Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.
Honungsbin få näring från pollen de samlar in och förvara i kupan som beebread. Vi utvecklade metoder för att kontrollera pollenkällan som bina samlar och konvertera till beebread genom att placera kolonier i en specialbyggd sluten flygområdet. Metoder har utvecklats för att analysera protein och aminosyrakompositionen för pollen och beebread. Vi beskriver också hur konsumtionen av beebread mättes och metoder som används för att bestämma vuxna arbetsbin bee hemolymph protein titrar efter utfodring på beebread för 4, 7 och 11 dagar efter uppkomst. Metoder tillämpades för att bestämma om genotyp påverkar omvandlingen av pollen att beebread och den ränta som bin konsumera och skaffa protein från den. Två underarter (europeiska och Africanized honungsbin, EHB och AHB respektive) försågs med samma pollenkällan. Baserat på de utvecklade metoder, beebread gjorts av båda underarterna hade lägre proteinkoncentrationer och pH-värden än pollen. I allmänhet aminosyra concentra i beebread fattas av EHB eller AHB var liknande och inträffade vid högre nivåer i beebread än i pollen. Både AHB och EHB konsumeras betydligt mer av beebread gjorts av AHB än genom EHB. Även EHB och AHB konsumeras liknande mängder av varje typ av beebread, hemolymfa proteinkoncentrationer i AHB var högre än i EHB. Skillnader i protein förvärvet mellan AHB och EHB kan återspegla miljö anpassningar som avser den geografiska region där varje underarter utvecklats. Dessa skillnader skulle kunna bidra till en framgångsrik etablering av AHB populationer i den nya världen på grund av effekterna på yngeluppfödning och kolonitillväxt.
Näring spelar en grundläggande roll i hälsa och vigör honung bisamhällen och deras etablering som befolkningar. Näringsämnen från livsmedel ger energi och de biokemiska komponenter som behövs för kull uppfödning, värmereglering, födosök och immunsvar. För honung bisamhällen, de näringsämnen som behövs för att växa kolonipopulationer och bibehålla sin hälsa kommer från nektar och pollen. Nectar ger kolhydrater och pollen levererar återstående kostkrav såsom protein, lipider, vitaminer och mineraler en.
Arter av honungsbin kan variera i näringsmässigt baserade koloni nivå parametrar såsom arbetstagare livslängd, barnaskara uppfödning och mekanismer för social immunitet 2-6. Dessa skillnader kan vara kopplad till hur mat, i synnerhet pollen bearbetas av kolonin och digererades i individer. Pollen lagras i kam celler och genom mikrobiellt medierad mjölksyrajäsning är kemiskt ändras <sup> 10/7. Den fermenterade pollen kallas beebread. Det kan finnas genotypiska skillnader mellan underarter i deras förmåga att skaffa näring från pollen de samlar in och lagra och detta kan påverka koloni tillväxt och överlevnad. Genotypiska effekter på livsmedelsförädling och näringsförvärvs har dokumenterats i andra organismer som orsakar vissa individer att få mer näring och kalorier än andra samtidigt som den förbrukar samma mat 11-14.
Här beskriver vi metoder som används för att jämföra sammansättningen och konsumtion av beebread tillverkade av olika underarter av honungsbin. Metoder för att mäta de resulterande hemolymph protein titrar i arbetstagare bin också beskrivs. Tidigare studier om näringssammansättning beebread gjordes med europeiska honungsbin (EHB) 10,15,16. Det kan dock finnas skillnader i beebread görs av bin av olika underarter även när de livnär sig på samma pollen. EHB och AHB jämfördes eftersom dessa subspecies har tydliga beteendemässiga och fysiologiska skillnader som kan ha samband med bearbetning av livsmedel och näringsämnen förvärvet 17. Några av de mest anmärkningsvärda skillnaderna är att AHB samla in och konsumerar mer pollen än EHB och verkar för att omvandla det lättare i kull 18. AHB kolonier har högre swarming hastigheter än EHB och avvika när livsmedelsresurser blir begränsade 19-23. Annars avviker är sällsynt i EHB. AHB har också högre ämnesomsättning än EHB 24. Närings grunden för skillnader i kolonin nivå mellan EHB och AHB kan vara relaterat till graden av pollen insamling och även till dess näringsinnehåll (t.ex., aminosyror och protein) efter det omvandlas till beebread. Beebread konsumtion och den resulterande protein förvärvet kan också spela en roll i skillnader i koloni nivå mellan EHB och AHB. Med hjälp av utvecklade metoder, EHB och AHB gjorde beebread från samma pollenkällan. Den beebread matades sedan tillbaka till bin av each underarter och kan avgöra om bin förvärva protein från beebread på ett sätt utmärkande för deras underarter eller till källan av beebread.
Med användning av metoder som beskrivits ovan, fann vi att beebread gjorts av AHB förbrukades i större mängder av både AHB och EHB. Även EHB och AHB konsumeras liknande mängder av varje typ av beebread, AHB hade högre hemolymph protein titrar. Iakttagelser baserade på våra metoder liknade tidigare rapporter där hemolymph proteinnivåer i AHB var högre än i EHB även om båda matades samma dieterna 26. Genom att mäta förbrukningen av EBB och ABB, som konsumerades i olika takt från både EHB och AHB, bestämdes det att hemolymph proteinkoncentrationen i varje underarter inte kunde höjas genom att öka livsmedelskonsumtion. Det verkar finnas en platå för hemolymph proteinkoncentration hos arbetare sjuksköterska bee ålder och att börvärdet för platån är högre i AHB än EHB.
Det finns flera viktiga förutsättningar för att etablera kolonier för beebread produktion som kommer att optimera graden av pollen lagring. Först, colonies behöver ramar med öppen grubbla. Utan öppen kull på foder, kommer arbetarna inte samla mycket pollen. För det andra måste kolonin vara queenless så ingen ytterligare yngel produceras. Brood uppfödning kräver stora mängder pollen, och endast överskotts pollen lagras. I de små kolonier etablerade i EFA, skulle det inte finnas lite pollen som ska lagras som beebread om avels områden expanderar så kolonier måste vara queenless. Slutligen, för beebread göras, pollen måste uppbäras corbicular belastningar och lagras i kam-celler. Om pollen samlas i pollenfällor måste det slipas till ett fint pulver innan anspråket framställs mot bina så att de kan hämta det som corbicular laster.
Metoderna för att mäta förbrukningen av beebread genererade kvalitativa snarare än absoluta beräkningarna. Den enda konsumtionen som räknades var när cellerna helt tömts på bibröd. En mer exakt uppskattning av den totala bibröd förbrukningen kan erhållas genom att ta bort biet bread från cellerna och göra det till en bulle som kunde vägas före och efter studieperioden. Men vi ville hålla bibröd i cellerna så att bina kan livnära sig på det som de skulle i en koloni och kanske fortsätta bearbeta det under studieperioden. Skillnaden i vikt av kam avsnitten före och efter studien användes inte som en uppskattning av förbrukningen eftersom vikten kan ha ökat på grund bin satte den utspädda honung ges till dem i vissa celler.
Arbetarna också kanske har lagt en del av den utspädda honung till bibröd. Av dessa skäl var celler innehållande ungefär lika mängder av bibröd före och efter utfodringsperioden räknas och genererade en kvalitativ mätning. Ändå var det en slående skillnad mellan de två typerna av beebread i antalet tomma ABB räknade celler jämfört med EBB efter 11 dagar.
Bestämma vid förvaring pollen blir beebread kan vara difficult eftersom bina lägga kontinuerligt pollen till celler. De samhällen som används för producerande beebread etablerades med ramar av öppen grubbla så bina skulle samla pollen. Emellertid kolonierna var queenless så fanns larver foder till endast cirka 9 dagar efter koloni bildades. För resten av 3 veckors period då kolonierna var i EFA, pollen som bina insamlade lagrades och omvandlas till beebread. Att hålla den lagrade pollen i kam cellerna i ytterligare 11 dagar när utfodring den till bin i burar också kan ha fortsatt bearbetning av pollen att beebread. Omvandlingen av pollen till bibröd tar ca 7 dagar 8. Den beebread matas till EHB och AHB hade lägre pH och minskade proteinkoncentrationer jämfört med pollen utfodras. Liknande fynd av förändringar i pollen efter konvertering beebread har rapporterats av andra 7,10,27. Våra resultat skiljde sig från tidigare rapporter på så sätt att det fanns skillnader i koncentrationer of vissa aminosyror mellan beebread och pollen. Förändringarna i både protein och aminosyrakoncentrationer kan bero på aktiviteten hos proteolytiska enzymer, kan vars källa vara bina själva eller de mikrobiella samhällen etablerade i beebread 7,8,28,29.
De metoder som används för att mäta proteinkoncentration liknade de tidigare beskrivna för att bestämma effekterna av protein på Africanized och europeiska bin 26. Som en förlängning av de metoder, kunde vi uppskatta lösligt protein i pollen och beebread. Dessa metoder genererade liknande resultat till tidigare rapporter 7,10,27. Våra resultat ger ytterligare belägg för att AHB mer effektivt tillgodogöra sig protein än EHB, och att detta skulle kunna vara en nyckelfaktor i den ekologiska dominans AHB i de flesta regioner där det har invandrat och blivit etablerade 30-32.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Mona Chambers, Geoffrey Hidalgo and Maurissa Two Two for their technical assistance. We also thank Dr. Earl White for amino acid analysis, Dr. Roger Simonds for analysis of pollen for pesticides, and Drs. Stanley S. Schneider, Vanessa Corby-Harris and Kirk Anderson for their reviews and discussion of earlier versions of the manuscript and many helpful suggestions.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
waterproof double junction pH spear | Thermo Fisher | ||
Scientific | |||
Coffee Grinder | Mr. Coffee | model 1DS77 | |
Dulbecco's phosphate buffer solution | Emd-millipore | BSS-1005-B | |
EIA/RIA polystyrene plate | Sigma-Aldrich-Corning | CLS3590-100EA | |
microcapillary pipets | Kimble Glass Inc. | ||
Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | Bio-Rad | #500-0202 | |
Laboratories | |||
Spectrophotometer | Biotek Synergy HT | ||
Mass Selective Detector | Agilent | 5973N | |
HLB cartridge | |||
gas chromatograph | Agilent | 6930 | |
gas chromatography column | A J&W Scientific | DB-1701 | |
d4-alanine | Sigma-Aldrich | 488917 | |
d23-lauric acid | Sigma-Aldrich | 451401 | |
13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
N,O-Bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide + | |||
Trimethylchlorosilane (BSTFA + TMCS) | Sigma-Aldrich | 33148 | |
Perfluorotributylamine (PFTBA) | Sigma-Aldrich | 442747-U | |
d39-arachidiac acid | Cambridge Isotope | ||
Laboratories |