Abstract
La spectroscopie de force atomique est un outil idéal pour étudier des molécules sur des surfaces et des interfaces. Un protocole expérimental pour coupler une grande variété de molécules simples de manière covalente sur une pointe d'AFM est présenté. Dans le même temps la pointe AFM est passive pour prévenir les interactions non spécifiques entre la pointe et le substrat, qui est une condition préalable pour étudier molécules simples attachés à la pointe de l'AFM. Analyses pour déterminer la force d'adhérence, la longueur d'adhérence, et l'énergie libre de ces molécules sur des surfaces solides et bio-interfaces sont peu présentés et références externes pour davantage de lecture sont fournis. molécules d'exemple sont les polytyrosine poly (acides aminés), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine). Ces molécules sont désorbés de surfaces différentes, comme CH 3 -SAMs, l'hydrogène fin diamant et soutenus bicouches lipidiques dans diverses conditions de solvant. Enfin, laavantages de la force spectroscopiques expériences de molécules simples sont discutés comprenant des moyens pour décider si vraiment une seule molécule a été étudié dans l'expérience.
Introduction
Au cours des 30 dernières années, la microscopie à force atomique (AFM) se est avérée être une technique d'imagerie précieux pour étudier biologiques 1,2 synthétiques et des matériaux et des surfaces 3, car il fournit une résolution spatiale moléculaire dans les trois dimensions et peut être utilisé dans divers solvant environnements. En outre, la force de molécule spectroscopie AFM-unique (SMFS) permet de mesurer des forces allant de la PN μN régime et a donné un aperçu sans précédent par exemple dans le repliement des protéines 4,5, la physique des polymères 6-8, et seule interaction molécule-surface 9 - 12 .La raison d'étudier des molécules simples plutôt que d'un ensemble de molécules est d'éviter les effets qui masquent souvent des événements rares ou états moléculaires cachés moyenne. En outre, une multitude de paramètres moléculaires telles que la longueur du contour, la longueur Kuhn, l'énergie libre d'adhérence, etc., peuvent êtreobtenu. Ceci est détaillé dans les exemples ci-dessous. Dans une expérience typique AFM-SMFS, la molécule sonde est couplé à une pointe très fine par une molécule de liaison. L'embout lui-même est situé à l'extrémité d'un cantilever flexible. Si l'embout est mis en contact avec la surface de la molécule sonde va interagir avec cette surface. En observant la déviation du levier lors de la rétraction de la pointe, la force, et donc l'énergie libre, à détacher de la molécule de la surface peut être déterminé. Pour obtenir des statistiques significatives, un grand nombre de soi-disant courbes force-distance doivent être acquises. En outre, d'avoir de véritables expériences seule molécule (ce est à dire, en utilisant une seule et même molécule sonde sur la durée de l'ensemble de l'expérience) la molécule de la sonde doit être couplé de manière covalente à la pointe de l'AFM. Ici, un protocole expérimental pour la fonctionnalisation cantilever avec une seule molécule par l'intermédiaire d'une liaison covalente est présentée. La seule molécule peut être soit couplé par un amino ou un thiol Groupe à la pointe de l'AFM. Le procédé de conjugaison peut être effectuée dans une large variété de solvants organiques et aqueux () pour tenir compte des propriétés de solvatation des polymères utilisés.
Dans la première partie, un protocole général pour fixer de manière covalente une molécule unique ("molécule de sonde») via une molécule de liaison à une pointe d'AFM est décrit. À cette fin, NHS- organique ou maléimide-chimie est utilisé 13. Avec le protocole de trois molécules d'exemple, le processus d'acquisition de données et d'analyse de données sont décrites et les références de lectures complémentaires sont fournis. Les exemples de molécules sont: le (linéaire) de la tyrosine de polymère, le polymère greffé PI g -PS et la POPE lipidique. Cela inclut de légères variations du protocole, par exemple pour fixer de manière covalente cystéines. En outre, une partie est consacrée à la préparation des surfaces différentes, comme une surface de diamant, un groupe CH 3 -self-assemblé monocouche et les bicouches lipidiques. Ces interfaces ont proven être de bonnes références et des exemples.
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Protocol
REMARQUE: Voir la Figure 2 pour un aperçu du flux de traitement comprenant la préparation, l'acquisition des données et d'analyse de données étapes.
1. Réactif Setup
REMARQUE: Tous les produits chimiques doivent être manipulés avec soin, et donc une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection devraient être utilisées. Toutes les opérations doivent être effectuées dans une hotte de laboratoire. En particulier, des gants spéciaux doivent être portés en cas d'utilisation de chloroforme.
- Utiliser des produits chimiques avec faible teneur en eau tel que le chloroforme sèche rapidement et de stockage à sec, mais pas plus d'une semaine. Stocker à la fois les produits chimiques à -20 ° C et sous atmosphère d'azote ou d'argon gazeux car APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilan) (voir tableau 1) et PEG (polyéthylèneglycol) sont hygroscopiques et PEG est soumis à une oxydation à l'air.
- Pour éviter l'exposition fréquente du stock à l'oxygène atmosphérique et de l'humidité, de préparer des aliquotes plus petites, idéalement au sein d'un système de boîte à gants en salle et d'azotere.
2. Installation du matériel
NOTE: Pour éviter la contamination croisée, utiliser des récipients frais et propre pour chaque étape.
- Nettoyer la verrerie et des pinces dans une solution de détergent pendant 30 min dans un bain à ultrasons à 60 ° C.
- Rincer et équipements de traitement par ultrasons de l'étape 2.1 deux fois avec de l'eau ultra-pure.
- Matériel de chaleur provenant de l'étape 2.1 en solution RCA (eau ultra-pure, l'eau oxygénée et d'ammoniaque (5: 1: 1)) à 75 ° C dans un four pendant 45 min, puis les rincer avec de l'eau ultrapure.
- Enfin, sécher la verrerie et pinces sous un courant d'azote sec ou dans un four (100 ° C, 3 h).
3. Conseil fonctionnalisation
REMARQUE: Utilisez une pince à épiler, navires, etc. en acier inoxydable, PTFE, verre ou tout autre matériau qui est chimiquement stable dans des solutions organiques le cas échéant. Sauf indication contraire, effectuer toutes les étapes à RT. La quantité de solution d'incubation nécessaire dépend du nombre de puces en porte à faux. Assurez-vous que les leviers sont immergés dans les solutions respectives à tous les temps.
REMARQUE: Utilisez une hotte pour éviter l'inhalation de vapeurs organiques.
- Formation de groupes OH sur la surface de cantilever («d'activation») (environ 0,5 h):
- Utilisez des pinces pour placer frites fraîches cantilever (matériel: SiN, constants de printemps: 10-100 PN / nm) sur une lame de verre propre et les mettre dans une chambre à plasma (100 W).
- Évacuer chambre (~ 0,1 mbar).
- chambre de Flood avec du gaz d'oxygène et d'évacuer à nouveau.
- Activer le processus de plasma (puissance: 20%, durée: 15 min, la pression du procédé: 0,25 mbar).
- Amino-silanisation des cantilevers (environ 1 h):
- Préparer les 2,5 ml de solution APTES (voir le tableau 1) dans une boîte de Pétri en verre - le faire idéalement pendant le processus de plasma.
- Immediately après le processus de plasma, chaque cantilever tremper pendant 1 sec dans de l'acétone et les placer immédiatement après, dans la solution d'APTES.
- Incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Rincer soigneusement les copeaux de cantilever deux fois dans 10 ml d'acétone et une fois dans 10 ml de chloroforme.
- Finales étape facultative: puces place en porte à faux de l'étape précédente sur une lame de verre propre et les faire cuire pendant 30 min à 70 ° C. Notez qu'il existe également des stratégies alternatives pour l'activation de surface, par exemple, le traitement UV 12.
- PEGylation (environ 2 h):
REMARQUE: Effectuer les étapes 3.3.1-3.3.4 pendant amino-silanisation. NHS et groupes maléimide sont soumis à l'hydrolyse en milieu aqueux et le PEG lui-même est soumis à une oxydation à l'air. Par conséquent cadencement (notamment entre les étapes) est un paramètre critique. Reportez-vous à 13 pour plus d'informations.- Préparer la solution de chloroforme (voir le tableau 1).
- Pour éviter la condensation, Chaleureux PEG saupoudre à TA avant d'ouvrir l'aliquote et en pesant le montant approprié.
- Pour le couplage de polymères ou de lipides avec des groupes amino, de résoudre séparément NHS-PEG-NHS (6 kDa) et la méthyl-NHS-PEG (5 kDa) dans la solution de chloroforme en les vortexant jusqu'à ce qu'ils soient complètement résolus. Reportez-vous au tableau 1 pour les concentrations.
- Alternativement. pour le couplage de polymères avec des groupes thiol résoudre séparément Mal-NHS- PEG et PEG-méthyl-NHS dans la solution de chloroforme.
- Mélanger les solutions selon les besoins pour ajuster un certain rapport entre le nombre de NHS- ou la maleimide- et les molécules de PEG à terminaison méthyle (typiquement 1: 500). On notera que le rapport idéal doit être déterminée de manière itérative à une série de cycles de préparation-expérimentation.
- Incuber puces en porte à faux dans la solution de PEG pendant 1 heure dans une atmosphère saturée en chloroforme pour empêcher l'évaporation du chloroforme.
- Sonder la conjugaison molécule(> 1 h):
NOTE: Dans le 3.4.1-3.4.3 suivante, trois exemples pour le couplage covalent de différentes molécules de sonde à la pointe de l'AFM sont décrits. Pour chaque molécule du protocole doit être ajusté. Note en outre, que dans l'exemple 1 et de 3-chimie NHS est utilisé que dans l'exemple 2, le polymère fonctionnalisé thiol PI- g -PS est couplé au PEG maléimide via la chimie. Pour plus de détails, voir 14.- Pour le poly (acide aminé) le poly-D-tyrosine (40-100 kDa)
- Dissoudre le polytyrosine conjugué molécule sonde dans 1 M de NaOH. Ajuster la concentration de 1 mg / ml.
- Remplacez le NaOH pour le tampon de borate de sodium (pH 8,1) en utilisant des colonnes de spin de dessalage (7 kDa MWCO) immédiatement avant la fonctionnalisation
- Rincer les leviers d'abord avec 5 ml de chloroforme, puis avec 5 ml d'éthanol et finalement avec 5 ml de tampon borate.
- Incuber les puces en porte à faux pendant 1 h dans la solution tampon de borate polytyrosine puis rincer avec un tampon borateet de l'eau ultrapure. Conserver dans l'eau ultra pure jusqu'à la mesure.
- Pour les polymères à squelette linéaire (polyisoprène, 119 kDa) ayant des chaînes latérales greffées (polystyrène, 88 kDa) 14
- Dissoudre le PI g -PS dans le chloroforme sec. Ajuster la concentration de la solution de conjugaison à 4 mg / ml.
- Rincer les cantilevers avec 5 ml de chloroforme et incuber pendant au moins 1 heure dans la solution de conjugaison.
- Rincer à nouveau dans 5 ml de chloroforme et de stocker dans le chloroforme dans un environnement saturé de chloroforme (pour éviter l'évaporation du chloroforme) jusqu'à ce que la mesure.
- Pour le pape lipidique
- Dissoudre PAPE dans le chloroforme sec. Ajuster la concentration à 20 mM.
- Rincer les cantilevers avec 5 ml d'éthanol et 5 ml d'eau ultrapure avant incubation des cantilevers pendant 1 heure dans la solution lipidique.
- Après incubation, rincer avec cantilevers 5 ml de chloroforme, 5 ml d'éthanol et 5 ml d'eau chaude ultra-pure (dans cet ordre) pour éliminer les molécules de la sonde non liée et de se débarrasser des résidus de chloroforme. Utiliser immédiatement conseils fonctionnalisés. Alternativement, les stocker dans le chloroforme jusqu'à ce que nécessaire.
- Pour le poly (acide aminé) le poly-D-tyrosine (40-100 kDa)
Figure 1. (A) Schéma montrant le processus de fonctionnalisation de renseignements en utilisant l'exemple de la chimie NHS. Liaison (B) chimique utilisé pour fixer une molécule sonde à la pointe via un groupe amino. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
4. Préparation de Surface
- monocouche auto-assemblées (SAM)
NOTE: En surface pour le premier exemple, une monocouche auto-assemblée a été choisi. Reportez-vous à la littérature 15 - Nettoyer les lames de verre avec une solution détergente, puis deux fois dans de l'eau ultra pure dans un bain à ultrasons pendant 30 min chacune. Puis, comme une étape de nettoyage supplémentaire, placez-les dans la solution RCA (voir l'étape 2.3) à 75 ° C pendant 15 min.
- Enduire les lames avec 10 nickel chrome nm et 100 nm d'or dans une coucheuse à vide. Puis stocker dans le réfrigérateur et propre à nouveau dans la solution RCA directement avant l'étape suivante.
- Incuber les lames de l'étape précédente en solution 1-dodecanthiol / éthanol 2 mM pendant 12 heures. Les groupes thiol se lient à la surface d'or et une monocouche auto assemble hydrophobe. Rincer les lames avec de l'éthanol et de l'eau ultra pure et sécher par un flux d'azote gazeux. Confirmer le caractère hydrophobe de la surface préparée avec des mesures d'angle de contact statique dans un goniomètre avec une caméra CCD 10.
NOTE: En tant que surface pour le deuxième exemple, un diamant à terminaison hydrogène a été choisi. La préparation de surface a été réalisée comme décrit précédemment 16.
NOTE: Dans le dernier exemple, une surface soutenue bicouche lipidique (SLB) a été utilisé comme une surface. Pour obtenir une telle surface, une solution (0,1 mg / ml) de grandes vésicules unilamellaires (LUV) consistant en phospholipide de la POPC ont été formées par le procédé d'extrusion. Ensuite, 50 ul de la solution de LUV ont été placés sur une feuille de mica fraîchement clivé (A = 1 cm²) et incubées pendant 30 min. Enfin, la solution a été rincé avec 20 ml d'eau ultrapure. Voir 17,18 pour une description détaillée de la préparation de SLBS.
5. Acquisition de données
NOTE: Pour les expériences, utiliser un AFM, qui offre la possibilité de mesurer dans les liquides. Les procédures d'acquisition de données et d'analyse des données sont applicables indépendamment du modèle AFM utilisé. En outre, dans certaines expériences, il est avantageux d'avoir la possibilité de contrôler la température dans la cellule liquide. Cantilever déviation a été détectée par le procédé de déviation du faisceau laser 19. constantes de rappel ont été déterminées par la méthode 20 de bruit thermique.
- Insérez le cantilever fonctionnalisé dans un support de cantilever AFM qui est adapté à la mesure dans des liquides.
- Mettez la surface (préparation, voir ci-dessus) doit être échantillonné en l'AFM et le couvrir avec du liquide. Les deux, en porte à faux et la surface devrait maintenant être immergé dans le liquide avec la pointe cantilever pointant vers la surface. A noter que dans de nombreux cas, une goutte de liquide est suffisante. Dans tous les cas, l'évaporation du liquide doit être évitée, par exemple en utilisant une cellule de fluide fermé.
- Le cas échéant, régler la température désirée sur le contrôleur.
- Laisser le système se équilibrer pendant au moins une demi-heure.
- Enregistrer un spectre de bruit thermique du cantilever avec le cantilever loin de la surface afin d'exclure ne importe quelle surface effets d'amortissement. Notez que généralement une0 ou plusieurs spectres doivent être accumulés pour obtenir un rapport suffisant signal-sur-bruit.
- Approcher la surface. Notez que dans le but de conserver la géométrie de la buse et la buse fonctionnalisation le processus d'approche doit être réalisée avec soin. Ceci peut être accompli, par exemple, se rapprochant en mode contact intermittent.
- Déterminer la sensibilité optique inverse de levier (de InvOLS) mesurée en nm / volt. Pour ce faire, en poussant la pointe cantilever contre une surface dure.
- Déterminer les InvOLS en mesurant la pente de la distance de Voyage piézo contre le changement de tension de la photodiode. Monter une ligne à la partie de la courbe force-distance à laquelle la pointe cantilever est en contact avec la surface. Dans les expériences impliquant une surface molle comme bicouches lipidiques, réaliser cette étape sur les zones qui ne sont pas couverts par une bicouche lipidique (les «points défaut»).
- Déterminer la constante de ressort (pN / nm) en ajustant un oscillateur harmonique du spectre de bruit thermique. Utilisationfonction de logiciel automatisé pour le printemps volonté constante; sinon, contacter la littérature 20.
- Commencez l'expérience.
- Courbes force-distance de nombreux records à chaque condition expérimentale. Typiquement, utiliser les valeurs suivantes pour les paramètres expérimentaux: Taux d'échantillonnage de 5 kHz, la vitesse de 1 pm / s de bout, retirer distance de 1 um.
REMARQUE: Parfois, en fonction de la dynamique de l'expérience étudiée, il peut être nécessaire d'attendre un certain temps avec la pointe en contact avec la surface («temps de pause»).
REMARQUE: les paramètres spécifiques L'expérience peut se écarter sensiblement des valeurs indiquées ci-dessus. - Lors des mesures à long terme, la position zéro du laser sur la photodiode de temps à autre par le repositionnement de la photodiode.
- Facultatif: Après chaque courbe de force, déplacer l'AFM pointe à un autre poste de xy.
- A la fin de l'expérience, de déterminer la sensibilité et le ressort constant à nouveau pour vérifier la cohérence et la stabilité du système.
REMARQUE: La comparaison de la constante de rappel et de la sensibilité avant et après l'expérience est aussi un moyen pour se assurer que les propriétés du système et les propriétés de la pointe sont restées inchangées au cours de l'expérience. Si la différence des constantes de ressort ne est pas trop grande (<= 15%), ils peuvent être en moyenne, depuis le incertitude intrinsèque du printemps volonté constante est aussi autour de 15%. Pour des différences plus importantes, il est conseillé de d'abord trouver et éliminer la cause de la constante de rappel apparente changer avant de poursuivre d'autres expériences.
- Courbes force-distance de nombreux records à chaque condition expérimentale. Typiquement, utiliser les valeurs suivantes pour les paramètres expérimentaux: Taux d'échantillonnage de 5 kHz, la vitesse de 1 pm / s de bout, retirer distance de 1 um.
6. Préparation des données
NOTE: Dans cette section générale étapes de préparation de données qui sont généralement effectué indépendamment du type spécifique de l'expérience pour convertir les unités Newton et nanomètre ainsi que pour corriger les données sont décrits. Les analyses de données spécifiques d'expérimentation sont briefly décrite plus en détail ci-dessous dans la section des exemples représentatifs respectifs.
- Typiquement, effectuer toute la préparation des données et étapes d'analyse automatiquement par un algorithme maison écrite, par exemple, basé sur le logiciel IGOR Pro 6.
- Convertir le signal de déviation brut (Defl) [V] en vigueur en multipliant avec les InvOLS [nm / V] et la constante du ressort [nN / nm].
- La force de décalage de telle sorte que la force exercée sur la poutre à une distance suffisante de la surface (en porte-charge) devient 0 nN.
- Calculer la position de la pointe réelle (également appelé de séparation lorsqu'il est mesuré par rapport à la surface) z *, qui prend la flexion de la poutre en compte:
- Z * Décalage de telle sorte que z * = 0 correspond à la position z de la surface.
REMARQUE: Ici, F est la force qui agit sur la pointe et donc courbureest le cantilever (déterminée à l'étape 6.2.), z est la position z du capteur mesurée (donnée directement par l'instrument) et k représente la constante d'élasticité (déterminé à l'étape 5.8).
Figure 2. organigramme du processus montrant la préparation de l'échantillon, l'acquisition de données et l'analyse des données. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Representative Results
Dans ce qui suit, les résultats décrits ci-dessus pour l'exemple des molécules, à savoir la polytyrosine polymères poly (acide aminé), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide, sont présentés. Première pour chaque exemple, expérimenter des détails spécifiques pour l'acquisition des données et la préparation des données sont fournies. Ensuite, les résultats exemplaires pour des expériences où ces molécules ont été désorbé de surfaces différentes (CH 3 -SAMs, hydrogène fin diamant et bicouches lipidiques) sont présentés. Détermination de la force d'adhérence, l'adhérence et la longueur de l'énergie libre sont introduits.
Exemple 1: La désorption de polytyrosine de monocouche autoassemblée
La désorption de polytyrosine d'un SAM hydrophobe dans différentes solutions avec une teneur variant d'éthanol a été mesurée. Dans chaque solution, les InvOLS en porte à faux et les constantes de ressort ont été déterminées comme décrit ci-dessus et d'au moins 300 vigueur dIstance traces ont été enregistrées pour chaque solution. Toutes les expériences d'un ensemble expérimental ont été effectués avec une seule porte à faux sur un seul jour pour se assurer que d'un même et unique poly (acide aminé) a été mesurée. La vitesse d'extension / rétraction de la poutre a été de 0,5 um / s et le temps de séjour sur la surface est de 1 sec. Les traces vigueur à distance ont montré plateaux de force constante. Chaque plateau a été équipé d'une courbe sigmoïde et la force de plateau ainsi que la longueur de plateau ont été déterminées et représentées dans un histogramme. Les histogrammes ont été équipés d'une gaussienne et la valeur de crête, ainsi que l'écart-type (erreur) de la distribution a été extrait. Jusqu'à la fin du plateau de force, le système est en équilibre et la zone sous le plateau est donc égale à l'énergie libre par longueur de polymère. Seul le processus lui-même détachement à l'extrémité du plateau est en non-équilibre. De ce fait, pour des expériences typiques de la longueur de plateau est plus longue que la equilibri um longueur (environ 30%) et la zone sous le sigmoïde adapte une estimation supérieure pour l'adhésion énergie libre 21.
Figure 3. (A) de travail trace de distance (de retrait) de polytyrosine sur un méthyl-SAM dans l'eau pure (en rouge). Une seule molécule désorbe comme on peut le voir dans la goutte en une seule étape de la force à la ligne de base (à force d'insertion nulle). L'ajustement sigmoïde se affiche en noir et la longueur du plateau extrait et la force du plateau sont indiqués par des flèches. (B) Les histogrammes de la force du plateau extrait pour les mesures dans l'eau pure et dans des mélanges eau / éthanol avec différente teneur en éthanol molaire. longueur (C) Plateau histogrammes de la même série expérimentale. (D) de longueur de pic plateau vs force de pic plateau ".456 / 52456fig3large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 3A montre une seule trace de force distance de polytyrosine mesurée dans l'eau pure. force de Plateau et de la longueur du plateau sont extraits. Se il n'y a qu'une seule molécule à l'extrémité qui est désorbé de la SAM, la longueur du plateau histogramme montre une distribution étroite et monomodale (généralement dans des expériences de l'écart type dans un accès de gauss de la longueur histogramme est d'environ 5 à 20 nm). Vice versa, se il ya un seul pic étroit dans la longueur du plateau histogramme, on peut être relativement sûr que l'ensemble expérimental a été fait avec un seul et même polymère. La raison en est que les polytyrosines sont très polydispersive de taille (50 à 100 kDa). Par conséquent, deux polymères de exactement la même longueur sont hautement improbable. Ajout d'éthanol affaiblit l'interaction hydrophobe entre polytyrosine et la surface et 10,22conduit à une énergie libre d'adsorption plus basse et donc à une force de plateau inférieur comme on peut le voir dans les histogrammes des forces de palier pour les différentes conditions de solvant indiquées sur la figure 3B. Maintenant, il peut être étudié comment la longueur du plateau d'un seul polytyrosine change pour différentes énergies libres d'adsorption. Comme on peut le voir sur la figure 3C la longueur de plateau diminue avec l'addition d'éthanol. En même temps, la diminution de la force de plateau (Figure 3D).
Afin d'obtenir tous les paramètres pertinents du processus de désorption à savoir la longueur de contour, la longueur Kuhn, l'énergie libre d'adsorption et la désorption taux de monomère intrinsèque, il faut combiner les mesures décrites ci-dessus avec des expériences de distance constante. Pour plus de détails, voir 21.
Exemple 2: désorption du polymère greffé PI -PS g d'un diamant hydrophobe
Sur la figure 4A 4B courbes force-distance typiques obtenus avec PI g -PS sur le diamant hydrogéné dans de l'eau à température ambiante sont présentés. Le temps de séjour sur la surface est de 1 s et la vitesse du cantilever est une um / sec. Soit les plateaux de force constante (figure 4A) ou à des événements de rupture ont été observés (figure 4B). Pour les plateaux de force constante, la hauteur des plateaux a été déterminée avec un ajustement sigmoïde et les valeurs ont été tracées dans un histogramme (Figure 4C). Pour exclure le pic de l'adhérence non spécifique due à une interaction directe de la pointe avec la surface (premier pic de la courbe force-distance de la figure 4B), la force maximale à une certaine distance de la surface a été déterminée. Les valeurs obtenues pour ces événements de rupture ont alors été tracées dans un histogramme (Figure 4D). Pour une analyse plus poussée des histogrammes ont été équipés d'une gaussienne et la hauteur maximale a été choisie comme une valeur moyenne pour lepoint de données. Avec ce genre d'expérience, l'influence de la présence de chaînes latérales et leur architecture a été étudiée 14.
Figure 4. Courbes de rétraction force-distance effectuées avec un squelette de polyisoprène linéaire greffé avec des chaînes latérales de polystyrène (PI g -PS). Soit les plateaux de force constante (A) ou des événements de rupture (B) sont observées. Pour plateaux de force constante, la hauteur des plateaux est déterminée avec un ajustement sigmoïde et tracée dans un histogramme (C), tandis que pour les événements de rupture, la force de rupture maximale est déterminée (D). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Exemple 3: Extraction d'un seul phospholipid (PAPE) d'une bicouche lipidique
La figure 5A montre une représentation schématique du procédé d'extraction unique molécule. mesures d'extraction ont été effectuées par l'approche verticale de la pointe AFM PAPE fonctionnalisé vers la bicouche lipidique en charge (non représenté). Au contact de la pointe à la bicouche POPC, une petite force (~ 100 PN) est maintenue constante par une boucle de rétroaction pendant environ 4 secondes. Si la molécule PAPE insère dans la bicouche pendant ce temps d'arrêt, il est sorti ou «extrait» de la bicouche sur la rétraction de la pointe de l'AFM de la bicouche. Il en résulte des courbes force-distance caractéristique. Leur forme est essentiellement déterminée par l'élasticité étirement du lieur PEG et peut être équipé par un modèle 23 chaîne vermiformes (WLC). Une superposition de plus de 50 courbes est représenté sur la figure 5B. Les vrais événements de molécules simples peuvent être reconnus par simples histogrammes de force pointus (Figure 5C ong>). Notez que pour obtenir d'autres renseignements sur la taille de certain paramètre moléculaire (par exemple, le temps moyen de lipides dans les bicouches de vie), il est nécessaire d'effectuer des mesures avec différents taux vigueur de chargement. Pour une analyse plus approfondie de la seule lipides expériences d'extraction voir 24.
Figure 5. (A) Schéma pour l'extraction d'une molécule unique à partir d'une bicouche lipidique. A noter que la molécule de lipide est couplé de manière covalente à l'extrémité. Par conséquent, plusieurs centaines ou même des milliers de cycles d'extraction de la force peuvent être réalisées avec une seule et même molécule. (B) Superposition de plus de 50 courbes d'extraction neuf. (C) de l'histogramme de la distribution de l'exemple représenté dans (B) de la force d'extraction..jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Étape | But | Soluté | Solvant | Ou rapport de concentration typique |
| Silanisation | Créer des groupes acides sur la surface de porte à faux | APTES (3-aminopropyl) tri-éthoxysilane (par exemple, Vectabond ™) | acétone | 01:50 (v / v) - 1: 100 (v / v) |
| PEGylation | Fournir surface en porte à faux avec les groupes amino ou thiols réactifs | NHS-PEG-NHS ou Mal-PEG-NHS | chloroforme sec | 0,25 à 25 mM |
| PEGylation | Surface cantilever Passivate | méthyl-PEG-NHS | chloroforme sec | 25 mM |
| Conjugaison de molécule sonde | Molécule sonde d'Couple via un groupe amino ou un thiol de PEG bifonctionnel | Molécule sonde (polymère, un lipide, etc.) | chloroforme sec ou un tampon borate | 0,1 à 10 mM |
Tableau 1. Les solutions nécessaires pour la pointe fonctionnalisation.
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Discussion
Durant les dernières décennies, des expériences de molécules simples ont donné un aperçu sans précédent sur les mécanismes moléculaires et se est avéré être une approche précieuse en sciences de la vie et au-delà. Pour obtenir de bons et significatives expériences statistiques de SMF, idéalement une seule et même molécule est utilisée sur toute la durée de l'expérience. Contrairement aux expériences avec des ensembles de molécules, des expériences SMF sont capables de détecter des événements rares et états moléculaires cachés. Un autre avantage des expériences de molécule unique est qu'elles peuvent être modélisées au moyen de simulations de dynamique moléculaire 24,25.
Le protocole cantilever de fonctionnalisation décrite ci-dessus est une version modifiée de procédures publiées antérieurement 26 - 28. Après l'activation et la silanisation, le cantilever AFM est fonctionnalisé avec un mélange de deux types différents de polyéthylène-glycol (PEG) molécules (Les molécules de liaison).
N-hydroxysuccinimide amino-réactive groupe (NHS) (ou un groupe maléimide réactif thiol), où par la suite la molécule sonde est conjugué («NHS-PEG", "Mal-PEG»). Voir Figure 1 pour un schéma de la pointe fonctionnalisation. Le but du PEG est triple: d'abord, il passive la surface de la pointe et empêche donc l'adsorption non spécifique. Deuxièmement, en utilisant un certain rapport méthyl-PEG / PEG-NHS permet d'ajuster la concentration de NHS-PEG à la surface d'extrémité. Et troisièmement, il sépare la pointe de la molécule de sonde et permet donc pour la quantification de l'interaction molécule-surface sans ingérence de l'interaction directe pointe-surface. Ensuite, la molécule sonde est couplé par covalence à l'extrémité par l'intermédiaire du NHS-PEG (ou Mal-PEG).
Ce protocole permet de se assurer que toutes les obligations (*) dans le & #8220; la chaîne de couplage "tip * OH * * silane PEG * molécule sonde sont des liaisons covalentes et donc très forte. Ceci, à son tour, permet que un seul et même molécule sonde est mesurée pendant toute la durée de l'expérience. Cela a été illustré ci-dessus dans la section des résultats représentatifs montrant vrai spectroscopie de force de la molécule unique.
Comment peut être vérifié que vraiment une seule molécule est mesurée? Pour les traces individuelles avec des plateaux de force constante, une seule goutte à la ligne de base est suffisante. Si plus d'un polymère est désorbé dans le même temps, la force tombe à zéro en plusieurs étapes distinctes, que chaque polymère se détache en un point différent. Il est plus difficile de décider se il est à chaque fois la même molécule unique. Par conséquent, la distribution des longueurs de détachement doit être évaluée. Une distribution étroite avec un pic unique est une bonne indication que l'un et la même molécule unique a été sondé dans toute trace vigueur extension. Pour les traces simples avec Rupture événements, la superposition de toutes les traces est la meilleure méthode pour décider si (un seul et même) seule molécule a été mesurée. En variante, chaque trace peut être équipé d'un (WLC) modèle, puis à la fois la longueur de persistance et la longueur de rupture à une force définie peut être tracée. La distribution de ces deux paramètres doit être étroit et unique pointu.
En conclusion, une procédure de préparation pour la fixation d'une grande variété de molécules uniques à pointes AFM a été présenté. Petite pointe de l'AFM (rayon ~ 10 nm), ses capacités de positionnement latéral et sa sensibilité de force en font l'outil idéal pour étudier les propriétés d'adhérence de molécules simples sur des surfaces biologiques et non biologiques dans presque ne importe quel liquide.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
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