Abstract
Atomic force spektroskopi er et ideelt verktøy for å studere molekyler på overflater og grenseflater. En eksperimentell protokoll til par et stort utvalg av enkle molekyler kovalent på en AFM tips er presentert. Samtidig AFM spissen passiveres for å hindre uspesifikke interaksjoner mellom spissen og substratet, noe som er en forutsetning for å studere enkle molekyler festet til AFM spissen. Analyser å bestemme adhesjonskraften, vedheft lengde, og den frie energien av disse molekylene på faste overflater og bio-grensesnitt er kort tid presenteres og eksterne referanser til videre lesning er gitt. Eksempler på molekyler som er poly (aminosyre) polytyrosine, podepolymeren PI- g -ps og fosfolipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine). Disse molekylene desorberes fra forskjellige overflater som CH 3 -SAMs, hydrogen avsluttet diamant og støttet lipidbilag under ulike løsemiddel forhold. Endeligfordelene ved force spektroskopiske enkelt molekyl eksperimenter blir diskutert inkludert midler til å avgjøre om virkelig et enkelt molekyl har blitt studert i forsøket.
Introduction
I løpet av de siste 30 årene har atomic force mikroskopi (AFM) viste seg å være en verdifull avbildningsteknikk for å studere biologiske 1,2 og syntetiske tre materialer og overflater siden det gir molekylær romlig oppløsning i alle tre dimensjoner, og kan brukes i ulike løsemiddel miljøer. I tillegg AFM-enkelt molekyl kraft spektroskopi (SMFS) gjør det mulig å måle krefter som spenner fra PN til μN regime og har gitt enestående innsikt for eksempel i protein folding 4,5, polymer fysikk 6 - 8, og enkelt molekyl-overflate interaksjon 9 - 12 sikret rasjonale bak å studere enkeltmolekyler i stedet for et ensemble av molekyler er å unngå snitt effekter som ofte maskere sjeldne hendelser eller skjulte molekylære stater. Videre kan et mangfold av molekylære parametre som konturen lengde, Kuhn lengde, adhesjonen fri energi, etc. bliinnhentet. Dette er detaljert beskrevet i eksemplene nedenfor. I en typisk AFM-SMFS eksperimentet blir sondemolekyl koblet til en meget skarp spiss via et linkermolekyl. Spissen selv ligger ved enden av en bøyelig cantilever. Dersom spissen bringes i kontakt med overflaten til sonden molekylet skal samvirke med denne overflaten. Ved å betrakte avbøyningen av braket ved tilbaketrekkingen av spissen, den kraft, og således den frie energi, for å løsne molekylet fra overflaten kan bestemmes. For å få meningsfulle statistikk, et stort antall såkalte tvangs avstand kurver har å bli kjøpt opp. Videre, for å ha sanne enkelt molekyl forsøk (dvs. ved hjelp av en og samme sonde molekyl over varigheten av hele forsøket) sondemolekylet bør koples kovalent til AFM spissen. Her blir en eksperimentell protokoll for cantilever funksjonalisering med en enkelt molekyl via en kovalent binding presentert. Den eneste molekyl kan enten være koplet via en amino- eller en tiol gruppe til AFM spissen. Konjugeringen prosessen kan utføres i et bredt spekter av oppløsningsmidler (organisk og vandig) for å gjøre rede for solvatisering egenskaper av de polymerer som anvendes.
I den første del, en generell protokoll for kovalent å feste et enkelt molekyl ("probe-molekyl") via en linkermolekyl til en AFM spissen er beskrevet. Til dette formål er organiske NHS- eller maleimid-kjemien anvendt 13. Sammen med protokollen for tre eksempel molekyler, blir datainnsamling og dataanalyse prosesser beskrevet og referanser til videre lesning er gitt. Eksemplene molekyler er: (lineær) polymer tyrosin, podepolymeren PI- g -ps og lipid POPE. Dette inkluderer små variasjoner i protokollen, for eksempel for å kovalent feste cysteiner. I tillegg er en del dedikert til fremstilling av forskjellige overflater slik som en diamantoverflate, en CH3 -Self montert monolag og lipidbilag. Disse grensesnittene har provno for å være gode referanser og eksempler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se figur 2 for en oversikt over prosessen flyt omfatter forberedelse, de datainnsamling og dataanalyse trinn.
1. Reagens Setup
MERK: Alle kjemikalier må håndteres med forsiktighet, og dermed en laboratoriefrakk, hansker og vernebriller bør brukes. Alle operasjoner må utføres i et laboratorium hette. Særlig bør spesialhansker i tilfelle av kloroform bruk.
- Bruke kjemikalier med lavt vanninnhold, som tørr kloroform raskt og lagre tørr, men ikke lenger enn en uke. Lagre begge kjemikalier ved -20 ° C og under nitrogen eller argongass, fordi APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilan) (se tabell 1) og PEG (polyetylenglykol) er hygroskopisk og PEG er underlagt oksidasjon i luft.
- For å unngå hyppig eksponering av bestanden til atmosfærisk oksygen og fuktighet, forberede mindre porsjoner, helst innen et hanskerom system med en nitrogen atmosphere.
2. Utstyr Setup
MERK: For å unngå mulig krysskontaminering, bruke friske og rene fartøy for hvert trinn.
- Rent glass og pinsett i vaskemiddel i 30 minutter i et ultralydbad ved 60 ° C.
- Skyll og sonikere utstyr fra trinn 2.1 to ganger grundig med ultrarent vann.
- Varmeutstyr fra trinn 2.1 i RCA-løsning (ultrarent vann, hydrogenperoksyd og ammoniakk (5: 1: 1)) til 75 ° C i en ovn i 45 minutter og deretter skylles med ultrarent vann.
- Til slutt tørke glass og pinsett under en strøm av tørt nitrogen eller i en ovn (100 ° C, 3 timer).
3. Tips funksjon
MERK: Bruk pinsett, skip, etc. laget av rustfritt stål, PTFE, glass eller annet materiale som er kjemisk stabilt i organiske løsninger hvis det er aktuelt. Med mindre annet er spesifisert, utføre alle trinnene på RT. Mengden av inkubering oppløsning som er nødvendig, avhenger av antallet av cantilever chips. Kontroller at Bommene er nedsenket i de respektive løsninger til all tid.
MERK: Bruk en hette for å unngå innånding av organiske damper.
- Dannelse av OH-grupper på overflaten cantilever ('aktivering') (ca. 0,5 timer):
- Bruk pinsett til å plassere ferske cantilever chips (materiale: SiN, våren konstant: 10-100 PN / nm) på et rent glass lysbilde og legg dem i en plasmakammer (100 W).
- Evakuere kammer (~ 0,1 mbar).
- Flom kammer med oksygengass og evakuere igjen.
- Aktiver plasmaprosessen (strøm: 20%, varighet: 15 min, prosesstrykk: 0,25 mbar).
- Amino-silanisering av utkraginger (ca. 1 time):
- Forberede de 2,5 ml APTES løsning (se tabell 1) i et glass petriskål - gjør dette ideelt under plasmaprosessen.
- Immediately etter plasmaprosessen, dypp hver cantilever for 1 sek i aceton og plassere dem umiddelbart etterpå i APTES løsning.
- Inkuber i 15 minutter ved RT.
- Omhyggelig skylling brakett chips to ganger i 10 ml aceton og en gang i 10 ml kloroform.
- Valgfrie endelige skritt: Place cantilever chips fra forrige trinn på et rent glass lysbilde og stek dem i 30 minutter ved 70 ° C. Legg merke til at det finnes også alternative strategier for overflate aktivering, f.eks UV-behandling 12.
- PEGylering (ca. 2 timer):
MERK: Utfør trinn 3.3.1-3.3.4 under amino-silanisering. NHS og maleimidgrupper er utsatt for hydrolyse i vandige miljøer, og PEG i seg selv er utsatt for oksidasjon i luft. Derfor timing (spesielt i mellom trinnene) er en kritisk parameter. Referere til 13 for ytterligere informasjon.- Klargjør kloroform-løsning (se tabell 1).
- For å unngå kondens, Pulver varm PEG opp til RT før du åpner delmengde og veier det aktuelle beløpet.
- For kobling av polymerer eller lipider med aminogrupper, hver for seg løse NHS-PEG-NHS (6 kDa) og metyl-PEG-NHS (5 kDa) i kloroformoppløsning ved å virvle dem før de er helt løst. Se tabell 1 for konsentrasjoner.
- Alternativt. for kobling av polymerer med tiolgrupper separat løse Mal-NHS- PEG og metyl-PEG-NHS i kloroformoppløsning.
- Bland de løsninger som er nødvendig for å justere et visst antall forholdet mellom NHS- eller maleimide- og metyl--terminerte PEG-molekyler (typisk 1: 500). Legg merke til at det ideelle forholdet har ikke bestemt iterativt i en serie av forberedelse-eksperimentet sykluser.
- Inkuber cantilever chips i PEG-løsning i 1 time i en kloroform mettet atmosfære for å hindre fordampning av kloroform.
- Probemolekylet konjugering(> 1 time):
MERK: I følgende 3.4.1-3.4.3, er tre eksempler for kovalent kobling av ulike probemolekyler til AFM spissen beskrevet. For hvert molekyl protokollen må justeres. Videre noten, som i eksempel 1 og 3 NHS-kjemien anvendes mens det i eksempel 2 tiol funksjonalisert polymer PI- g -ps er koplet til via PEG-maleimid kjemi. For mer informasjon se 14.- For poly (aminosyre) poly-L-tyrosin (40-100 kDa)
- Oppløse polytyrosine konjugert probemolekyl i 1 M NaOH. Juster konsentrasjon på 1 mg / ml.
- Utveksle NaOH for natriumborat buffer (pH 8,1) ved hjelp av spin avsaltings kolonner (7 kDa MWCO) umiddelbart før funksjon
- Skyll bommene først med 5 ml kloroform og deretter med 5 ml etanol og til slutt med 5 ml boratbuffer.
- Inkuber cantilever chips for 1 time i polytyrosine borat bufferløsning og skyll med borat bufferog ultrarent vann. Lagre i ultrarent vann til målingen.
- For polymerer med en lineær ryggrad (polyisopren, 119 kDa) som har podede sidekjeder (polystyren, 88 kDa) 14
- Oppløse PI- g -ps i tørr kloroform. Juster konsentrasjonen av konjugering løsning på 4 mg / ml.
- Skyll bommene med 5 ml kloroform og inkuberes i minst 1 time i konjugasjon løsning.
- Skyll på nytt i 5 ml kloroform og lagre i kloroform i et kloroform-mettet miljø (for å forhindre fordampning kloroform) før målingen.
- For lipid POPE
- Oppløse PAVEN i tørr kloroform. Juster konsentrasjonen til 20 mm.
- Skyll bommene med 5 ml etanol og 5 ml ultrarent vann før inkubering av bommene i 1 time i lipidoppløsningen.
- Etter inkubasjon skylles bommer med 5 ml kloroform, 5 ml ethanol og 5 ml varm, ultrarent vann (i denne rekkefølge) for å fjerne ubundet probe-molekyler, og å kvitte seg med kloroform rester. Bruke funksjon tips umiddelbart. Alternativt, lagre dem i kloroform inntil nødvendig.
- For poly (aminosyre) poly-L-tyrosin (40-100 kDa)
Figur 1. (A) Skjematisk viser spissen funksjonprosessen ved hjelp av eksempel på NHS kjemi. (B) Kjemisk binding ansatt for å feste en sonde molekyl til spissen via en aminogruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
4. Overflatebehandling
- Selv-montert monolayer (SAM)
MERK: Som underlag for det første eksemplet, ble en egenmontert monoskikt valgt. Referere til litteratur 15 - Rene glassplater med vaskemiddel, og deretter to ganger i ultrarent vann i et ultralydbad i 30 min hver. Deretter, som et ytterligere rensetrinn, plassere dem i RCA-løsning (se trinn 2.3) ved 75 ° C i 15 min.
- Smør lysbilder med 10 nm krom nikkel og 100 nm gull i et vakuum coater. Så lagrer i kjøleskapet og ren igjen i RCA løsning direkte før til neste trinn.
- Inkuber lysbilder av det forrige trinnet i 2 mm 1-dodecanthiol / etanol-løsning i 12 timer. De tiolgrupper binde til gull overflate og en hydrofob monolag selv monterer. Skyll de glir med etanol og ultrarent vann, og deretter tørke med en strøm av nitrogengass. Bekrefte hydrofobisiteten til den preparerte overflaten med statiske kontaktvinkelmålinger i et goniometer med et CCD-kamera 10.
MERK: Som en overflate for det andre eksemplet, ble en hydrogen terminert diamant valgt. Forbehandlingen ble utført som beskrevet tidligere 16.
MERK: I det siste eksemplet, ble en overflate støttet lipidbilag (SLB) brukes som underlag. For å oppnå en slik overflate, ble en oppløsning (0,1 mg / ml) av store unilamellære vesikler (LUV'er) som består av fosfolipidet POPC dannet ved ekstrudering metode. Deretter 50 ul av LUV løsningen ble satt på en fersk spaltet glimmer ark (A = 1 cm²) og inkubert i 30 min. Til slutt ble løsningen vasket med 20 ml ultrarent vann. Se 17,18 for en detaljert beskrivelse av utarbeidelse av SLBs.
5. Data Acquisition
MERK: For forsøkene, bruk en AFM, som gir mulighet til å måle i væsker. De datainnsamling og dataanalyse prosedyrer får anvendelse uavhengig av AFM modellen som brukes. Videre er det i noen eksperimenter er det fordelaktig å ha mulighet til å kontrollere temperature inne i væske cellen. Cantilever nedbøyning ble oppdaget via laserstrålen nedbøyning metode 19. Fjærkonstanter ble bestemt med termisk støy metode 20.
- Sett funksjon cantilever i en AFM cantilever-holder som er egnet for måling i væsker.
- Sett overflaten (forberedelse se ovenfor) å bli samplet inn i AFM og dekke den med væske. Begge bør cantilever og overflaten nå være nedsenket i væsken med cantilever spissen pekende mot overflaten. Legg merke til at i mange tilfeller en væskedråpe er nok. I alle fall fordampning av væsken bør unngås, for eksempel ved hjelp av et lukket fluidcellen.
- Eventuelt justere ønsket temperatur på kontrolleren.
- La systemet stabilisere seg i minst en halv time.
- Spill inn en termisk støy spekteret av cantilever med cantilever langt vekk fra overflaten for å utelukke enhver overflate demping effekter. Legg merke til at vanligvis en0 eller flere spektra har til å bli akkumulert for å oppnå et tilstrekkelig signal-til-støy-forholdet.
- Nærme overflaten. Merk at for å spare tips geometri og tips funksjon tilnærming prosessen må utføres nøye. Dette kan oppnås ved, for eksempel, som nærmer seg i intermitterende kontakt-modus.
- Bestem den inverse optisk spaken følsomhet (InvOLS) målt i nm / volt. Gjør dette ved å trykke på cantilever spissen mot en hard overflate.
- Bestem InvOLS ved å måle helningen av piezo reiseavstanden vs. endring i fotodiodespenning. Passe til en linje i en del av den kraft-avstand kurve hvor braket spissen er i kontakt med overflaten. I forsøk med en myk overflate som lipidbilag, utføre dette trinnet på områder som ikke er dekket med et lipidbilag ('defekte flekker').
- Bestem fjærkonstant (pN / nm) ved å montere en harmonisk oscillator til den termiske støyspektrum. Brukautomatisert programvare funksjon for våren konstant besluttsomhet; ellers kontakt litteratur 20.
- Start av eksperimentet.
- Rekord mange kraft-distanse kurver på hver eksperimentell betingelse. Vanligvis kan du bruke følgende verdier for de eksperimentelle parametere: samplingsfrekvens på 5 kHz, tips hastighet på 1 mikrometer / sek, trekke avstand på 1 mikrometer.
MERK: noen ganger, avhengig av dynamikken i den studerte eksperimentet, kan det være nødvendig å vente en viss tid med spissen i kontakt med overflaten ("holdetid").
MERK: Eksperimentet bestemte parametere kan avvike vesentlig fra de angitte verdier. - Under langtidsmålinger, null laser posisjon på fotodioden fra tid til annen ved å plassere fotodiode.
- Valgfritt: Etter hver kraft kurve, flytte AFM-spissen til en annen xy posisjon.
- Ved slutten av eksperimentet, bestemme sensitiviteten og fjæren constant på nytt å se etter konsistens og stabilitet i systemet.
MERK: Sammenligning av fjærkonstanten og følsomhet før og etter forsøket er også et middel for å sikre at egenskapene til systemet og egenskapene til spissen forble uendret i løpet av forsøket. Hvis differansen av fjærkonstant ikke er for stor (<= 15%), kan de bli midlet, siden den iboende usikkerheten av fjærkonstant bestemmelse er også rundt 15%. For større forskjeller, er det lurt å først finne og eliminere årsaken til endring tilsynelatende våren konstant før du fortsetter med ytterligere eksperimenter.
- Rekord mange kraft-distanse kurver på hver eksperimentell betingelse. Vanligvis kan du bruke følgende verdier for de eksperimentelle parametere: samplingsfrekvens på 5 kHz, tips hastighet på 1 mikrometer / sek, trekke avstand på 1 mikrometer.
6. data Forberedelse
MERK: I denne delen generell data forberedelse trinn som vanligvis gjennomføres uavhengig av den spesifikke type eksperiment for å konvertere enheter til Newton og nanometer samt å korrigere dataene er beskrevet. Eksperimentet spesifikke dataanalyser er briefly nærmere beskrevet i det respektive representativt eksempel-delen.
- Vanligvis utføre all data forberedelse og analyse trinn automatisk av en hjemme skrevet algoritme, for eksempel basert på programvaren IGOR Pro 6.
- Konvertere den rå nedbøyning signal (Defl) [V] i kraft ved å multiplisere den med InvOLS [nm / V] og våren konstant [NN / nm].
- Forskyvning av kraften på en slik måte at kraften på cantilever i tilstrekkelig avstand fra overflaten (losses cantilever) blir 0 nN.
- Beregne den faktiske spissposisjon (også kalt separasjon når målt i forhold til overflaten) z *, som tar bøyningen av braket i betraktning:
- Offset z * på en slik måte at z * = 0 svarer til z-posisjonen til overflaten.
MERK: Her er F kraften som virker på spissen og dermed bøyes cantilever (bestemt i trinn 6.2.), z er den målte z-sensorposisjon (direkte gitt av apparatet) og k representerer fjærkonstanten (bestemt i trinn 5.8).
Figur 2. Prosess flytdiagram som viser prøveopparbeidelse, den datainnsamling og dataanalyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det følgende er resultatene for de ovenfor beskrevne eksempel molekyler, nemlig polymerer som poly (aminosyre) polytyrosine, podepolymeren PI- g -ps og fosfolipid POPE, er presentert. Først for hvert eksempel eksperimentere spesifikke opplysninger om datainnsamling og data forberedelse er gitt. Deretter blir de eksempelvise resultatene for forsøk hvor disse molekyler ble desorbert fra forskjellige overflater (CH3 -SAMs, hydrogenterminerte diamant og lipidbilag) vist. Bestemmelse av adhesjonskraften, klebelengden og den frie energi er innført.
Eksempel 1: Desorpsjon av polytyrosine fra selv montert monolayer
Desorpsjon av polytyrosine fra en hydrofob SAM i forskjellige løsninger med et varierende innhold av etanol, ble målt. I hver oppløsning brakett InvOLS og fjærkonstanter ble bestemt som beskrevet ovenfor, og minst 300 kraft distance spor ble registrert for hver løsning. Alle eksperimenter av en forsøkssett ble utført med en enkel utligger på en enkelt dag for å sikre at en og samme enkelt poly (aminosyre) ble målt. Utvidelsen / tilbaketrekkings hastigheten til cantilever var 0,5 mikrometer / sek og holdetiden på overflaten var 1 sek. Force avstand spor viste platåer med konstant kraft. Hver platå var utstyrt med en sigmoidal kurve, og platået kraften samt platået lengden ble bestemt og plottet i et histogram. Histogrammene ble utstyrt med en Gaussisk, og toppverdien, samt standard variasjon (feil) av fordelingen ble ekstrahert. Helt til slutten av kraften platået, er systemet i likevekt og området under platået tilsvarer derfor fri energi per polymer lengde. Bare den løsgjøring prosessen selv ved slutten av platået er i ikke-likevekt. På grunn av dette, for typiske eksperimenter platået lengde er lengre enn den equilibri um lengde (ca 30%) og området under sigmoide passer en øvre estimat for vedheft fri energi 21.
Figur 3. (A) Force avstand trace (tilbaketrekking) av polytyrosine på en metyl-SAM i rent vann (vist i rødt). Bare et enkelt molekyl desorberer som kan sees i det eneste trinn dråpe av kraften til grunnlinjen (null kraft). Den sigmoidal fit vises i svart og den utpakkede platå lengde og platå kraft er indikert med piler. (B) histogrammer av den ekstraherte platå kraft for målinger i rent vann og i vann / etanol-blandinger med forskjellig molar etanolinnhold. (C) Plateau lengde histogrammer av den samme eksperimentelle oppsettet. (D) Peak platå lengde vs topp platået kraft. "456 / 52456fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3A viser en enkelt kraft-avstand spor av polytyrosine målt i rent vann. Plateau kraft og platå lengde er hentet. Dersom det bare er ett molekyl på spissen som er desorbert fra SAM, viser platå lengde histogrammet en smal og monomodal fordeling (typisk i eksperimenter standardavviket i en gauss tilpasning av lengden histogram er rundt 5 til 20 nm). Omvendt, hvis det er bare en smal topp i histogrammet platå lengde, kan være forholdsvis sikker på at hele forsøkssett ble utført med en og samme polymer. Grunnen til dette er at de er svært polytyrosines polydispersive i størrelse (50 til 100 kDa). Derfor er to polymerer av nøyaktig samme lengde er høyst usannsynlig. Tilsetning av etanol svekker hydrofob interaksjon mellom polytyrosine og overflaten 10,22 ogfører til en lavere adsorpsjon fri energi, og således til en lavere platåkraft som kan sees i de platåstyrke histogrammer for de forskjellige oppløsningsmiddelforhold som er vist i figur 3B. Nå kan det undersøkes hvor platået lengden av en enkelt polytyrosine endres for forskjellige adsorpsjon frie energier. Som det kan ses i figur 3C platået lengden avtar med tilsetning av etanol. Samtidig de platå kraft avtar (Figur 3D).
For å oppnå alle relevante parametere for desorpsjon prosessen nemlig konturen lengde, Kuhn lengde, adsorpsjon fri energi og den iboende monomere desorpsjon sats, har man å kombinere de ovenfor beskrevne målinger med konstant avstand eksperimenter. For mer informasjon se 21.
Eksempel 2: Desorpsjon av podepolymeren PI- g -ps fra en hydrofob diamant
I figur 4A 4B typisk kraft-avstandskurver oppnådd med PI- g -ps på hydrogenert diamant i vann ved romtemperatur er vist. Oppholdstiden på overflaten var 1 sek, og hastigheten av braket var 1 pm / sek. Enten platåer med konstant kraft (figur 4A) eller ruptur hendelser observert (Figur 4B). For platåer av en konstant kraft, ble høyden av platåer bestemt med en sigmoidal form og verdiene ble plottet i et histogram (figur 4C). For å utelukke uspesifikke adhesjon topp som skyldes direkte interaksjon av spissen med overflaten (første topp i den kraft-avstand kurven i figur 4B), ble den maksimale kraft i en viss avstand fra overflaten bestemmes. De oppnådde verdier for disse brudd hendelser ble deretter plottet i et histogram (figur 4D). For videre analyse histogrammene ble utstyrt med en Gauss og maksimal høyde ble valgt som en gjennomsnittsverdi fordatapunkt. Med denne type eksperiment påvirkning av tilstedeværelsen av sidekjeder og deres arkitektur ble undersøkt 14.
Figur 4. Force fjern retraksjonslinjer kurver utført med en lineær polyisopren ryggrad podet med polystyren sidekjeder (PI- g -ps). Enten platåer med konstant kraft (A) eller ruptur hendelser (B) er observert. For platåer med konstant kraft, er høyden på platåer bestemmes med en sigmoidal passform og plottet i et histogram (C), mens for ruptur arrangementer er maksimal bruddstyrken bestemmes (D). Klikk her for å se en større versjon av dette figur.
Eksempel 3: Utvinning av en enkelt phospholipid (POPE) fra et lipidbilag
Figur 5A viser en skjematisk fremstilling av ett molekyl utvinningsprosessen. Utvinnings målinger ble utført ved vertikalt nærmer POPE-funksjonalisert AFM spissen mot den understøttede lipidbilag (ikke vist). Ved kontakt av spissen med POPC dobbeltlaget, er en liten kraft (~ 100 pN) holdes konstant ved hjelp av en tilbakekoblingssløyfe for omtrent 4 sek. Hvis PAVEN molekylet setter inn bilaget i løpet av denne holdetid, er det trukket ut eller "hentet" fra bilaget på trekke tilbake AFM spissen fra bilaget. Dette resulterer i karakteristiske styrkeavstandskurver. Deres form er i hovedsak bestemt av strekking elastisitet av PEG-linker, og kan utstyres med et wormlike kjede (WLC) modell 23. En overlagring av mer enn 50 kurver er vist i figur 5B. Sanne enkelt molekyl hendelser kan bli gjenkjent av enkelt toppet force histogrammer (figur 5C ong>). Legg merke til at for å få ytterligere innsikt i størrelsen av visse molekylære parameteren (f.eks, den midlere levetid av lipider i bilag), er det nødvendig å utføre målinger med forskjellig kraft belastningsgrader. For ytterligere analyse av enkelt lipid utvinning eksperimenter se 24.
Figur 5. (A) Skjematisk for utvinning av et enkelt molekyl av et lipidbilag. Legg merke til at lipid molekyl er kovalent bundet til tuppen. Derfor kan mange hundre eller til og med tusenvis av kraft-uttrekningssykluser utføres med ett og samme molekyl. (B) overleiring mer enn 50 utvinnings kurver 9. (C) histogram av avtrekkerkraft fordeling av eksempelet vist i (B)..jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Trinn | Formål | Oppløst stoff | Løsemiddel | Typisk forhold eller konsentrasjon |
| Silanisering | Lag aminogrupper på cantilever overflaten | APTES (3-aminopropyl) tri-ethoxysilane (f.eks Vectabond ™) | tørr aceton | 01:50 (v / v) - 1: 100 (volum / volum) |
| PEGylering | Gi cantilever overflate med amino eller tiol reaktive grupper | NHS-PEG-NHS eller Mal-PEG-NHS | tørr kloroform | 0,25 til 25 mM |
| PEGylering | Passivere cantilever overflaten | metyl-PEG-NHS | tørr kloroform | 25 mM |
| Bøyning av probemolekyl | Par probe-molekyl via en amino- eller tiolgruppe for bifunksjonelle PEG | probemolekyl (polymer, lipid, etc.) | tørr kloroform eller borat buffer | 0.1-10 mM |
Tabell 1. Solutions nødvendig for tipset funksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I løpet av de siste tiårene, har enkelt molekyl eksperimenter gitt enestående innsikt i molekylære mekanismer og viste seg å være en uvurderlig tilnærming i life science og utover. For å oppnå gode og meningsfulle statistikker fra SMFS eksperimenter, ideelt sett en og samme molekyl blir brukt over hele forløpet av eksperimentet. I motsetning til forsøk med ensembler av molekyler, SMFS eksperimenter er i stand til å oppdage sjeldne hendelser og skjulte molekylære stater. En annen fordel med enkelt molekyl eksperimenter er at de kan bli modellert ved hjelp av molekylære dynamikksimuleringer 24,25.
Cantilever funksjon protokoll som er beskrevet ovenfor er en modifisert versjon av fremgangsmåtene som tidligere er publisert 26 - 28. Etter aktivering og silanisering, er AFM cantilever funksjonalisert med en blanding av to forskjellige typer av polyetylen-glykol (PEG) molekyler (linkermolekyler).
N- hydroksysuksinimid (NHS) gruppe (eller en tiol-reaktivt maleimid-gruppe), der senere på sonden molekyl konjugeres ("NHS-PEG", "Mal-PEG"). Se figur 1 for en skjematisk av spissen funksjonalisering. Formålet med PEG er tredelt: Først passive det tuppoverflaten, og derfor forhindrer uspesifikk adsorpsjon. For det andre, ved hjelp av en viss metyl-PEG / NHS-PEG-forholdet gjør det mulig for justering av NHS-PEG-konsentrasjon på tuppoverflaten. Og for det tredje, skiller den tuppen fra sonden molekylet, og derfor gjør det mulig for kvantifisering av molekylet-overflate interaksjon uten interferens fra den direkte spiss-overflate interaksjon. Da sonden molekyl er kovalent bundet til tuppen via NHS-PEG (eller Mal-PEG).
Denne protokollen sørger for at alle obligasjoner (*) i & #8220; kopling kjeden "tips * OH * silan * PEG * probemolekyl er kovalente bindinger og derfor veldig sterk. Dette i sin tur gjør det mulig at en og samme sonde molekyl måles over hele varigheten av forsøket. Dette har blitt eksemplifisert ovenfor i den representative resultater snitt som viser sann enkelt molekyl kraft spektroskopi.
Hvordan kan verifiseres som virkelig et enkelt molekyl måles? For enkelt spor med platåer med konstant kraft, er nok en eneste dråpe til grunnlinjen. Hvis mer enn én polymer desorberes på samme tid, faller styrken til null i flere atskilte trinn, som hver polymer løsner på et annet punkt. Vanskeligere er å avgjøre om det er hver gang den samme enkelt molekyl. Derfor fordelingen av adskillelses lengder må bli vurdert. En smal fordeling med en enkelt topp er en god indikasjon på at ett og samme molekyl ble undersøkt i hvert forlengelseskraft-trase. For enkelt spor med Rupture hendelser, er overlagringen av alle spor den beste metode for å bestemme om (en og samme) enkelt molekyl ble målt. Alternativt kan hvert spor være utstyrt med en (WLC) modell og deretter begge utholdenhet lengde og bruddlengder på en definert kraft kan plottes. Fordelingen av disse to parametrene må være smale og enkelt toppet.
I konklusjonen, har en forberedelse prosedyre for å feste et stort utvalg av enkle molekyler til AFM tips blitt presentert. AFM lille spissen (radius ~ 10 nm), dets lateral posisjonering evner og sin kraft følsomhet gjør det til et ideelt verktøy for å studere adhesjonsegenskapene av enkle molekyler på biologiske og ikke-biologiske overflater i nesten hvilken som helst væske.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
