Abstract
ספקטרוסקופיה כוח האטומית היא כלי אידיאלי ללמוד מולקולות על משטחים וממשקים. פרוטוקול ניסוי לזוג במגוון גדול של מולקולות בודדות קוולנטית על קצה AFM מוצג. באותו הזמן בקצה AFM הוא פסיבציה כדי למנוע אינטראקציות נוקבות בין הקצה ואת המצע, שהוא תנאי הכרחי ללימודי מולקולות בודדות מחוברת לקצה AFM. ניתוח כדי לקבוע את כוח ההידבקות, אורך ההידבקות, ואנרגיה החופשית של מולקולות אלה על משטחים מוצקים וביו-ממשקי זמן קצר הציגו והפניות חיצוניות לקריאה נוספת מסופקות. מולקולות דוגמא הן polytyrosine פולי (חומצת אמינו), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור פוספוליפידים (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine). מולקולות אלה desorbed ממשטחים שונים כמו CH 3 -SAMs, יהלומי מימן הסתיים ונתמך bilayers שומנים בתנאי ממס שונים. לבסוף,יתרונות של ניסויי מולקולת כוח ספקטרוסקופיות יחידים נדונים לרבות אמצעים כדי להחליט אם באמת מולקולה בודדת נחקרה בניסוי.
Introduction
במהלך 30 השנים האחרונות, במיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) התברר להיות טכניקת הדמיה רבת ערך כדי ללמוד 1,2 וסינתטי 3 חומרים ופני שטח ביולוגיים שכן הוא מספק רזולוציה מרחבית מולקולרית בכל שלושת הממדים ויכול להיות מופעל בממס שונים סביבות. בנוסף, כוח מולקולת ספקטרוסקופיה AFM-הורי (SMFS) מאפשרת למדוד כוחות הנעים בין pN לμN משטר ונתנה תובנות חסרות תקדים לדוגמא לחלבון מתקפלות 4,5, פיזיקת פולימר 6-8, ואינטראקציה מולקולה-משטח אחד 9 - 12 רציונל מאחורי .the לומד מולקולות בודדות ולא הרכב של מולקולות הוא להימנע מממוצע השפעות אשר לעתים קרובות להסוות אירועים נדירים או מדינות מולקולריות מוסתרות. יתר על כן, מספר רב של פרמטרים מולקולריים כגון אורך הגובה, אורך Kuhn, אנרגיה חופשית ההידבקות, וכו 'יכול להיותהושג. זה מפורט בדוגמאות שלהלן. בניסוי AFM-SMFS טיפוסי, מולקולת הבדיקה היא מצמידים את קצה חד מאוד באמצעות מולקולה מקשר. טיפ עצמו נמצא בסוף שלוחה bendable. אם הקצה הוא הביא במגע עם פני השטח מולקולת הבדיקה תהיה אינטראקציה עם פני השטח זה. על ידי התבוננות הסטייה של שלוחה על הכחשה של הקצה, הכוח, ולכן האנרגיה החופשית, כדי לנתק את המולקולה מפני השטח ניתן לקבוע. כדי לקבל נתונים סטטיסטיים משמעותיים, מספר רב של מה שנקראו עקומות כוח למרחקים שיירכש. יתר על כן, יש ניסויי מולקולה בודדת אמיתיים (כלומר, שימוש ובעונה אחת מולקולת בדיקה על משך הניסוי כולו) מולקולת הבדיקה צריכה להיות בשילוב קוולנטית לקצה AFM. כאן, פרוטוקול ניסוי לfunctionalization שלוחה עם מולקולה בודדת באמצעות קשר קוולנטי מוצג. המולקולה בודדת או יכולה להיות בשילוב באמצעות אמינו או thioקבוצת l לקצה AFM. התהליך הצמידה יכול להתבצע במגוון רחב של ממסים (אורגניים ומימיים) כדי להסביר את תכונות solvation של הפולימרים המשמשים.
בחלקו הראשון, פרוטוקול כללי לצרף קוולנטית מולקולה בודדת ("מולקולת בדיקה") באמצעות מולקולת מקשר לקצה AFM מתואר. לשם כך, NHS- האורגני או maleimide-הכימיה משמשת 13. יחד עם הפרוטוקול לשלוש מולקולות דוגמא, תהליכי רכישת נתונים וניתוח נתונים מתוארים ואזכור לקריאה נוספת מסופק. מולקולות הדוגמא הן: טירוזין הפולימר (ליניארי), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור השומנים. זה כולל שינויים קלים של הפרוטוקול, למשל לצרף קוולנטית cysteines. בנוסף, סעיף מוקדש להכנת משטחים שונים כגון משטח יהלום, 3 monolayer התאספו -self CH וbilayers שומנים. יש לי ממשקים אלה proven להיות אזכור טוב ודוגמאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ראה איור 2 לסקירה כללית של זרימת ההליך הכוללת את ההכנה, את צעדי רכישת נתונים וניתוח נתונים.
1. הגדרה מגיב
הערה: כל הכימיקלים חייבים להיות מטופל בזהירות, ובכך חלוק מעבדה, יש להשתמש בכפפות ומשקפי מגן. כל הפעולות יש לבצע במנדף מעבדה. בפרט, יש ללבוש כפפות מיוחדות במקרה של שימוש בכלורופורם.
- להשתמש בכימיקלים עם תכולת מים נמוכה כגון כלורופורם יבש במהירות ובחנות יבשה אך לא יותר משבוע. אחסן את שני הכימיקלים ב -20 ° C ותחת גז חנקן או ארגון כי (triethoxysilan (3-aminopropyl)) APTES (ראה טבלה 1) וPEG (polyethylenglycol) הם hygroscopic וPEG כפוף לחמצון באוויר.
- כדי להימנע מחשיפה תכופה של המניה לחמצן ולחות באטמוספרה, להכין aliquots הקטן יותר, באופן אידיאלי בתוך מערכת תא כפפות עם atmosphe חנקןמחדש.
2. התקנת ציוד
הערה: כדי למנוע זיהום צולב אפשרי, להשתמש בכולים רעננים ונקיים לכל שלב.
- כלי זכוכית נקיים ופינצטה בתמיסת סבון למשך 30 דקות באמבטיה קולית ב 60 ° C.
- יש לשטוף וציוד sonicate משלב 2.1 פעמיים ביסודיות עם מים ultrapure.
- ציוד חום מצעד 2.1 בפתרון RCA (מים ultrapure, מי חמצן ואמוניה (5: 1: 1)) 75 ° C בתנור במשך 45 דקות ולאחר מכן לשטוף אותם עם מים ultrapure.
- לבסוף, לייבש את כלי הזכוכית ופינצטה תחת זרם של חנקן יבש או בתנור (100 מעלות צלזיוס, 3 שעות).
3. עצה Functionalization
הערה: פינצטה השימוש, כלי שיט, וכו 'עשויים מפלדת אל-חלד, PTFE, זכוכית או כל חומר אחר שהוא יציב מבחינה כימית בפתרונות אורגניים אם רלוונטי. אלא אם צוין אחרת, לבצע את כל השלבים בRט הסכום של פתרון דגירה דרוש תלוי במספר שבבי שלוחה. ודא שהזיזים שקועים בפתרונות המתאימים בכל הזמן.
הערה: השתמש במכסת מנוע, כדי למנוע שאיפה של אדים אורגניים.
- כינונה של OH-קבוצות על פני השטח שלוחה ("הפעלה") (כ 0.5 שעות):
- להשתמש בפינצטה כדי למקם את השבבים טריים שלוחה (חומר: SiN, קבוע קפיץ: 10-100 pN / ננומטר) בשקופית זכוכית נקייה ולשים אותם בתא פלזמה (100 W).
- לפנות קאמרי (~ 0.1 mbar).
- תא מבול עם גז חמצן ולפנות שוב.
- הפעל את תהליך הפלזמה (כוח: 20%, משך: 15 דקות, לחץ תהליך: 0.25 mbar).
- אמינו-silanization של זיזים (כ 1 שעה):
- הכן את 2.5 מיליליטר של תמיסת APTES (ראה טבלה 1) בצלחת פטרי מזכוכית - לעשות באופן אידיאלי זה בתהליך הפלזמה.
- Immediately לאחר תהליך הפלזמה, לטבול כל שלוחה 1 שניות באצטון ולמקם אותם מייד לאחר מכן בפתרון APTES.
- דגירה במשך 15 דקות ב RT.
- לשטוף בזהירות את שבבי שלוחה פעמיים באצטון מיליליטר 10 ופעם אחת ב 10 מיליליטר כלורופורם.
- אופציונליים סופי צעד: שבבי שלוחה מקום משלב קודם בשקופית זכוכית נקייה ואופים אותם במשך 30 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. שים לב שיש גם אסטרטגיות חלופיות להפעלת משטח, לדוגמא, טיפול UV 12.
- PEGylation (כ 2 שעות):
הערה: לבצע צעדי 3.3.1-3.3.4 במהלך אמינו-silanization. NHS וקבוצות maleimide כפופים להידרוליזה בסביבות מימיות וPEG עצמו כפוף לחמצון באוויר. לכן תזמון (בבמיוחד בין המדרגות) הוא פרמטר קריטי. עיין 13 למידע נוסף.- הכן את פתרון כלורופורם (ראה טבלה 1).
- כדי למנוע התעבות, PEG החם אבקות עד RT לפני פתיחת aliquot ומשקל את הכמות המתאימה.
- לצימוד של פולימרים או שומנים עם קבוצות אמינו, בנפרד לפתור NHS-PEG-NHS (6 KDA) ותיל-PEG-NHS (5 KDA) בפתרון כלורופורם על ידי vortexing עד שהם פתרו לחלוטין. עיין בטבלת 1 לריכוזים.
- לחלופין. לצימוד של פולימרים עם קבוצות תיאול בנפרד לפתור Mal-NHS- PEG ומהתיל-PEG-NHS בפתרון כלורופורם.
- מערבבים את הפתרונות כנדרש כדי להתאים את יחס בין מספר מסוים NHS- או maleimide- והמולקולות מתיל-הופסק PEG (בדרך כלל 1: 500). שים לב שהיחס האידיאלי צריך להיות נחוש איטרטיבי בסדרה של מחזורי הכנה-ניסוי.
- דגירה שבבי שלוחה בפתרון PEG עבור שעה 1 באווירה רוויה כלורופורם על מנת למנוע אידוי של כלורופורם.
- לחקור נטיית מולקולה(Hr> 1):
הערה: ב3.4.1-3.4.3 הבאים, שלוש דוגמאות לצימוד קוולנטיים של מולקולות בדיקה שונות ועד לקצה AFM מתוארות. לכל מולקולה הפרוטוקול צריך להיות מותאם. עוד יצוין, כי בדוגמא 1 ו -3 NHS-כימיה משמש ואילו בדוגמא 2 -PS g מלק פולימר תיאול פונקציונליות הוא מצמידים את PEG באמצעות maleimide-כימיה. לפרטים ראו 14.- לפולי (חומצת אמינו) פולי-D-טירוזין (40-100 KDA)
- ממיסים את מולקולת הבדיקה polytyrosine מצומדות ב 1 M NaOH. התאם את הריכוז ל1 מ"ג / מיליליטר.
- להחליף NaOH לחיץ borate נתרן (pH 8.1) באמצעות עמודות desalting הספין (7 kDa MWCO) מייד לפני functionalization
- יש לשטוף את הזיזים ראשון עם 5 מיליליטר של כלורופורם, ולאחר מכן עם 5 מיליליטר של אתנול וסופו של דבר עם 5 מיליליטר של חיץ borate.
- דגירה שבבי שלוחה עבור שעה 1 בפתרון חיץ borate polytyrosine ולאחר מכן לשטוף עם חיץ borateומים ultrapure. אחסן במי ultrapure עד המדידה.
- עבור פולימרים עם עמוד שדרה ליניארי (polyisoprene, 119 KDA) יש רשתות בצד מורכבים (קלקר, 88 KDA) 14
- ממיסים את מלק g -PS בכלורופורם יבש. התאם את הריכוז של פתרון נטיה ל4 מ"ג / מיליליטר.
- יש לשטוף את הזיזים עם 5 מיליליטר של כלורופורם דגירה במשך שעה לפחות 1 בפתרון הצמידה.
- יש לשטוף שוב ב 5 מיליליטר של כלורופורם ולאחסן בכלורופורם בסביבה רווי כלורופורם (כדי למנוע אידוי כלורופורם) עד המדידה.
- לאפיפיור השומנים
- לפזר אפיפיור בכלורופורם יבש. התאם את הריכוז עד 20 מ"מ.
- יש לשטוף את הזיזים עם 5 מיליליטר של אתנול ו 5 מיליליטר של מים ultrapure לפני הדגירה של הזיזים עבור שעה 1 בפתרון השומנים.
- לאחר דגירה, לשטוף זיזים עם 5 מיליליטר של כלורופורם, 5 מיליליטר של ethanol ו -5 מיליליטר של מים חמים, ultrapure (לפי סדר זה) כדי להסיר מולקולות בדיקה מאוגד ולהיפטר משאריות כלורופורם. השתמש בעצות פונקציונליות באופן מיידי. לחלופין, לאחסן אותם בכלורופורם עד צורך.
- לפולי (חומצת אמינו) פולי-D-טירוזין (40-100 KDA)
איור 1. (א) סכמטי המציג את תהליך functionalization קצה באמצעות הדוגמא של הכימיה NHS. קשר כימי (B) מועסק לצרף מולקולת בדיקה לקצה באמצעות קבוצת אמינו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הכנת 4. Surface
- monolayer התאסף עצמי (SAM)
הערה: כמשטח לדוגמא הראשונה, monolayer עצמי התאספו נבחר. עיין בספרות 15 - שקופיות זכוכית נקיות עם תמיסת סבון ולאחר מכן פעמיים במי ultrapure באמבטיה קולית במשך 30 דקות כל אחד. ואז, כצעד ניקוי נוסף, מניח אותם בפתרון RCA (ראה שלב 2.3) בשעה 75 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
- מעיל השקופיות עם 10 ניקל כרום ננומטר ו -100 ננומטר זהב בcoater ואקום. לאחר מכן לאחסן במקרר והנקי שוב בפתרון RCA ישירות לפני השלב הבא.
- דגירה השקופיות של השלב הקודם בפתרון 2 1-dodecanthiol / אתנול מ"מ לשעה 12. קבוצות תיאול להיקשר למשטח הזהב וmonolayer עצמי הידרופובי מרכיב. יש לשטוף את השקופיות עם אתנול ומים ultrapure ולאחר מכן יבש על ידי זרם של גז חנקן. לאשר את הידרופוביות של פני השטח מוכנים עם מדידות זווית מגע סטטי במד זוית עם מצלמת CCD 10.
הערה: כמשטח לדוגמא השנייה, יהלומים הופסקו מימן נבחר. הכנת השטח בוצעה כפי שתואר קודם לכן 16.
הערה: בדוגמא האחרונה, bilayer שומנים משטח נתמך (SLB) שימש כמשטח. כדי להשיג משטח כזה, פתרון (0.1 מ"ג / מיליליטר) של שלפוחית הגדולה unilamellar (LUVs) בהיקף של POPC פוספוליפידים נוצרו על ידי שיטת שחול. אז 50 μl של פתרון LUV הועלה על גיליון טרי ביקע נציץ (= סמ"ר 1) וטופחו במשך 30 דקות. לבסוף הפתרון נשטף עם 20 מיליליטר של מים ultrapure. ראה 17,18 לתיאור מפורט של הכנת SLBs.
5. Data Acquisition
הערה: לניסויים, להשתמש AFM, אשר מספק את היכולת למדוד בנוזלים. נהלי רכישת נתונים וניתוח נתונים חלים ללא קשר למודל AFM בשימוש. יתר על כן, בכמה ניסויים זה יתרון שיש לי האפשרות לשלוט temperaturדואר בתוך נוזל התא. סטיית שלוחה זוהתה באמצעות שיטת סטיית קרן לייזר 19. קבועי האביב נקבעו בשיטת הרעש התרמית 20.
- הכנס את שלוחה פונקציונליות לבעל שלוחה AFM אשר מתאים למדידה בנוזלים.
- שים את פני השטח (הכנה ראה לעיל) שנדגמו לAFM ולכסות אותו עם נוזל. שני, שלוחה ושטח צריכה עכשיו להיות שקועים בנוזל עם קצה שלוחה מצביע לעבר פני השטח. שים לב כי במקרים רבים טיפת הנוזל היא מספיק. בכל מקרה אידוי של הנוזל יש להימנע, למשל, על ידי שימוש בתא נוזל סגור.
- במידת צורך, להתאים את הטמפרטורה רצויה בבקר.
- תן למערכת לאזן במשך לפחות חצי שעה.
- להקליט ספקטרום רעש תרמי של שלוחה עם שלוחה רחוקה מפני השטח כדי לשלול כל משטח דעיכת תופעות. שימו לב שבדרך כלל 10 או יותר ספקטרום צריך להיות שהצטבר לקבל יחס אות לרעש מספיק.
- מתקרב למשטח. שים לב כי על מנת לחסוך בfunctionalization גיאומטריה קצה וקצה תהליך הגישה צריכה להתבצע בזהירות. זה יכול להיות מושלם על ידי, למשל, מתקרב במצב מגע לסירוגין.
- לקבוע את הרגישות ההפוכה האופטית המנוף (InvOLS) נמדדה בננומטר / וולט. לעשות זאת על ידי לחיצה על קצה שלוחה כנגד משטח קשה.
- לקבוע את InvOLS על ידי מדידת שיפוע מרחק הנסיעה piezo לעומת השינוי במתח photodiode. להתאים קו לחלק של עקומת כוח-המרחק שבו קצה שלוחה הוא במגע עם המשטח. בניסויים הכוללים משטח רך כמו bilayers שומנים בדם, לבצע את הצעד הזה באזורים שאינם מכוסים בbilayer שומנים ("כתמי פגם").
- לקבוע את קבוע הקפיץ (PN / ננומטר) על ידי התאמת מתנד הרמוני לספקטרום הרעש התרמי. שימושאוטומטי פונקצית תוכנה לקביעת קבוע קפיץ; אחרת להתייעץ ספרות 20.
- להתחיל את הניסוי.
- עקומות כוח-מרחק רב שיא בכל תנאי ניסוי. בדרך כלל, להשתמש בערכים הבאים עבור הפרמטרים הניסיוניים: קצב דגימה של kHz 5, מהירות קצה של מיקרומטר 1 / sec, לחזור בו ממרחק של 1 מיקרומטר.
הערה: לפעמים, תלוי בדינמיקה של הניסוי למד, ייתכן שיהיה צורך להמתין זמן מסוים עם הקצה במגע עם פני השטח ('להתעכב זמן ").
הערה: ניסוי פרמטרים ספציפיים יכולים לסטות באופן משמעותי מהערכים שניתנו לעיל. - במהלך מדידות טווח ארוכות, אפס עמדת הלייזר על photodiode מעת לעת על ידי למקם מחדש את photodiode.
- אופציונאלי: אחרי כל עקומת כוח, מיקום מחדש של AFM-הקצה לעמדת xy אחר.
- בסופו של הניסוי, לקבוע את הרגישות והאביב constant שוב כדי לבדוק עקביות ויציבותה של המערכת.
הערה: השוואת קבוע הקפיץ ורגישות לפני ואחרי הניסוי היא גם אמצעי להבטיח כי התכונות של המערכת ואת המאפיינים של הקצה נותר ללא שינוי במהלך הניסוי. אם ההבדל של קבועי האביב הוא לא גדול מדי (<= 15%), הם יכולים להיות בממוצע, מאז חוסר הוודאות הפנימית של קביעת קבוע קפיץ הוא גם סביב 15%. להבדלים גדולים יותר, כדאי הראשון למצוא ולחסל את הגורם לשינוי קבוע קפיץ לכאורה לפני שתמשיך בניסויים נוספים.
- עקומות כוח-מרחק רב שיא בכל תנאי ניסוי. בדרך כלל, להשתמש בערכים הבאים עבור הפרמטרים הניסיוניים: קצב דגימה של kHz 5, מהירות קצה של מיקרומטר 1 / sec, לחזור בו ממרחק של 1 מיקרומטר.
6. נתונים הכנה
הערה: בשלבי הכנת נתונים זה סעיף כללי המתבצעים בדרך כלל עצמאית של הסוג המסוים של ניסוי להמיר יחידות לניוטון וננומטר, כמו גם לתקן את הנתונים שתוארו. ניתוחי נתונים הספציפיים הניסוי הם briefly מתואר להלן בסעיף הדוגמא המייצג בהתאמה.
- בדרך כלל, לבצע את כל ההכנה וניתוח של הנתונים על השלבים באופן אוטומטי על ידי אלגוריתם בית-כתוב, למשל, מבוסס על תוכנת איגור Pro 6.
- להמיר את אות גלם הסטייה (Defl) [V] לתוקף על ידי הכפלתו עם InvOLS [nm / V] והאביב [NN / nm] קבוע.
- לקזז את הכוח באופן כזה שהכח על שלוחה במרחק מספיק מהשטח (שלוחה פרקה) הופך 0 NN.
- לחשב את מיקום קצה בפועל (הפרדה המכונות גם כאשר נמדדו ביחס למשטח) * z, אשר לוקח את הכיפוף של שלוחה בחשבון:
- קיזוז * z באופן כזה שz * = 0 המתאים למצב z של פני השטח.
הערה: הנה, F הוא הכוח הפועל על עיקול הקצה ומכאןזה שלוחה (שנקבע בשלב 6.2.), z היא עמדת z-החיישן שנמדדה (הניתנת ישירות על ידי המכשיר) וk מייצג את קבוע הקפיץ (שנקבע בשלב 5.8).
איור זרימת תרשים 2. תהליך המראה את הכנת המדגם, רכישת נתונים וניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בחלק הבא, התוצאות עבור מעל מתוארות מולקולות דוגמא, כלומר polytyrosine פולי פולימרים (חומצת אמינו), פולימר השתל מלק g -PS והאפיפיור פוספוליפידים, מוצגים. ראשית לכל דוגמא, להתנסות פרטים ספציפיים לרכישת נתונים והכנת הנתונים מסופקים. לאחר מכן, תוצאות המופת לניסויים שבם מולקולות אלה desorbed ממשטחים שונים (CH 3 -SAMs, bilayers יהלומים ושומני מימן הסתיים) מוצגות. נחישותו של כוח ההידבקות, אורך ההידבקות והאנרגיה החופשית הם הציגו.
דוגמא 1: Desorption של polytyrosine מmonolayer עצמי התאספו
Desorption של polytyrosine מSAM הידרופובי בפתרונות שונים עם תוכן שונה של אתנול נמדד. בכל פתרון InvOLS שלוחה וקבועי קפיץ נקבעו כפי שתוארו לעיל, ולפחות 300 כוח דעקבות istance נרשמו לכל פתרון. כל הניסויים של קבוצה אחת ניסיונית נעשו עם שלוחה אחת ביום אחד, כדי להבטיח ושהעונה אחת פולי בודדים (חומצת אמינו) נמדד. מהירות הארכה / הנסיגה של שלוחה הייתה 0.5 מיקרומטר / sec ולהתעכב הזמן על פני השטח היה 1 שניות. עקבות מרחק הכוח הראו רמות של כוח קבוע. כל רמה הייתה מצוידת עם עקומת sigmoidal וכוח הרמה, כמו גם את אורך המישור נקבעו ולהתוות היסטוגרמה. היסטוגרמות היו מצוידת בגאוס וערך השיא, כמו גם סטנדרטי הווריאציה (שגיאה) של ההפצה הופקה. עד הסוף מאוד של רמת הכוח, המערכת נמצאת בשיווי משקל והאזור שמתחת לרמה לכן שווה לאנרגיה החופשית לכל אורך פולימר. רק התהליך עצמו הניתוק בסוף של הרמה הוא שבאינו שיווי משקל. מסיבה זו, לניסויים טיפוסיים אורך המישור ארוך יותר מequilibri אממ אורך (כ -30%) ואזור שמתחת לsigmoidal מתאים אומדן עליון לאנרגיה חופשית הידבקות 21.
עקבות איור 3. חיל () מרחק (נסיגה) של polytyrosine על תיל-SAM במים טהורים (באדום). רק מולקולה בודדת desorbs כפי שניתן לראות בירידה של שלב אחד בכח כדי נקודת ההתחלה (אפס כוח). כושר sigmoidal מוצג בשחור ואורך מישור חילוץ וכוח הרמה מסומנים על ידי חצים. (ב) Histograms של כוח רמת חילוץ למדידות במים טהורים ותערובות מים / אתנול עם תוכן אתנול טוחנת שונה. היסטוגרמות אורך (C) רמה של אותה קבוצת הניסוי. אורך רמת שיא מול כוח רמת שיא (D). "456 52456fig3large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3 א מציג עקבות כוח למרחקים יחידים של polytyrosine נמדדו במים טהורים. כוח הרמה ואורך מישור מופקים. אם יש רק אחד מולקולה על הקצה הdesorbed מSAM, היסטוגרמה אורך מישור תערוכות הפצה צרה וmonomodal (בדרך כלל בניסויי סטיית התקן בגאוס התאמה של היסטוגרמה האורך היא סביב 5-20 ננומטר). להיפך, אם יש שיא צר היחיד בהיסטוגרמה אורך מישור, אחד יכול להיות יחסית בטוח שכל קבוצת הניסוי נעשתה ובעונה אחת הפולימר. הסיבה לכך היא שpolytyrosines הוא polydispersive מאוד בגודלם (50 עד 100 KDA). לכן, שני פולימרים של בדיוק באותו האורך הם מאוד לא סבירים. הוספת אתנול מחלישה את האינטראקציה הידרופובי בין polytyrosine והמשטח 10,22 ומוביל לאנרגיה חופשית ספיחה נמוכה ובכך כוח רמה נמוך יותר כפי שניתן לראות בהיסטוגרמות כוח הרמה לתנאי ממס השונים מוצגים באיור 3. עכשיו זה יכול להיחקר איך אורך הרמה של polytyrosine יחיד משנה לאנרגיות חופשיות ספיחה שונות. כפי שניתן לראות באיור 3 ג אורך המישור יורד עם התוספת של אתנול. בה בעת ירידת כוח הרמה (איור 3D).
על מנת לקבל את כל הפרמטרים הרלוונטיים של תהליך desorption כלומר אורך הגובה, אורך Kuhn, אנרגיה חופשית הספיחה ושיעור desorption monomeric הפנימי, יש לשלב את המדידות שתוארו לעיל עם ניסויי מרחק קבועים. לפרטים ראו 21.
דוגמא 2: Desorption של פולימר השתל מלק g -PS מיהלומים הידרופובי
באיור 4 א ו4B עקומות כוח למרחקים טיפוסיים שהושגו עם מלק g -PS על יהלומים מוקשים במים בRT מוצגות. הזמן להתעכב על פני השטח היה 1 שניות והמהירות של שלוחה הייתה מיקרומטר 1 / sec. כך או מישורים של כוח קבוע (איור 4 א) או אירועי קרע נצפו (איור 4). למישורים של כוח קבוע, הגובה של מישורים נקבע עם sigmoidal כושר והערכים היו זממו בהיסטוגרמה (איור 4C). כדי לא לכלול שיא ההידבקות הנוקב הנגרם על ידי אינטראקציה ישירה של הקצה עם פני השטח (השיא הראשון בעקומת כוח-מרחק באיור 4), מקסימום הכוח במרחק מה מהמשטח נקבע. הערכים שהתקבלו לאירועי הקרע האלה אז היו זממו בהיסטוגרמה (איור 4D). לניתוח נוסף היסטוגרמות היו מצויד בגאוס והגובה המקסימאלי נבחר כערך ממוצע לנקודת נתונים. עם של ניסוי מסוג זה את ההשפעה של הנוכחות של רשתות בצד והארכיטקטורה שלהם נחקרה 14.
4. עקומות איור חיל-מרחק הכחשה הופיעו עם עמוד השדרה polyisoprene יניארי מורכב עם רשתות בצד פוליסטירן (מלק g -PS). כך או מישורים של כוח קבוע (A) או אירועי קרע (B) הם נצפו. למישורים של כוח קבוע, הגובה של מישורים נקבע עם sigmoidal כושר ולהתוות היסטוגרמה (C) ואילו לאירועי קרע, קרע הכח המקסימאלי נקבע (D). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.
דוגמא 3: הפקת Pho אחתspholipid (אפיפיור) מbilayer שומנים
5A איור מראה ייצוג סכמטי של תהליך חילוץ המולקולה הבודד. מדידות הפקה בוצעו על ידי אנכי מתקרב קצה AFM פונקציונליות-אפיפיור כלפי bilayer השומנים הנתמכים (לא מוצג). במגע של הקצה עם bilayer POPC, כוח קטן (~ 100 PN) נשמר קבוע על ידי לולאת משוב לכ -4 שניות. אם מולקולת האפיפיור מחדירה לתוך bilayer במהלך להתעכב הזמן הזה, הוא שלף או "חולץ" מbilayer על חוזר בי קצה AFM מbilayer. התוצאה היא עקומות כוח למרחקים אופייניות. הצורה שלהם היא בעצם נקבעת על ידי גמישות המתיחה של מקשר PEG ויכולה להיות מצוידת במודל שרשרת תולעת (WLC) 23. סופרפוזיציה של יותר מ -50 עיקולים מוצגת באיור 5. ניתן להכיר אירועי מולקולה בודדים אמיתיים בהיסטוגרמות כוח מחודדת אחת (איור 5 ג אונג>). שים לב שכדי לזכות בתובנה נוספת לתוך גודל הפרמטר מולקולרי מסוים (לדוגמא, זמן החיים הממוצע של שומנים בbilayers), יש צורך לבצע מדידות עם שיעורי כוח טעינה שונים. לניתוח נוסף של שומנים חד ניסויי חילוץ לראות 24.
5. סכמטי איור () להפקת של מולקולה יחידה מbilayer שומנים. שים לב כי המולקולה השומנית מצמיד קוולנטית לקצה. לכן, יכולים להתבצע רבים מאה או אפילו אלפי מחזורי כוח-חילוץ עם אחד ואותה מולקולה. סופרפוזיציה של יותר מ -50 עיקולי חילוץ 9 (ב). היסטוגרמה (C) של הפצת כוח החילוץ של הדוגמא המוצגת ב( B)."Target =" .jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| צעד | מטרה | מומס | ממס | יחס או ריכוז טיפוסי |
| Silanization | ליצור קבוצות אמינו על פני השטח שלוחה | APTES (3-Aminopropyl) תלת-ethoxysilane (למשל, Vectabond ™) | אצטון היבש | 01:50 (V / V) - 1: 100 (V / V) |
| PEGylation | לספק משטח שלוחה עם אמין או קבוצות תגובתי תיאול | NHS-PEG-NHS או Mal-PEG-NHS | כלורופורם יבש | .25-25 מ"מ |
| PEGylation | משטח שלוחה passivate | מתיל-PEG-NHS | כלורופורם יבש | 25 מ"מ |
| נטיה של מולקולת בדיקה | מולקולת בדיקה זוג באמצעות קבוצת אמינו או תיאול לPEG דו-תפקודי | מולקולת בדיקה (פולימר, שומנים בדם, וכו ') | כלורופורם יבש או חיץ borate | 0.1-10 מ"מ |
פתרונות 1. לוח דרוש לfunctionalization הקצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך העשורים האחרונים, ניסויי מולקולה בודדים סיפקו תובנות חסרות תקדים לתוך מנגנונים מולקולריים והתבררו להיות גישה לא יסולא בפז בתחום מדעי חיים ומעבר. כדי להשיג נתונים סטטיסטיים טובים ומשמעותיים מניסויי SMFS, באופן אידיאלי ובעונה אחת המולקולה משמשת מעל כל מהלך הניסוי. בניגוד לניסויים בהרכבים של מולקולות, ניסויי SMFS מסוגלים לזהות אירועים נדירים ומדינות מולקולריות מוסתרות. יתרון נוסף של ניסויי מולקולה בודדים הוא שהם יכולים להיות מודל באמצעות סימולציות דינמיקה מולקולריות 24,25.
פרוטוקול functionalization שלוחה שתואר לעיל הוא גרסה שונה של נהלים שפורסמו בעבר 26-28. לאחר ההפעלה וsilanization, שלוחה AFM היא פונקציונליות בתערובת של שני סוגים שונים של פוליאתילן גליקול (PEG) מולקולות (מולקולות מקשר).
s = "jove_content"> מקשר PEG הראשון סיומו על ידי קבוצה מתיל אינרטי ("מתיל-PEG"), והשני על ידי hydroxysuccinimide N- אמינו-reactive קבוצה (NHS) (או קבוצת maleimide תגובת תיאול), שבו מאוחר יותר במולקולת הבדיקה הוא מצומדת ("NHS-PEG", "Mal-PEG"). ראה איור 1 עבור סכמטי של functionalization הקצה. המטרה של PEG היא משולשת: ראשית, היא passivates משטח הקצה ולכן מונעת ספיחה נוקבת. שנית, באמצעות יחס מתיל-PEG / NHS-PEG מסוים מאפשר התאמת ריכוז NHS-PEG על פני השטח הקצה. ושלישית, הוא מפריד את הקצה ממולקולת הבדיקה ולכן מאפשר כימות של האינטראקציה מולקולה-פני השטח ללא הפרעה מאינטראקצית טיפ-פני השטח הישירה. אז מולקולת הבדיקה מצמיד קוולנטית לקצה באמצעות NHS-PEG (או Mal-PEG).
פרוטוקול זה מוודא כי כל אגרות החוב (*) ב& #8220; קצה שרשרת צימוד "* OH * silane * מולקולת הבדיקה PEG * הן קשרים קוולנטיים ולכן חזקים מאוד. זה בתורו, מאפשר ושהעונה אחת מולקולת הבדיקה נמדדת על פני כל תקופת הניסוי. זה כבר הודגם לעיל בסעיף תוצאות הנציג מראה ספקטרוסקופיה כוח המולקולה בודדת אמיתית.
איך ניתן לאמת שבאמת מולקולה בודדת נמדדה? עקבות יחידים עם מישורים של כוח קבוע, טיפה אחת לנקודת ההתחלה היא מספיק. אם פולימר אחד או יותר של desorbed באותו הזמן, הכוח יורד לאפס בכמה צעדים בדידים, כמו כל פולימר מתנתק בנקודה שונה. קשה יותר הוא להחליט אם זה כל פעם אותו המולקולה בודדת. לכן חלוקת אורכי ניתוק צריכה להיות מוערכת. הפצה צרה עם שיא בודד היא אינדיקציה טובה ושהעונה אחת המולקולה בודדת נבדקה בכל זכר כוח-הארכה. עקבות יחידים עם ruptאירועי יור, סופרפוזיציה של כל העקבות היא השיטה הטובה ביותר כדי להחליט אם (ובעונה אחת) המולקולה בודדת נמדד. לחלופין, כל עקבות יכולות להיות מצוידות עם מודל (WLC) ולאחר מכן גם את אורך ההתמדה ואורכי הקרע בכוח מוגדר ניתן להתוות. ההפצה של שני הפרמטרים האלה צריך להיות צרים ומחודד אחת.
לסיכום, הליך הכנה לחיבור של מגוון רחב של מולקולות בודדות לטיפי AFM הוצג. טיפ של AFM הקטן (רדיוס ~ 10 ננומטר), יכולות המיקום לרוחבה ורגישותה כוח לעשות את זה הכלי האידיאלי ללמוד את מאפייני ההדבקה של מולקולות בודדות על משטחים ביולוגיים ולא-ביולוגיים בכמעט כל נוזל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
