組織をシミュレートしなければならない。これは、捕食者が摂食抑止代謝物を拒否するように使用するのと同じ感覚過程でも食品の栄養価の認識に関与している可能性が高い。低栄養価を有する食品は、化学防御のはるかに低いレベルで拒否することができ、それらの代謝産物は、組織よりも栄養の人工餌に提示されている場合には逆に、二次代謝産物のみよりも高い天然の濃度で抑止力とすることができるからそれが派生した。それは容易に入手可能であるため、粉末は、凍結乾燥したイカマントルは、測定が容易で便利な栄養代替であり、その栄養特性はすでに34を決定した。

準備中の第二配慮実験的な食品は、体積ではなく質量に基づいて行わなければならない抽出物の濃度の決定に関する。捕食者は、ウェットティッシュを食べ、そして海洋生物の組織は、含水量が大きく異なり。捕食者の観点からは、クラゲやイソギンチャクの一口は、イカやウミウシの同じ大きさの一口よりも単位乾燥質量あたりの、実質的に多くの水を含んでいるでしょう。高度に水和された組織について、単位乾燥質量あたりの代謝産物の濃度は、単位体積当たりよりもはるかに高いであろうが、ボリューム(咬傷)は生態学的に関連する尺度である。また、海洋生物の組織が原因鉱物骨格要素の非常に異なる密度を有することができる。体積代謝産物濃度の決定は、両方の問題を解決し、潜在的な捕食者による組織の消費の観点から最も関連性の尺度である。文献からの例を含むこのトピックは、他で詳細8で説明されています。

。。コンテンツ」>(4)実験デザインと統計的アプローチ適切な実験デザインとデータの統計分析は、実験の結果の違いの重要性を決定することを含む、他の科学研究費として行動アッセイ用として重要である明細書に記載の分析は簡単です:差が変更された分割表を用いて決定される。この方法は、研究者がコントロール食品8を食べていなかった実験的な捕食者を使用していないため、すべての制御食品の提供が消費されている必要があります。フィッシャーの正確確率検定の使用は、その初期から変更されているが、 12。Pawlik による使用、食べ6扱わペレットのしきい値は変更されません。長年の間、他の統計的検定は、代替として提案されているが、協力者ジェームズ·E·ブラム(数学のUNCW学科と統計との協議後に廃棄)。例えば、マクネマーの検定が提案されている、それはデータの一致したセットを欠き、分割表の1行が食べられる10コントロールペレットに固定されているため、両方のため、不適切である。

このアッセイ法は非常に明確な結果を提供しています私たちの経験にもかかわらず、それにもかかわらず、行動反応に依存しています。魚はアッセイの前に一定の期間に飢えている場合は、魚がよく与えた場合には、彼らは守備の代謝産物が活動の近閾値濃度で処理食物ペレット中に存在する場合は特に、彼らはよりも多くのの処理されたペレットを食べることがあります。これらの理由のため、摂食アッセイの結果は、過剰に解釈すべきではない。例えば、食べ1/10 9/10対ペレットの2つの組織サンプル間の違いは、最初のサンプルが抑止され、第二のではなく、食べ3/10 5/10対ペレットの差は、行動の変化に起因することができることを示しアッセイ、および第一のサンプルの間で必ずしも二以上の抑止力ではありません。

キーアプリケーションシートこのバイオアッセイのイオンは、粗抽出物の連続したパーティションは、給電抑止活動29,32-33,35-38を担当する化学化合物を分離するために魚上でテストされていることにより、バイオアッセイ誘導分画、での使用である。化学防御の存在が確認されたら、粗製有機抽出物をクロマトグラフィーにより混合物を構成する化合物のより小さなサブセットに分画され、これらのサブセットは、同じ給餌アッセイにおいて魚を供給される。繰り返しますが、これは組織抽出物の「mlの等価物」のではなく、質量同等物を使用して、体積基準の上で行ってください。 4×、2×、1×:分離が進むと、画分を最高の自然の体積濃度に連続希釈相対としてアッセイする。濃度のこのスパンは考慮に2つ以上のクロマトグラフィー画分にわたって、または活性代謝物の損失throuから活性代謝物を分割することから来ている抑止力活動の可能性の減少を取るGH分解、反応、またはクロマトグラフィー媒体への付着。活性代謝物は、バイオアッセイ誘導分別により単離されていると、研究者は、標準的な分光技術を使用してそれらを識別することができ、また、二次代謝産物を有することができる非アクティブな画分のために同じことを行う必要があります。これは、8されていない代謝物を知ることのように二次代謝産物は生態学的に関連した実験でアクティブであるかを知ることも重要です。

この手順の要素は、新しい実験手法を設計するために使用することができる。たとえば、このバイオアッセイは、他の地域41のため、無脊椎動物捕食者( 例えば、39とシースターズ40とカニ )に適応し、さらには他の研究課題( 例えば、構造の防御31,34,42と警告色27)を対処する。 4つの基準は、このメソッドの将来の適応へのガイドとして役立つはずです。要約すると、このバイオアッセイ手順PR海洋生物の組織からantipredatory化学防御を評価するためのより多くの生態学的に関連するメソッドをovides。この手順を用いた研究カリブ海のサンゴ礁での海洋無脊椎動物の分布と量を制御する因子( 例えば 、最近、楼とPawlik 26)の我々の理解を進めてきたし、薬理学などの問い合わせの多様な分野での調査に通知することができる、バイオテクノロジー、および進化生態学。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dichloromethane Fisher Scientific D37-20
Methanol Fisher Scientific A41220
Anhydrous Calcium Chloride Fisher Scientific C614-500
Cryocool Heat Transfer Fluid Fisher Scientific 20-548-146 For vacuum concentrator
Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity MP Biomedicals 154723
Squid mantle rings N/A N/A Can be purchased at grocery store
Denatonium benzoate Aldrich D5765
50 ml graduated centrifuge tube Fisher Scientific 14-432-22
20 ml scintillation vial Fisher Scientific 03-337-7
Disposable Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Rubber bulbs for Pasteur pipets Fisher Scientific 03-448-24
Red bulbs for pellet delivery Fisher Scientific 03-448-27
250 ml round-bottom flask Fisher Scientific 10-067E
Scintillation vial adapter for rotavap Fisher Scientific K747130-1324
Weightboats Fisher Scientific 02-202B
Microspatula Fisher Scientific 21-401-10
5 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-53
10 ml graduated syringe Fisher Scientific 14-817-54
Razor blade Fisher Scientific S17302

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References

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海洋生物の組織からの二次代謝産物のAntipredatory活性を評価するために魚の供給研究所バイオアッセイ
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Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).More

Marty, M. J., Pawlik, J. R. A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms. J. Vis. Exp. (95), e52429, doi:10.3791/52429 (2015).

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