Abstract
ミツバチはbeebreadとしてハイブに、彼らが集めた花粉や店舗からの栄養素を得る。私たちは、ミツバチが収集し、特別に構築囲まれた飛行領域にコロニーを置くことによってbeebreadに変換花粉源を制御するための方法を開発しました。方法は、花粉やbeebreadのタンパク質およびアミノ酸組成を分析するために開発された。またbeebreadの消費量を測定した方法が出現した後、4,7及び11日間beebreadを食べた後の大人の労働者蜂の血リンパタンパク質力価を決定するために使用した方法について説明します。方法は、遺伝子型はbeebreadハチが消費率及びそれからタンパク質を取得するための花粉への変換に影響するかどうかを決定するために適用した。二つの亜種（ヨーロッパとAfricanizedミツバチ、それぞれEHBとAHB）は、同じ花粉源を備えた。開発された方法に基づいて、両方の亜製beebread花粉より低いタンパク質濃度およびpH値を有していた。一般に、アミノ酸コンEHBまたはAHBいずれかによって行わbeebreadでcentrationsは同様であったと花粉よりもbeebreadで高いレベルで発生した。 AHBとEHBの両方がEHBによってよりもAHBによってなさbeebreadのかなり多くを消費する。 EHBとAHBはbeebreadの各タイプの同様の量を消費しますが、AHBにおける体液タンパク質濃度は、EHBを上回りました。 AHBとEHB間のタンパク質獲得の違いは、それぞれの亜種が進化の地域に関連した環境適応を反映することがあります。これらの違いが原因ひな飼育とコロニー成長への影響の新世界でAHB集団の成功確立に貢献することができる。
Introduction
栄養は、ミツバチコロニーの健康と活力でそして集団としての設立に基本的な役割を果たしている。食物から栄養素は、エネルギーとひな飼育、体温調節のために必要な生化学成分、採餌し、免疫応答を提供する。ミツバチコロニーについて、コロニー集団を成長し、自分の健康を維持するために必要な栄養素は蜜や花粉から来る。ネクターは、炭水化物を提供し、花粉は、タンパク質、脂質、ビタミン、ミネラル1と残りの栄養要件を提供しています。
ミツバチの亜種は、このような労働者の長寿、ひな飼育、および社会的な免疫2-6のメカニズムなど栄養的に基づいて、コロニーレベルのパラメータに異なる場合があります。これらの違いは、食品、特に花粉はコロニーによって処理され、個人の中で消化されている方法にリンクされる場合があります。花粉櫛セルに格納され、微生物を介して媒介される乳酸発酵は、化学的に変更される
ここでは、ミツバチの異なる亜種によって作らbeebreadの組成及び消費量を比較するために使用される方法について説明します。働きバチで生じた体液タンパク質力価を測定するための方法もまた記載されている。 beebreadの栄養組成に関するこれまでの研究では、ヨーロッパのミツバチ（EHB）10,15,16を用いて行った。しかし、それらは同じ花粉を餌場合でも、異なる亜種のミツバチによって作らbeebreadに違いがあるかもしれません。これらの潜水艦のでEHBとAHBを比較したpeciesは食品加工や栄養買収17に関連している可能性があり明確な行動や生理的な違いがあります。最も顕著な違いの中には、AHBが収集し、EHBより多くの花粉を消費し、ひな18により容易にそれを変換するように見えるということです。 AHBコロニーはEHBよりも高いスウォーミング率を持っており、食糧資源が限られた19〜23になったときに持ち逃げ。失踪はEHBに稀である。 AHBもEHB 24よりも高い代謝率を持っている。それはbeebreadに変換された後、EHBとAHB間のコロニーレベル差のための栄養基礎花粉回収率にも、その栄養成分（ 例えば 、アミノ酸、タンパク質）に関連するかもしれない。 Beebread消費量と得られたタンパク質の取得もEHBとAHB間のコロニーレベル差で役割を果たし得る。開発された方法を用いて、EHBとAHBは、同一の花粉源からbeebreadた。 beebreadその後、EACのミツバチにフィードバックされましたH亜種とミツバチが自分の亜種またはbeebreadのソースに独特の方法で、beebreadからタンパク質を取得するかどうかを判断することができます。
Protocol
1. AHBとEHBコロニーからBeebreadの取得
- ミツバチコロニーに花粉トラップを配置し、花粉を集める。コーヒーグラインダーを用いて（葯から脱落花粉と同様に）微粉末に花粉を挽く。
- ミツバチが提供花粉にのみ餌になるようで囲まフライトエリア（EFA）にAHBとEHBの5コロニーそれぞれを確立します。ミツバチがそれらの間で交差しないことができるようにEHBとAHBコロニーとの間で漂流から労働者を防ぐために、別々のセクションにEFAを分割。 3,500-4,000働きバチ、EFAの各セクションの蜜、蜂蜜、未熟ひなと空の櫛を持つワックス櫛で個々のEHBまたはAHBコロニーを置きます。
注：設立時のコロニーが花粉を格納していません。花粉が記憶されているレートは、コロニー内の敷設女王を含まないことによって増加させることができる。 - EFAの各セクションの花粉でトレイを配置することにより、コロニーへのグランド花粉フィード。そのforaginように、各トレイに花粉の約60グラムを広めるGミツバチはcorbicular負荷としてそれを収集し、beebreadとしての植民地で花粉を保存することができます。 3週間毎日各トレイに新鮮な花粉を提供し続ける。
- ヨーロッパのbeebread（EBB）として、及びAfricanized beebread（ABB）としてAfricanizedコロニーからヨーロッパのコロニーからbeebreadを参照してください。
ケージ2.摂食ミツバチ
- 環境の部屋で別の出現ケージ内AHBとEHBコロニーから密封された労働者のひなの場所フレームは32-34℃、相対湿度40％に設定した..
- 労働者が出現し、約24時間経過したときは、12プレキシガラスバイオアッセイケージ（寸法= 11.5×7.5 X 16.5センチメートル3）を確立し、各ケージに100新たに浮上してEHBまたは100新たに登場したAHB働きバチのいずれかを追加します。 AHB給餌ABB、EHBフェッドABB、AHBフェッドEBBとEHB給餌EBB：以下の治療の組み合わせを生成するために、各ケージ内のEBBまたはABBどちら細胞（ケージ当たり24〜30細胞）の数がわかっているコームのセクションを配置します。 （4トリートメント; 6処置当たりケージ。全部で24のケージ）。
- 各ケージにボリュームによって配合水のバイアルと50％の蜂蜜と水のソリューションを追加します。 11日の試験期間のために毎日蜂蜜と水のバイアルを補充。
3.サンプリング働きバチとBeebreadと消費の推定
- サンプル10は、新たに前にケージに置くことにEHBとAHB労働者を浮上した。 0日蜂のようにこれらを参考にして、彼らが血リンパタンパク質濃度のベースラインとして機能している。
- 彼らは4,7、および11日間EBBまたはABBに供給した後、各ケージから10ミツバチを削除します。
- 個々のマイクロ遠心チューブでライブミツバチを置き、アイスパック上に設定。血リンパのタンパク質濃度の分析のための4つのミツバチのサブサンプルを選択します。
- デイ·11日に蜂をサンプリングした後、まだbeebreadが含まれているコーム細胞の数を数える。これはbeebread消費の相対的な尺度である。
- 各ケージ内の細胞からの残りbeebreadを取り外し、SEPARに保存ケージに応じてマイクロ遠心チューブを食べた。 pHは、可溶性タンパク質の濃度、及びアミノ酸含量について分析するまで-80℃でbeebreadサンプルを保持する。
4.花粉とBeebreadのpHの推定
- EFAでミツバチに供給された花粉の6ランダム0.3グラムのサンプルを取り、蒸留水300μlのでそれを溶解する。 0.01の精度で防水ダブルジャンクションのpH槍を用いてpHを測定します。
- 各ケージに11日間の給餌期間後に残っbeebreadの0.3グラムのサンプルを取る。蒸留水300μlのbeebreadを溶解し、花粉（4.1）のために説明したように、pHを測定する。
5.タンパク質分析
- 6花粉のサンプルと各ケージからEBBとABBのサンプルを取る。 -20℃で保存サンプルは、可溶性タンパク質濃度を分析するまで。
- 0.1 Mリン酸緩衝液（PBS）1000μlの花粉またはbeebreadどちら20mgを混合する。
- Voは1分間571.2×gで10秒間遠心のための混合物をRTEX。
- 96ウェル平底EIA / RIAのポリスチレンプレートのウェルにおける上清と場所の10μlのサンプルを削除します。 3つのウェルに各サンプルを複製します。
- 翼の結合点近くで胸部の右横の部分に（加熱し、針のように鋭いポイントに引っ張られていた）20μlの毛細管を挿入することにより、各ケージから収集した蜂から血リンパを描画します。腹部tergites間膜内に同じチューブを挿入することにより、必要に応じて、追加の血リンパを収集します。
- 0.1 M PBSの9μlに血リンパの1を添加する。可溶性タンパク質の分析まで-20℃で血リンパ液に保管してください。
- 商業ブラッドフォードのタンパク質アッセイキットを使用して花粉、beebread、そして血リンパ試料中の全可溶性タンパク質濃度を決定します。製造元の指示に従ってください。
- 可溶性タンパク質cを推定するために、標準曲線を確立ウシ血清アルブミン（BSA）中の既知のタンパク質濃度のタンパク質の吸光度を測定することにより試料中のoncentration。分光光度計を用いて595nmでのタンパク質の吸光度を測定します。
6.アミノ酸分析
- 各コロニーの櫛細胞からのプールの個々のサンプルは、分析のためのEBBとABBの代表的なサンプルを作成します。
- 50 mgの花粉を取るかbeebreadサンプルはオートサンプラーバイアルに秤量し、及びD 4 -アラニンからなる50 ng /μLで内部標準溶液100μlとともに、バイアルに1mlの蒸留水を追加し、D 23 -lauric酸、 13 C 6 -グルコースとD 39 -arachidiac酸。
- 5分間のサンプルおよび超音波処理に蓋を。
- beebreadまたは花粉試料1mlを加え、続いて1mlの蒸留水を添加することにより平衡化し、1mlのメタノールを添加することにより、HLBカートリッジを調整する。 5.0％のMeOH / H 2 OおよびELU 1mlでカートリッジを洗浄する80％のMeOH / H 2 O 1 mlのテ
- 窒素気流下で乾燥するまで試料を蒸発させる。ピリジンを50μl及びN、O-ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド+トリメチルクロロシラン（BSTFA + TMCS）の100μlのサンプルを再構成する。
- 30分間70℃でサンプルをキャップとインキュベートする。
- サンプルを冷却し、きれいなオートサンプラーバイアルに転送できるようにする。
- キャップおよび質量選択検出器に試料を配置し、両方の揮発性化合物及び有機酸のためのサンプルを分析するためにガスクロマトグラフにインターフェース。 1.0μmの膜厚でカラム（30 MX 0.25ミリメートルID）を使用してBSTFA + TMCSとのTMS誘導体化以下の砂糖および有機酸を分離します。
- 、2分間50℃のカラムオーブンを設定した後、5℃/分で290℃まで直線的に温度を上昇させる。そして7分間保持する。それぞれ、250℃および290℃のGCインジェクタとGC / MSインターフェースの設定。
- FLOでのキャリアとしてヘリウムを使用してください1.0ミリリットル/分のwの速度。 230°CまでのMS源温度を設定します。
- チューン、パーフルオロトリブチルアミン（PFTBA）で毎日の質量分析装置を校正。プレゼンスとアミノ酸の濃度に関するデータを取得するためにフルスキャン（35から700 AMU）、陽イオンモードでPFTBA1μlの注入を使用してください。
Representative Results
Beebreadは、pHおよびタンパク質濃度について、およびアミノ酸分析前に約4ヶ月間分析する前に、月未満の-80℃で保存した。 Beebreadは、pHおよびタンパク質濃度（ 図1）における花粉異なっていた。タンパク質濃度であったようbeebreadのpHは、花粉より低かった。 EHBとAHBの両方がEBB（ 図2）よりも多くのABBを消費した。
AHBの体液中の可溶性タンパク質のレベルに関係なく消費beebreadのタイプのEHB（ 図3）よりも有意に高かった。 EHBとAHBはbeebreadの各タイプの同様の量を消費していても体液タンパク質レベルにおけるこれらの相違が発生した。サンプリング時のハチの年齢はかなり血リンパ中の可溶性タンパク質濃度に影響を与えた。タンパク質濃度は差がなかった日-7または11と比較して一日-4ハチに有意に低かった。
ミツバチのために必須である10個のアミノ酸の_contentは">、ヒスチジンが、すべての花粉で検出された。ほとんどの場合、beebreadで測定されたアミノ酸濃度（ 図4）。例えば、濃度の花粉よりも高かったロイシンおよびスレオニンは花粉と比較beebreadで約60％増加した、およびバリンの濃度は、約25％高かった。アラニン、アスパラギン酸、グルタミン、およびメチオニンレベルはまた花粉よりbeebreadにおいて高かった。アミノ酸濃度は間で大きく異ならなかったフェニルアラニンおよびシステインを除いて、ABBとEBB。フェニルアラニンレベルはEBBまたは花粉のいずれかと比較ABBにおいて約2倍高かった。システイン濃度は、ABBまたは花粉と比較EBBで低かった。トリプトファンはより高い濃度でのみ存在するアミノ酸であったEBBまたはABBに比べて花粉。花粉におけるプロリンの濃度とABBはEBBを上回りました。図1：花粉とヨーロッパ（EHB）またはAfricanized（AHB）ミツバチによって作らbeebread中のpHの比較（A）および可溶性タンパク質濃度（B）。花粉のpHは、分散分析によって決定されるようbeebreadよりも有意に高かった（F 2,12 = 3725に、p <0.0001）W-チューキーの多重比較検定を行った。花粉中のタンパク質濃度は、EHB（EBB）またはAHB（ABB）製beebreadにおけるよりも有意に高かった（F 2,27 = 16.49であり; p <0.0001）。同じ文字が続く手段は0.05レベルで有意差はありません。
図2：セルの平均割合完全にケージミツバチによる11日の間隔で消費されたbeebreadを含むLS。beebreadが同じ花粉源を用いて、いずれかのヨーロッパ（EHB）またはAfricanized（AHB）ミツバチによって作られた。手段は各治療の5ケージから推定した。分散の一方向分析（F 3,16 = 7.3、p = 0.003）およびTukeyのW検定によって決定されるように同じ文字を有するものは、0.05レベルで有意に異なっていない。この図は、25から変更されている。
図3：4、7、および11日間のヨーロッパ（EBB）またはAfricanized（ABB）ミツバチによって作らヨーロッパ（EHB）またはAfricanizedから血リンパ中のタンパク質の平均濃度（AHB）ミツバチ供給beebreadの反復測定分析。分散は4トリートメントルームの間で有意差が示されたtment基（F 3,20 = 19.7、p <0.001）。 AHB給餌ABB中の可溶性タンパク質のレベルは、EHB給餌ABBた（p = 0.008）またはEBBた（p = 0.018）よりも有意に高かった。サンプリング時のハチの年齢はかなり血リンパ中の可溶性タンパク質濃度に影響を与えた。レベルは7日目に（p <0.0001）または11た（p = 0.001）と比較して一日4ハチで有意に低かった。 7日目とday11蜂た（p = 0.149）で差がなかった。この図は、25から変更されている。
図4：アミノ酸の濃度（花粉のグラム当たりμgのかbeebread）花粉中またはそれ EBB から作られたbeebreadは、ヨーロッパのミツバチによって作らbeebreadされており、ABBはAfricanizedミツバチによって作られた。トリプトファン、システイン、フェニルアラニン、プロリン、プレで明瞭にするために別々にプロットしたその量をセンディング。この図は、25から変更されている。
Discussion
上記の方法を用いて、我々は、AHB製beebreadはAHBとEHB両方でより大量に消費されたことがわかった。 EHBとAHBはbeebreadの各タイプの同様の量を消費しますが、AHBは、より高い血リンパタンパク質力価を有した。 AHBにおける体液タンパク質レベルの両方が、同じ飼料26を与えたにもかかわらずEHBを上回った場合に我々の方法に基づく知見は、以前の報告と同様であった。 EHBとAHBの両方によって異なる速度で消費されたEBBとABBの消費量を測定することは、各亜種における体液のタンパク質濃度は、食物消費を増加させることによって上昇させることができなかったことが判明した。看護師の蜂の時代の労働者と高原の設定ポイントがEHBよりAHBで高くなるよう体液タンパク質濃度のために高原があるようです。
花粉ストレージの速度を最適化するbeebread生産のためのコロニーを確立するためのいくつかの重要な条件がある。まず、共同loniesはオープンひなを持つフレームを必要としています。養うために開いたひながなければ、労働者は非常に花粉を収集することはありません。追加のひなが発生しないので、第二に、コロニーがqueenlessでなければなりません。ひな飼育花粉を大量に必要とし、唯一の過剰花粉が格納される。 EFAに設立された小さなコロニーでは、コロニーがqueenlessする必要がので、ひなエリアが拡大された場合beebreadとして格納されるために少し花粉があるでしょう。最後に、形成されるbeebreadために、花粉corbicular負荷として収集する必要があり、櫛セルに格納される。花粉が花粉トラップ内に回収される場合、それらはcorbicular負荷として、それを収集することができますので、それが蜂に提示する前に微粉末に粉砕しなければならない。
beebreadの消費量を測定する方法ではなく絶対的な推定値より質的に生成。細胞が完全にミツバチのパンを空にしたときにカウントされた唯一の消費でした。総蜂パンの消費のより正確な推定値がハチbrのを除去することによって得られるであろう細胞からのEADと研究期間の前後に重量を測定することができたパテにそれを作る。しかし、我々は、彼らが植民地で、おそらく研究期間中にそれを処理し続けるようにミツバチがそれを餌にすることができるように細胞内の蜂パンを維持したい。ミツバチが一部の細胞でそれらに供給された希釈された蜂蜜を入れているため重量が増加している可能性があるため、調査前と後の櫛部の重量差は、消費量の推定値として使用されませんでした。
労働者も蜂のパンに希釈した蜂蜜のいくつかを追加した可能性があります。これらの理由から、給餌期間の前後蜂パンのほぼ等量を含有する細胞を計数し、定性的な測定値を生成した。それでも、11日後にEBBと比べてカウント空のABB細胞数のbeebreadの2種類の間の顕著な違いがあった。
格納された花粉がbeebreadがディ可能になったときに決定ミツバチが継続的に細胞に花粉を追加するためfficult。ミツバチが花粉を集めたいのでbeebreadを製造するために使用したコロニーを開いたひなの枠で設立された。コロニーが確立された後にのみ約9日間養うために幼虫があったので、しかし、コロニーがqueenlessた。コロニーがEFAにあった3週間の期間の残りの部分では、ミツバチが集めた花粉を貯蔵し、beebreadに変換される。ケージでミツバチに送り、またbeebread花粉の処理を継続している場合があり、追加の11日間櫛細胞において保存された花粉を維持する。蜂のパンへの花粉の転化率は約7日間8かかります。 EHBとAHBに送らbeebreadはより低いpHを有し、花粉給餌に比べてタンパク質濃度を減少させた。変換beebread後の花粉の変化の同様の知見は、他の人7,10,27によって報告されている。濃度Oの違いがあったという点で、我々の結果は、しかし、これまでの報告とは異なっbeebreadと花粉の間にF特定のアミノ酸。両方のタンパク質およびアミノ酸濃度の変化は、タンパク質分解酵素の活性に起因する可能性があり、ソースのは、ミツバチ自身またはbeebread 7,8,28,29に設立された微生物群集可能性があります。
タンパク質濃度を測定するために使用される方法は、以前にAfricanizedおよびヨーロッパミツバチ26上の食事性タンパク質の効果を決定するために記載したものと同様であった。メソッドの拡張として、私たちは花粉とbeebreadに可溶性タンパク質を推定することができました。これらの方法は、以前の報告7,10,27と同様の所見を生成した。今回の知見は、AHBをより効率的にEHBよりも食事タンパク質を同化することを、これはそれが移住して30〜32を確立されているほとんどの地域でのAHBの生態優位性の重要な要因となる可能性があることを追加の証拠を提供する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| waterproof double junction pH spear | Thermo Fisher | ||
| Coffee Grinder | Mr. Coffee | model 1DS77 | |
| Dulbecco's phosphate buffer solution | Emd-millipore | BSS-1005-B | |
| EIA/RIA polystyrene plate | Sigma-Aldrich-Corning | CLS3590-100EA | |
| microcapillary pipets | Kimble Glass Inc. | ||
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | Bio-Rad | #500-0202 | |
| Spectrophotometer | Biotek Synergy HT | ||
| Mass Selective Detector | Agilent | 5973N | |
| HLB cartridge | |||
| gas chromatograph | Agilent | 6930 | |
| gas chromatography column | A J&W Scientific | DB-1701 | |
| d4-alanine | Sigma-Aldrich | 488917 | |
| d23-lauric acid | Sigma-Aldrich | 451401 | |
| 13C6-glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | |
| N,O-Bis (trimethylsilyl)trifluoroacetamide + | |||
| Trimethylchlorosilane (BSTFA + TMCS) | Sigma-Aldrich | 33148 | |
| Perfluorotributylamine (PFTBA) | Sigma-Aldrich | 442747-U | |
| d39-arachidiac acid | Cambridge Isotope |
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