Summary
Это биологический анализ использует модель хищной рыбы, чтобы оценить наличие питания, сдерживания метаболитов из органических экстрактов тканей морских организмов на природных концентраций с использованием питательно, сравнимую пищи матрицу.
Introduction
Химическая экология, разработанные в рамках сотрудничества химиков и экологов. В то время как раздел науки земного химической экологии была вокруг в течение некоторого времени, что морской химической экологии только несколько десятилетий назад, но при условии, важную информацию в эволюционной экологии и сообщества структуры морских организмов 1-8. Воспользовавшись тем, что возникающих технологий подводного плавания и ЯМР-спектроскопии, химики-органики быстро породил множество публикаций, описывающих новые метаболитов из донных морских беспозвоночных и водорослей в 1970-х и 1980-х годов 9. Если предположить, что вторичные метаболиты должны служить какой-то цели, многие из этих публикаций, приписываемых экологически важных свойства новых соединений без эмпирического доказательства. Примерно в то же время, экологи также воспользовавшись появлением подводное плавание и описания распределений и изобилие донных животных и растений, ранее известных сюдам относительно неэффективные методы отбора проб, например дноуглубительных работ. Предположение этих исследователей в том, что ничего сидячие и мягкотелые должны быть химически защищена, чтобы избежать потребления хищниками 10. В попытке ввести эмпиризма, что было иначе описательный работа по видам распространенности, некоторые экологи начали экстраполяции химической защиты от анализов токсичности 11. Большинство анализов токсичности участие экспозицию целая рыба или другие организмы в водной суспензии сырых органических экстрактов беспозвоночных тканей, с последующим определением сухих массовых концентраций экстрактов, ответственных за убийство половиной анализа организмов. Тем не менее, токсичность анализы не подражать манеру, в которой потенциальные хищники воспринимают добычу в естественных условиях, а последующие исследования не обнаружили никакой связи между токсичностью и вкусовых 12-13. Удивительно, что публикации в престижных журналах использовали методы, имеющие мало или вообще не Ecológicaл актуальность 14-15, и что эти исследования все еще широко цитируется сегодня. Это еще более тревожный отметить, что исследования, основанные на данных о токсичности продолжают издаваться 16-18. Метод биоанализ описано здесь был разработан в конце 1980-х годов, чтобы обеспечить экологически соответствующую подход к морской химических экологов оценить antipredatory химической защиты. Метод требует модель хищника попробовать сырой органический экстракт из целевого организма в естественной концентрации в питательной ценности, сравнимой пищевой матрицы, обеспечивая вкусовые данные, которые являются более экологически значимым, чем данные о токсичности.
Общий подход к оценке antipredatory деятельность тканях морских организмов включает в себя четыре важных критериев: (1) соответствующая широкого хищник должен использоваться в кормлении анализов, (2) органические метаболиты все полярности должна быть исчерпывающим, извлеченный из ткани организма-мишени, (3) метаболиты должны бе смешивают в соответствующей питательной ценности экспериментальной пищи, в то же объемной концентрации, как обнаружено в организме, из которого они были извлечены, и (4) опытно-конструкторских и статистический подход должен обеспечить смысл метрики указывают относительную distastefulness.
Процедура, описанная ниже, предназначена специально для оценки antipredatory химической защиты в Карибском морских беспозвоночных. Мы используем bluehead хейлин, Thalassoma bifasciatum, в качестве образца хищных рыб, потому что этот вид встречается на Карибских коралловых рифов и, как известно попробовать широкий ассортимент донных беспозвоночных 19. Ткань из организма-мишени сначала экстрагируют, а затем в сочетании с пищевой смеси, и, наконец, предложено групп Т. bifasciatum наблюдать отказаться ли они извлекать обработанные пищевые продукты. Аналитические данные, используя этот метод предоставили важную информацию в оборонительной химии морских организмов 12,20-21, лИстория IFE компромиссы 22-24, и экологии сообществ 25-26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3 этого протокола включает позвоночных предметы животного. Процедура была разработана таким образом, чтобы животные получали наиболее гуманное обращение возможно и был одобрен уходу и использованию комитета за животными (IACUC) при Университете Северной Каролины Уилмингтон мимо.
1) Ткань Добыча
- Используйте ткань, которая в своем естественном состоянии гидратации и не сдавливается, Сухие или чрезмерно влажным, так как это приведет к изменению объемной концентрации вторичных метаболитов. Нарезать на куски ткани или кусочков, которые могут быть вставлены в 50 мл центрифужную пробирку. Примечание: свежей ткани могут быть использованы в некоторых случаях, но это часто лучше, чтобы нарезать замороженной ткани, которое не подлежит сжатию при разрезании.
- Добавить кусочки ткани с 30 мл 1: 1 смеси дихлорметана (DCM) и метанола (MeOH) в градуированной центрифужной пробирке до конечного объема 40 мл достигается. Будьте уверены, чтобы провести все этапы, связанные с переходомрастворитель в вытяжку с достаточной вентиляцией.
- Закройте пробирку крышкой и перевернуть ее несколько раз, а затем агитировать повторно в течение периода извлечения 4 ч. Примечание: В течение этого периода, вода соединяется с MeOH и полученный метанол: водная фаза отделяется от фазы DCM. Ткань попеременно подвергается воздействию ДХМ и MeOH: вода в виде эмульсии в пробирки перемешивают.
- Передача экстракт DCM в круглодонную колбу и упаривают досуха на роторном испарителе с использованием медленном огне (<40 ° С). Используя минимальное растворитель, передавать высушенного экстракта в сцинтилляционный флакон 20 мл. Установить флакон с помощью роторного испарителя адаптера и снова выпаривают досуха на роторном испарителе с использованием медленном огне (<40 ° С).
Примечание: следующий шаг требует использования самодельной сжатия инструмент, который может быть собран путем завинчивания следующие пункты в последовательном порядке на конец резьбового стержня: (1) гайкой (2) Стиральная машина и (3) желудь гайки. Машина должна быть либо перфорирована илиустановлены таким образом, что она меньше, чем внутренний диаметр в 50 мл центрифужную пробирку. - Возвращаясь к градуированной центрифужной пробирке, содержащей ткани и МеОН: водный экстракт, выжать экстракционной среды из ткани в результате сжатия. Передача МеОН: водный экстракт с тем же круглодонную колбу и хранить охлажденной (<10 ° С).
- Добавить МеОН в градуированной центрифужной пробирке до теперь обезвоженной ткани погружают на второй экстракции 2 до 6 продолжительности ч, а затем передать новый МеОН извлечь к охлажденной круглодонную колбу, содержащую метанол: водный экстракт. Если есть какие-либо опасения, что ткань не была полностью извлечена, повторите от 2 до 6 ч добычу MeOH.
- Высушите MeOH на роторном испарителе, используя слабом огне (<40 ° C). Передача оставшийся водный экстракт из круглодонную колбу в сцинтилляционный флакон, содержащий высушенный неполярный экстракт, используя минимальный объем метанола, чтобы промыть колбу с круглым дном.
- Еvaporate водного экстракта досуха с использованием слабом огне (<40 ° C) на вакуумном концентраторе. Сцинтилляционный флакон теперь содержит общую сухую сырой органический экстракт 10 мл ткани. Эвакуировать из головы пространство флакона с N 2 газа для предотвращения окисления, плотно прилегают и хранить замороженные (-20 ° C).
2) Приготовление блюд
- Подготовка замораживания-сушеных кальмаров мантии порошок.
Замечание: Squid мантии служит источником питания, который сопоставим с другими донными беспозвоночными, и будет использоваться в качестве ингредиента в подэтапы 2,2.- Размораживайте кольца кальмаров мантии в теплой деионизированной (DI) водой, а затем протрите их в высокоскоростной смеситель.
- Налейте тонкий слой пюре из кальмаров мантии на мелкой листа и замораживания (-20 ° C) печенья, затем перерыв лист замороженного кальмара пюре на мелкие кусочки, чтобы быть лиофилизированы.
- Лиофилизации замороженного кальмара мантии пюре По итогам работы процедур FREeze-осушитель.
- Распылить лиофилизированные кусочки кальмара мантии пюре в высокоскоростном смесителе с образованием порошка.
- В вытяжном шкафу, залить порошкообразного кальмара мантию во вращательное муки сито и просеять, чтобы отделить большие куски ткани из тонкого порошка.
- Передача тонкий порошок кальмар мантию в герметичный контейнер. Эвакуировать из головы пространство контейнера с N 2 газа, чтобы предотвратить окисление и сохранить в замороженном состоянии (-20 ° C).
- Готовить пищу смеси.
Примечание: При выполнении нескольких последовательных анализов, целесообразно готовить ~ 100 мл пищевой смеси, однако этот рецепт может быть расширена до меньших объемах, если это необходимо.- Зерноуборочный смесь 3 г альгиновой кислоты и 5 г высушенных вымораживанием кальмара мантии порошка с 100 мл дистиллированной воды в химическом стакане объемом 150 мл. Перемешивают энергично с microspatula в течение нескольких минут, пока порошок не является полной гидратации и смесь однородна.
Примечание: Если необходимо, пищевой краситель может быть добавлен в этом стEP: это проще добавить краситель пищевой смеси, которая будет генерировать и лечил и смеси управления (маскировка естественный пигмент экстракта в экстракте обработке смеси), а не пытаться соответствовать цвету экстракта обрабатывают смесью, добавив краситель с контрольной смесью. Зеленоватого или коричневатого пищевой краситель часто желательно, чтобы замаскировать любые пигменты в неочищенного экстракта. - Загрузка ровно 10 мл пищевой смеси в градуированный шприц. Будьте осторожны, чтобы избежать включения пузырьков воздуха во время этого процесса.
- Снимите 20 мл сцинтилляционный флакон с сухим сырой органический экстракт из морозильника. Добавить каплю или две метанола, затем добавьте экстракт в виде гомогенной смеси с microspatula.
- Извлеките загруженную 10 мл шприц пищевой матрицы в сцинтилляционный флакон 20 мл и перемешать с microspatula для гомогенизации экстракт обработанного пищевого смеси.
Примечание: Это может помочь извлечь шприц с меньшим шагом (т.е. извлечь 2 мл и гомогенизации, затем R.EPEAT, пока все 10 мл были гомогенизировали).
- Зерноуборочный смесь 3 г альгиновой кислоты и 5 г высушенных вымораживанием кальмара мантии порошка с 100 мл дистиллированной воды в химическом стакане объемом 150 мл. Перемешивают энергично с microspatula в течение нескольких минут, пока порошок не является полной гидратации и смесь однородна.
- Подготовка анализа гранул.
- Загрузка очень маленький объем экстракта смеси (~ 1 мл) в шприц, и погрузить наконечник шприца в растворе 0,25 М CaCl 2. Извлечь содержимое шприца, чтобы сформировать длинный, спагетти, как прядь.
- Через несколько минут, снимите затвердевший прядь, рубить его на 4 мм в длину гранул на стекло разделочная доска с бритвенным лезвием, затем смойте в морской воде.
- Повторите шаги 2.3.1 и 2.3.2, не включая экстракт ткани, чтобы сделать контроля гранул. Обязательно для лечения управления гранул с эквивалентным объемом растворителя (см добавление МеОН в обработанной смеси на стадии 2.2.3) для контроля того растворителей. Если отрицательный контроль желательно, чтобы подтвердить, что анализ рыба может быть удержаны от кормления, добавьте Денатониум бензоат в концентрации 2 мг мл -1 в смеси сырых продуктов 27.
3) ВкусовыеБиопробы
- Выполните кормления анализов с пойманной желто-фазы bluehead губанов, Thalassoma bifasciatum, держали в группах по три в непрозрачной односторонних отсеков лабораторного аквариумах.
- Доставка пищевых гранул из химическом стакане морской воды с помощью стеклянной пипетки с резиновой грушей. Примечание: Это может занять несколько дней, чтобы обучить рыбу получить пищу таким образом. Условного стимула (например, несколькими нажатиями пипетки на стекле аквариума), который предшествует доставку продовольствия может быть полезно для обучения рыбу ожидать добавление пищевых гранул.
- Забив гранул. Рассмотрим осадок принятым, если быстро поглощается рыбами. Рассмотрим осадок отклонены, если не ел после как минимум трех попыток одним или несколькими рыбе, чтобы взять ее в свою полости рта, или если осадок подошел и игнорируются после одной такой попытки.
- Скоринг образцы. Примечание: процедура анализа изображается в виде блок-схемы на рисунке 1 группы рыб, которые отказываются есть.управления гранулы на любом этапе в протоколе не рассматриваются. Есть два потенциальных результатов одного прогона анализа: Образец приняты или отклонены.
- Начните с контрольной гранулы подтвердить, что группа рыбы кооператива. Предложение обработанного осадка. Если рыба принять обработанного осадка, оценка образца, как принято. Если рыба отклонить обработанного осадка, предлагают последующее осадок управления, чтобы определить, была ли рыба перестала подавать. Если рыба принять последующий контроль осадок, оценка образца отклоненным.
- Репликация. Повторите процедуру анализа с десяти независимых групп рыб для каждого экстракта.
4) оценка значимости
- Оценка значимости различий в потреблении контроля против обработанных гранул с модифицированной версии точного критерия Фишера 26. Изменить тест, так что маргинальные суммы для контрольных и обработанных гранулы фиксированной, Рассматривая их как в виде случайных выборок. Примечание: Это обеспечивает р = 0,057 при 7 гранулы едят; Следовательно, любая экстракт считается сдерживающим фактором, если 6 или меньше гранулы едят, и приемлемым, если 7 или более гранулы едят.
- Для сравнения относительной вкусовой привлекательности среди групп экстрактов, вычислить среднее количество гранул, съеденного в пределах каждой группы. Хранить порог в 6 таблеток, так группа повторных экстрактов считаются сдерживающим фактором, если среднее количество гранул ел + стандартная ошибка (SE) ≤6. Примечание: В представительных результатов, назначение группа видов, так копируют экстракты приходят из разных людей, и относительно вкусовых качеств можно сравнить между видами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы сообщаем результаты этого биотестирования для шести видов общих Карибского бассейна губки (рис 2). Эти данные первоначально были опубликованы в 1995 году Павлика и др. 12 и продемонстрировать силу этого подхода для обследования различия в химических оборонной стратегии между сопутствующими таксонов. Результаты были представлены в виде среднего числа пищевых гранул едят + стандартная ошибка (SE) для каждого вида. Почти нет гранулы не были съедены в анализах с грубыми органическими экстрактами из Agelas clathrodes, Amphimedon COMPRESSA и Aplysina cauliformis. В отличие от этого, гранулы, изготовленные с экстрактами из Callyspongia влагалищной, Geodia gibberosa и Микале Laevis охотно потребляется в анализе 12. Меньше чем через шесть гранулы были съедены в течение первых трех видов, поэтому они считались значительно сдерживающим фактором. В отличие от этого, второй три вида существенно не отличались от контрольных, и былисчитается приемлемым.
Рисунок 1:. Схема процедуры анализа На всех стадиях, отказ от управления гранул показывает, что этот набор для анализа рыбы отказываться от сотрудничества насытившись и не могут быть использованы в дальнейшем. Протокол начинается, предлагая каждый набор рыбы управления гранул с последующим обработанной таблетки. Далее, если рассматривать осадок принято образец оценивали как принято. Если рассматривать осадок отклонены, но последующий контроль осадок принято, образец забил отклоненным.
Рисунок 2: Потребление Thalassoma bifasciatum пищевых гранул (средний + SE), содержащий грубые органические экстракты губок в природных концентрациях, впервые опубликованы в 1995 году Павлика
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Процедура описана здесь, обеспечивает относительно простой, экологически соответствующий лабораторный протокол для оценки antipredatory химические защитные в морских организмов. Здесь мы рассмотрим важные критерии, которые удовлетворяют этим набором методов:
(1) Подходит хищник. Это кормление анализ использует bluehead хейлин, Thalassoma bifasciatum, один из самых распространенных рыб на коралловых рифах, в странах Карибского бассейна. Bluehead является универсалом хищник, как известно, отведать широкий ассортимент донных беспозвоночных 19. Универсал хищники лучший выбор для этих первых анализах, потому что большинство хищных рыб на рифах являются универсалами, и это можно было бы ожидать, что antipredatory защиты будет широком смысле направлено против них, в отличие от специализированных хищников, которые, возможно, развили механизмы, чтобы обойти защиту. Лабораторные исследования химических обороны с помощью одного потенциального хищника являютсядесять последовали еще много времени и сложный полевых экспериментов, которые полагаются на ответах полным комплектом потенциальных хищников в полевых условиях 28-33.
(2) процедуры экстракции. На первом этапе экстракции ткани, который использует смесь растворителей из равных частей дихлорметана (DCM) и метанола (МеОН), быстро проникает ткани, солюбилизации мембраны и дегидратации клеточного материала. Ткань обезвоживается после этого шага, так что последующие стадии извлечения остальных метаболитов всех полярностей в МеОН. Повторяя добычу в метаноле до тех пор, ткань полностью извлечена, не представляют собой исчерпывающий процедуру экстракции. Небольшие вариации на этой схеме экстракции являются приемлемыми, такие как замещение одной экстракции растворителем для другого одной и той же полярности, но экстракции тканей может быть неполной, если используется нецелесообразно растворитель. Потенциальные ловушки процедур извлечения неадекватное ткани подробно обсуждаются в других <SUP> 8.
(3) Получение экспериментальной пищи. Искусственный пищи матрица должна имитировать ткани организма-мишени как в питательности и концентрации вторичных метаболитов. Вполне вероятно, что одни и те же сенсорные процессы, что хищники используют, чтобы отклонить кормления сдерживающим метаболиты также участвуют в восприятии пищевого качества продуктов питания. Продукты с низким качеством питания, могут быть отклонены при гораздо более низких уровнях химической защиты, и, наоборот, вторичные метаболиты могут быть только сдерживающим фактором при более высоких, чем естественный концентраций, если эти метаболиты представлены в искусственном пищи, которая более питательны, чем ткани, из которой оно было получено. Порошок, подвергают сублимационной сушке кальмара мантии является полезным питательных заменой, поскольку он легко доступен, легко измерить, и его питательные характеристики уже определены 34.
Второе соображение в подготовке экспериментальная еда относится к определению концентрации экстракта, который должен быть выполнен на основе объема, а не массы. Хищники едят влажную ткань, а ткани морских организмов сильно различаются по содержанию воды. С точки зрения хищника, укус медузы или актинии будет содержать значительно больше воды на единицу сухой массы, чем того же размера укуса кальмара или морской слизняк. Для сильно гидратированных тканей, концентрация метаболита в расчете на единицу сухой массы были бы гораздо выше, чем на единицу объема, но объем (укусы) является мерой, которая является экологически актуальными. Кроме того, ткани морских организмов могут иметь очень разные плотности из-за минеральных элементов скелета. Определение концентрации метаболита по объему решает обе проблемы и наиболее актуальными мера с точки зрения потребления ткани со стороны потенциального хищника. Эта тема, в том числе примеры из литературы, подробно обсуждается в другом месте 8.
.. Содержание "> (4) опытно-конструкторских и статистический подход Соответствующее опытно-конструкторских и статистический анализ данных являются важными для поведения анализа, как для любого другого научных исследований, которые включает в себя определение значимости различий в экспериментальных результатов анализа, описанного здесь проста: различия определяются с помощью модифицированного таблицу сопряженности. Метод требует, чтобы все предложения по контролю пищевых продуктов потребляется, потому что следователь не будет использовать экспериментальные хищников, которые не кормили на контрольных продуктов 8. Хотя использование точного критерия Фишера была изменена от своего первоначального использовать при Павлика и др 12., пороговое значение 6, обработанных гранул едят остается неизменной. На протяжении многих лет, другие статистические тесты были предложены в качестве заменителей, но отказаться после консультаций с сотрудником Джеймс Э. Блюм (UNCW кафедра математики и статистики ). Например, тест Макнемара была предложил,но неуместно, и потому, что ему не хватает согласованный набор данных, и потому, что одна строка таблицы сопряженности фиксируется на 10 контрольных гранул едят.Несмотря нашего опыта, что этот метод анализа обеспечивает удивительно ясные результаты, он тем не менее опирается на поведенческой реакции. Если рыба голодали в течение периода времени до анализа, они могут съесть больше, получавших гранул, чем они были бы, если рыба были хорошо накормлены, особенно если оборонительный метаболит присутствует в обработанных пищевых гранул в ближнем пороговой концентрации деятельности. По этим причинам, результаты кормления анализов не должна быть выше толкование. Например, разница между двумя тканевыми образцами 1/10 против 9/10 гранул ели показывает первый образец является сдерживающим фактором, а второй нет, но разница в 3/10 против 5/10 гранул ели может быть связано с поведенческой изменчивости между анализов, и первый образец не обязательно более сдерживающим фактором, чем второй.
Ключ Применение вионный биоанализа этого является его использование в биопроб наведением фракционирования, в результате чего последовательные разбиения сырого экстракта проверяются на рыбу, чтобы изолировать химических соединений, ответственных за подачу-сдерживания активности 29,32-33,35-38. После того, как присутствие химической защиты было установлено, неочищенный органический экстракт фракционируют с помощью хроматографии на более мелкие подмножества соединений, входящих в состав смеси, и эти подмножества подают в рыбу в том же анализе кормления. Опять же, это должно быть сделано в объемном основе, используя "ML эквиваленты" экстракт ткани, а не массовых эквивалентов. Как разделение происходит, фракции анализировали, лучше всего в качестве серийных разведений по отношению к природной объемной концентрации: 4 ×, 2 ×, 1 ×, и. За этот промежуток концентрации принимает во внимание возможные сокращения сдерживания активности, что исходит от разделения активных метаболитов в течение двух или более хроматографических фракций или из-за потери активных метаболитов throuGH разложение, реакция, или привязанность к хроматографическому СМИ. После того, как активные метаболиты были выделены биотестирования наведением фракционирования, следователь может выявить их с помощью стандартных спектроскопических методов, а также должны сделать то же самое для неактивных фракций, которые могут иметь вторичные метаболиты. Не менее важно знать, какие вторичные метаболиты являются активными в экологически соответствующих экспериментов, чтобы узнать, какие метаболиты не 8.
Элементы этой процедуры также могут быть использованы для разработки новых экспериментальных методов. Например, это биологический анализ был адаптирован для беспозвоночных хищников (например, крабы 39 и Seastars 40), из других географических регионах 41, и даже для решения других вопросов исследования (например, структурные обороны 31,34,42 и aposematism 27). Четыре критерия, должны служить в качестве руководства для будущей адаптации этого метода. В целом, это биологический анализ процедура прovides более экологически актуальные метод оценки antipredatory химической защиты из тканей морских организмов. Исследования с использованием этой процедуры расширили наше понимание факторов, которые контролируют распределение и численность морских беспозвоночных на Карибах коралловых рифов (например, совсем недавно, лох и Pawlik 26), и может информировать исследования в различных областях исследования, в том числе фармакологии, биотехнологии, и эволюционной экологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | D37-20 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A41220 | |
| Anhydrous Calcium Chloride | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Cryocool Heat Transfer Fluid | Fisher Scientific | 20-548-146 | For vacuum concentrator |
| Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity | MP Biomedicals | 154723 | |
| Squid mantle rings | N/A | N/A | Can be purchased at grocery store |
| Denatonium benzoate | Aldrich | D5765 | |
| 50 ml graduated centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 20 ml scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-7 | |
| Disposable Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Rubber bulbs for Pasteur pipets | Fisher Scientific | 03-448-24 | |
| Red bulbs for pellet delivery | Fisher Scientific | 03-448-27 | |
| 250 ml round-bottom flask | Fisher Scientific | 10-067E | |
| Scintillation vial adapter for rotavap | Fisher Scientific | K747130-1324 | |
| Weightboats | Fisher Scientific | 02-202B | |
| Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-10 | |
| 5 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-53 | |
| 10 ml graduated syringe | Fisher Scientific | 14-817-54 | |
| Razor blade | Fisher Scientific | S17302 |
References
- Paul, V. J., ed, Ecological roles of marine natural products. , Comstock Publishing. Associates: Ithaca, N.Y. (1992).
- Pawlik, J. R. Marine invertebrate chemical defenses. Chemical Reviews. 93 (5), 1911 (1993).
- Hay, M. E. Marine chemical ecology: what's known and what's next. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 44 (5), 476-476 (1996).
- McClintock, J. B., Baker, B. J. Marine Chemical Ecology. , CRC Press. Boca Raton, Fla. (2001).
- Amsler, C. D. Algal Chemical Ecology. , Springer. New York. (2008).
- Hay, M. E. Marine chemical ecology: Chemical signals and cues structure marine populations, communities, and ecosystems. Annual Review of Marine Science. 1, 193-212 (2009).
- Pawlik, J. R. The chemical ecology of sponges on Caribbean reefs: Natural products shape natural systems. BioScience. 61 (11), 888 (2011).
- Pawlik, J. R. Antipredatory Defensive Roles of Natural Products from Marine Invertebrates. Handbook of Marine Natural Products. , 677-710 (2012).
- Pawlik, J. R., Amsler, C. D., Ritson-Williams, R., McClintock, J. B., Baker, B. J., Paul, V. J. Marine Chemical Ecology: A Science Born of Scuba. Research and Discoveries: The Revolution of Science through Scuba. 39, 53-69 (2013).
- Randall, J. E., Hartman, W. D. Sponge-feeding fishes of the West Indies. Marine Biology. 1, 216-225 (1968).
- Bakus, G. J., Green, G. Toxicity in sponges and holothurians — geographic pattern. Science. 185, 951-953 (1974).
- Pawlik, J. R., Chanas, B., Toonen, R. J., Fenical, W. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish. 1. Chemical deterrency. Marine Ecology Progress Series. 127, 183-194 (1995).
- Schulte, B. A., Bakus, G. J. Predation deterrence in marine sponges — laboratory versus field studies. Bulletin of Marine Science. 50, 205-211 (1992).
- Jackson, J. B. C., Buss, L. Allelopathy and spatial competition among coral reef invertebrates. Proceedings of the National Academy of Sciences. 72, 5160-5163 (1975).
- Bakus, G. J. Chemical defense mechanisms on the great barrier reef. Australia. Science. 211, 497-499 (1981).
- Gemballa, S., Schermutzki, F. Cytotoxic haplosclerid sponges preferred: a field study on the diet of the dotted sea slug Peltodoris atromaculata (doridoidea: nudibranchia). Marine Biology. 144, 1213-1222 (2004).
- Voogd, N. J., Cleary, D. F. R. Relating species traits to environmental variables in Indonesian coral reef sponge assemblages. Marine and Freshwater Research. 58, 240-249 (2007).
- Mollo, E., et al. Factors promoting marine invasions: a chemolecological approach. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 4582-4586 (2008).
- Randall, J. E. Food habits of reef fishes of the West Indies. Studies in Tropical Oceanography. 5, 665-847 (1967).
- O'Neal, W., Pawlik, J. R. A reappraisal of the chemical and physical defenses of Caribbean gorgonian corals against predatory fishes. Marine Ecology Progress Series. 240, 117-126 (2002).
- Hines, D. E., Pawlik, J. R. Assessing the antipredatory defensive strategies of Caribbean non-scleractinian zoantharians (Cnidaria): is the sting the only thing. Marine Biology. 159 (2), 389-398 (2012).
- Walters, K. D., Pawlik, J. R. Is there a trade-off between wound-healing and chemical defenses among Caribbean reef sponges. Integrative and Comparative Biology. 45 (2), 352-358 (2005).
- Leong, W., Pawlik, J. R. Evidence of a resource trade-off between growth and chemical defenses among Caribbean coral reef sponges. Marine Ecology Progress Series. 406, 71-78 (2010).
- Leong, W., Pawlik, J. R. Comparison of reproductive patterns among 7 Caribbean sponge species does not reveal a resource trade-off with chemical defenses. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 401 (1-2), 80-84 (2011).
- Pawlik, J. R., Loh, T. -L., McMurray, S. E., Finelli, C. M. Sponge Communities on Caribbean Coral Reefs Are Structured by Factors That Are Top-Down, Not Bottom-Up. PLoS ONE. 8 (5), e62573 (2013).
- Loh, T. -L., Pawlik, J. R. Chemical defenses and resource trade-offs structure sponge communities on Caribbean coral reefs. Proceedings of the National Academy of Science. 111, 4151-4156 (2014).
- Miller, A. M., Pawlik, J. R. Do coral reef fish learn to avoid unpalatable prey using visual cues. Animal Behaviour. 85, 339-347 (2013).
- Pawlik, J. R., Fenical, W. A re-evaluation of the ichthyodeterrent role of prostaglandins in the Caribbean gorgonian coral, Plexaura homomalla. Marine Ecology Progress Series. 52, 95-98 (1989).
- Fenical, W., Pawlik, J. R. Defensive properties of secondary metabolites from the Caribbean gorgonian coral Erythropodium caribaeorum. Marine Ecology Progress Series. 75, 1-8 (1991).
- Pawlik, J. R., Fenical, W. Chemical defense of Pterogorgia anceps, a Caribbean gorgonian coral. Marine Ecology Progress Series. 87, 183-188 (1992).
- Chanas, B., Pawlik, J. R. Does the skeleton of a sponge provide a defense against predatory reef fish. Oecologia. 107 (2), 225-231 (1996).
- Chanas, B., Pawlik, J. R., Lindel, T., Fenical, W. Chemical defense of the Caribbean sponge Agelas clathrodes (Schmidt). Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 208 (1-2), 185-196 (1997).
- Wilson, D. M., Puyana, M., Fenical, W., Pawlik, J. R. Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes. Journal of Chemical Ecology. 25 (12), 2811-2823 (1999).
- Chanas, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality. Marine Ecology Progress Series. 127 (1), 195-211 (1995).
- Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa. Journal of Natural Products. 58 (5), 647-652 (1995).
- Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., Köck, M. Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).
- Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus. Natural Product Letters. 15 (4), 275-285 (2001).
- Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators. Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).
- Waddell, B., Pawlik, J. R. Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs. Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).
- Waddell, B., Pawlik, J. R. Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars. Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).
- Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense. Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).
- Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67 (2005).
