Abstract
Espectroscopia de fuerza atómica es una herramienta ideal para estudiar moléculas en superficies e interfaces. Se presenta un protocolo experimental para acoplar una gran variedad de moléculas individuales de forma covalente a una punta de AFM. Al mismo tiempo la punta del AFM se pasiva para evitar interacciones no específicas entre la punta y el sustrato, que es un requisito previo para estudiar moléculas individuales unidos a la punta del AFM. Los análisis para determinar la fuerza de adhesión, la longitud de la adhesión, y la energía libre de estas moléculas en superficies sólidas y bio-interfaces son poco presentaron y se proporcionan referencias externas de lectura adicional. Moléculas ejemplo son los politirosina poli (aminoácido), polímero de injerto PI- g -PS y el Papa fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas son desorbidos de diferentes superficies como CH 3 -SAMs, hidrógeno terminado diamante y apoyaron bicapas lipídicas en diversas condiciones de disolvente. Por último, laventajas de la fuerza espectroscópicas única molécula de experimentos se discuten incluyendo medios para decidir si realmente una sola molécula se ha estudiado en el experimento.
Introduction
Durante los últimos 30 años, la microscopía de fuerza atómica (AFM) ha resultado ser una técnica de formación de imágenes valiosa para estudiar biológicos y sintéticos 1,2 3 materiales y superficies, ya que proporciona una resolución espacial molecular en las tres dimensiones y puede ser operado en varios disolvente ambientes. Además, AFM-fuerza única molécula de espectroscopia (SMF) permite medir las fuerzas que van desde la pN a μN régimen y ha dado una visión sin precedentes, por ejemplo, en el plegamiento de proteínas 4,5, física de polímeros 6-8, y la interacción molécula-superficie solo 9 - 12 .La razón detrás de estudio de las moléculas individuales en lugar de un conjunto de moléculas es evitar los efectos que a menudo enmascaran eventos raros o estados moleculares promedio ocultos. Además, una multitud de parámetros moleculares, tales como la longitud de contorno, la longitud Kuhn, la energía libre de adherencia, etc. puede serobtenido. Esto se detalla en los ejemplos siguientes. En un experimento típico de AFM-SMFS, la molécula de sonda se acopla a una punta muy afilada a través de una molécula de engarce. La punta en sí está situado en el extremo de un voladizo flexible. Si la punta se pone en contacto con la superficie de la molécula de sonda va a interactuar con esta superficie. Mediante la observación de la deflexión del voladizo después de la retracción de la punta, la fuerza, y por lo tanto la energía libre, para separar la molécula de la superficie puede ser determinada. Para obtener estadísticas significativas, un gran número de las llamadas curvas de fuerza-distancia tienes que estar adquirida. Además, para tener una verdadera experimentos sola molécula (es decir, utilizando una y la misma molécula de sonda sobre la duración de todo el experimento) la molécula sonda debe estar acoplado de forma covalente a la punta del AFM. Aquí, se presenta un protocolo experimental para funcionalización en voladizo con una sola molécula a través de un enlace covalente. La molécula sola o bien se puede acoplar a través de un amino o un tiol grupo a la punta del AFM. El proceso de conjugación se puede realizar en una amplia variedad de disolventes (orgánica y acuosa) para tener en cuenta las propiedades de solvatación de los polímeros utilizados.
En la primera parte, un protocolo general para unir covalentemente una molécula única ("molécula de sonda") a través de una molécula de unión a una punta de AFM se describe. Para este fin, NHS orgánico o maleimida-química se utiliza 13. Junto con el protocolo de tres moléculas ejemplo, los procesos de adquisición de datos y análisis de datos se describen y se proporcionan referencias para lectura adicional. Los ejemplos de moléculas son: la (lineal) tirosina polímero, el polímero de injerto PI- g-PS y el Papa de los lípidos. Esto incluye ligeras variaciones del protocolo, por ejemplo para unir covalentemente cisteínas. Además, una sección está dedicada a la preparación de diferentes superficies tales como una superficie de diamante, un CH 3 monocapa -placas, montado y bicapas lipídicas. Estas interfaces tienen proven ser buenas referencias y ejemplos.
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Protocol
NOTA: Consulte la Figura 2 para una visión general del flujo del proceso que comprende la preparación, las medidas de adquisición de datos y análisis de datos.
1. Reactivo de instalación
NOTA: Todos los productos químicos deben ser manejados con cuidado, y por lo tanto una bata de laboratorio, se deben usar guantes y protección para los ojos. Todas las operaciones deben realizarse en una campana de laboratorio. En particular, guantes especiales deben ser usados en caso de uso cloroformo.
- Utilice productos químicos con bajo contenido de agua como el cloroformo seco rápidamente y almacenar en seco, pero no más de una semana. Almacenar tanto los productos químicos a -20 ° C y bajo gas nitrógeno o argón porque APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) (véase la Tabla 1) y PEG (polietilenglicol) son higroscópicos y PEG está sujeta a la oxidación en el aire.
- Para evitar la exposición frecuente de las existencias al oxígeno atmosférico y la humedad, preparar alícuotas más pequeñas, idealmente dentro de un sistema guantera con un atmosphe nitrógenore.
2. Equipo de instalación
NOTA: Para evitar una posible contaminación cruzada, utilice vasos fresca y limpia para cada paso.
- Cristalería limpia y pinzas en una solución de detergente durante 30 minutos en un baño de ultrasonidos a 60 ° C.
- Enjuague y equipos sonicado desde el paso 2.1 dos veces a fondo con agua ultrapura.
- Equipos de calor desde el paso 2.1 en solución RCA (agua ultrapura, peróxido de hidrógeno y amoniaco (5: 1: 1)) a 75 ° C en un horno durante 45 min y posteriormente enjuagar con agua ultrapura.
- Por último, secar el material de vidrio y pinzas bajo una corriente de nitrógeno seco o en un horno (100 ° C, 3 h).
3. Sugerencia funcionalización
NOTA: Use pinzas, vasos, etc. hecho de acero inoxidable, PTFE, vidrio o cualquier otro material que es químicamente estable en soluciones orgánicas si es aplicable. A menos que se especifique lo contrario, llevar a cabo todos los pasos en RT. La cantidad de solución de incubación necesarios depende del número de chips en voladizo. Asegúrese de que los voladizos se sumergen en las respectivas soluciones en todos los tiempos.
NOTA: Use una campana para evitar la inhalación de los vapores orgánicos.
- Formación de grupos OH en la superficie en voladizo ("activación") (aproximadamente 0,5 horas):
- Use pinzas para colocar las fichas frescas en voladizo (materiales: SiN, constantes de primavera: 10 a 100 pN / nm) en un portaobjetos de vidrio limpio y los puso en una cámara de plasma (100 W).
- Evacuar cámara (~ 0,1 mbar).
- Cámara de inundación con gas oxígeno y evacuar de nuevo.
- Activar el proceso de plasma (potencia: 20%, duración: 15 min, presión de proceso: 0,25 mbar).
- Amino-silanización de voladizos (aproximadamente 1 hora):
- Preparar los 2,5 ml de solución APTES (ver Tabla 1) en una placa de Petri de vidrio - hacer esto muy bien durante el proceso de plasma.
- Immediately después del proceso de plasma, sumerja cada voladizo durante 1 segundo en acetona y colóquelos inmediatamente después en la solución APTES.
- Incubar durante 15 min a TA.
- Enjuagar cuidadosamente las fichas en voladizo dos veces en 10 ml de acetona y una vez en 10 ml de cloroformo.
- Opcional finales paso: Virutas Place voladizo desde el paso anterior en un portaobjetos de vidrio limpio y hornear durante 30 minutos a 70 ° C. Tenga en cuenta que también hay estrategias alternativas para la activación de la superficie, por ejemplo, tratamiento UV 12.
- PEGilación (aproximadamente 2 horas):
NOTA: Realizar pasos 3.3.1-3.3.4 durante amino-silanización. NHS y grupos maleimida están sujetas a la hidrólisis en ambientes acuosos y la propia PEG está sujeto a la oxidación en el aire. Por lo tanto temporización (especialmente entre los pasos) es un parámetro crítico. Consulte 13 para más información.- Preparar la solución de cloroformo (ver Tabla 1).
- Para evitar la condensación, Cálido PEG empolva hasta RT antes de abrir la alícuota y pesando la cantidad apropiada.
- Para el acoplamiento de los polímeros o lípidos con grupos amino, por separado resolver NHS-PEG-NHS (6 kDa) y metil-PEG-NHS (5 kDa) en la solución de cloroformo por agitación hasta que se disuelvan completamente. Consulte la Tabla 1 para las concentraciones.
- Alternativamente. para el acoplamiento de polímeros con grupos tiol resolver por separado Mal-NHS-PEG y metil-PEG-NHS en la solución de cloroformo.
- Mezclar las soluciones según sea necesario para ajustar una cierta relación entre el número de NHS o la maleimide- y las moléculas de PEG terminado en metilo (típicamente 1: 500). Tenga en cuenta que la proporción ideal tiene que ser determinada de forma iterativa en una serie de ciclos de preparación-experimento.
- Incubar las virutas en voladizo en la solución de PEG durante 1 hora en una atmósfera cloroformo saturado para evitar la evaporación del cloroformo.
- Sonda Conjugación molécula(> 1 hora):
NOTA: En el siguiente 3.4.1-3.4.3, se describen tres ejemplos para el acoplamiento covalente de diferentes moléculas de la sonda a la punta del AFM. Para cada molécula el protocolo tiene que ser ajustado. Nota además, que en el ejemplo 1 y 3 NHS-química se utiliza mientras que en el ejemplo 2 el tiol funcionalizado polímero PI- g -PS está acoplado a la PEG-maleimida a través de la química. Para más detalles ver 14.- Para poli (aminoácido) poli-D-tirosina (40-100 kDa)
- Disolver el politirosina conjugado molécula sonda en 1 M NaOH. Ajustar la concentración de 1 mg / ml.
- Cambie el NaOH para tampón de borato de sodio (pH 8,1) utilizando columnas de desalación giro (7 kDa MWCO) inmediatamente antes de la funcionalización
- Enjuagar los voladizos primero con 5 ml de cloroformo, después con 5 ml de etanol y finalmente con 5 ml de tampón de borato.
- Incubar las fichas en voladizo durante 1 hora en la solución tampón de borato politirosina y luego enjuague con tampón de boratoy agua ultrapura. Almacene en agua ultrapura hasta que la medición.
- Para los polímeros con un esqueleto lineal (poliisopreno, 119 kDa) que tienen cadenas laterales injertadas (poliestireno, 88 kDa) 14
- Se disuelve el PI g-PS en cloroformo seco. Ajustar la concentración de la solución de la conjugación a 4 mg / ml.
- Enjuagar los voladizos con 5 ml de cloroformo y se incuba durante al menos 1 hr en la solución de conjugación.
- Enjuague de nuevo en 5 ml de cloroformo y almacenar en cloroformo en un entorno de cloroformo-saturado (para evitar la evaporación de cloroformo) hasta que la medición.
- Para el Papa lípidos
- Disolver PAPA en cloroformo seco. Ajustar la concentración de 20 mM.
- Enjuagar los voladizos con 5 ml de etanol y 5 ml de agua ultrapura antes de la incubación de los voladizos de 1 hr en la solución de lípidos.
- Después de la incubación, enjuague voladizos con 5 ml de cloroformo, 5 ml de etanol y 5 ml de agua tibia y ultrapura (en este orden) para eliminar las moléculas de sonda sin unir y para deshacerse de los residuos de cloroformo. Utilice consejos funcionalizados inmediatamente. Alternativamente, guárdelos en cloroformo hasta que se necesite.
- Para poli (aminoácido) poli-D-tirosina (40-100 kDa)
Figura 1. (A) Esquema que muestra el proceso de funcionalización punta utilizando el ejemplo de la química NHS. De conexión (B) Química empleado para unir una molécula de sonda a la punta a través de un grupo amino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Preparación 4. Superficie
- Autoensamblada monocapa (SAM)
NOTA: Como superficie para el primer ejemplo, se eligió una capa monomolecular auto-ensamblada. Consulte la literatura 15 - Portaobjetos de vidrio limpios con una solución de detergente y luego dos veces en agua ultrapura en un baño ultrasónico durante 30 minutos cada uno. Entonces, como un paso adicional de limpieza, colóquelos en la solución RCA (véase el paso 2.3) a 75 ° C durante 15 minutos.
- Cubra las diapositivas con 10 níquel cromo nm y 100 nm de oro en un dispositivo de recubrimiento de vacío. Entonces almacenar en la nevera y limpio de nuevo en la solución de RCA directamente antes de la siguiente etapa.
- Incubar las diapositivas de la etapa anterior en solución 2 mM 1-dodecanthiol / etanol durante 12 h. Los grupos tiol se unen a la superficie de oro y una auto monocapa hidrófobo ensambla. Enjuagar los portaobjetos con etanol y agua ultrapura y luego seca mediante una corriente de gas nitrógeno. Confirmar la hidrofobicidad de la superficie preparada con las mediciones de ángulo de contacto estático en un goniómetro con una cámara CCD 10.
NOTA: Como una superficie para el segundo ejemplo, se eligió un diamante terminado hidrógeno. La preparación de la superficie se realizó como se ha descrito previamente 16.
NOTA: En el último ejemplo, se usó una superficie soportada bicapa lipídica (SLB) como una superficie. Para obtener una superficie tal, una solución (0,1 mg / ml) de las vesículas unilamelares grandes (LUVs) consistentes en la POPC fosfolípido se formaron por el método de extrusión. A continuación, 50 l de la solución LUV fueron puestos en una hoja de mica recién escindido (A = 1 cm²) y se incubaron durante 30 min. Finalmente la solución se lavó con 20 ml de agua ultrapura. Ver 17,18 para una descripción detallada de la preparación de SLBS.
5. Adquisición de Datos
NOTA: Para los experimentos, utilizar un AFM, que proporciona la capacidad de medir en líquidos. Los procedimientos de adquisición de datos y análisis de datos son aplicables independientemente del modelo utilizado AFM. Además, en algunos experimentos que es ventajoso tener la posibilidad de controlar la temperature dentro de la célula líquida. Deflexión Cantilever se detectó mediante el método de desviación del rayo láser 19. Constantes de resorte se determinaron con el método de ruido térmico 20.
- Introduce el voladizo funcionalizado en un soporte en voladizo AFM que es adecuado para medir en los fluidos.
- Ponga la superficie (preparación véase arriba) para tomar muestras en el AFM y cubrir con líquido. Ambos, de consola y la superficie ahora deben sumergirse en el líquido con la punta en voladizo que apunta hacia la superficie. Tenga en cuenta que en muchos casos una gota de líquido es suficiente. En cualquier caso la evaporación del fluido debe ser evitado, por ejemplo, mediante el uso de una célula de fluido cerrada.
- Si procede, ajustar la temperatura deseada en el controlador.
- Deje que el sistema se equilibre durante al menos media hora.
- Registrar un espectro de ruido térmico del voladizo con el voladizo lejos de la superficie a fin de excluir cualquier superficie efectos de amortiguación. Tenga en cuenta que por lo general 10 o más espectros tienen que ser acumulada para obtener una relación suficiente de señal a ruido.
- Acércate a la superficie. Tenga en cuenta que con el fin de conservar la geometría de la punta y la punta funcionalización el proceso de enfoque tiene que ser llevado a cabo cuidadosamente. Esto se puede lograr mediante, por ejemplo, se aproxima en modo de contacto intermitente.
- Determinar la sensibilidad óptica inversa palanca (InvOLS) medida en nm / voltios. Para ello, empujando la punta en voladizo contra una superficie dura.
- Determinar los InvOLS mediante la medición de la pendiente de la distancia de recorrido piezo vs. el cambio en la tensión de fotodiodo. Se ajusta una línea a la parte de la curva de fuerza-distancia donde la punta en voladizo está en contacto con la superficie. En experimentos con una superficie blanda como bicapas lipídicas, llevar a cabo este paso en las zonas que no están cubiertas con una bicapa lipídica ("puntos de defectos ').
- Determinar la constante de resorte (pN / nm) mediante el ajuste de un oscilador armónico con el espectro de ruido térmico. Usofunción de software automatizado para la determinación de la constante de muelle; o consulte la literatura 20.
- Inicie el experimento.
- Curvas numerosa fuerza Récord de distancia en cada condición experimental. Por lo general, utilice los siguientes valores para los parámetros experimentales: Frecuencia de muestreo de 5 kHz, la velocidad punta de 1 m / seg, retraer distancia de 1 m.
NOTA: A veces, dependiendo de la dinámica del experimento estudiado, podría ser necesario esperar una cierta cantidad de tiempo con la punta en contacto con la superficie ("tiempo de permanencia ').
NOTA: El experimento parámetros específicos puede desviarse sustancialmente de los valores indicados anteriormente. - Durante las mediciones a largo plazo, cero la posición del láser en el fotodiodo de vez en cuando por el reposicionamiento del fotodiodo.
- Opcional: Después de cada curva de la fuerza, la ubicación de la AFM-punta a otra posición xy.
- Al final del experimento, determinar la sensibilidad y el resorte CONSTAnt de nuevo para comprobar la consistencia y la estabilidad del sistema.
NOTA: La comparación de la constante de resorte y la sensibilidad antes y después del experimento es también un medio para asegurar que las propiedades del sistema y de las propiedades de la punta se mantuvo sin cambios en el transcurso del experimento. Si la diferencia de las constantes de resorte no es demasiado grande (<= 15%), que se pueden promediar, ya que la incertidumbre intrínseca de la determinación de la constante de muelle es también alrededor de 15%. Para las diferencias más grandes, es aconsejable encontrar primero y eliminar la causa para el cambio constante aparente de primavera antes de continuar con otros experimentos.
- Curvas numerosa fuerza Récord de distancia en cada condición experimental. Por lo general, utilice los siguientes valores para los parámetros experimentales: Frecuencia de muestreo de 5 kHz, la velocidad punta de 1 m / seg, retraer distancia de 1 m.
6. Preparación de datos
NOTA: En esta sección general de los pasos de preparación de datos que se realizan normalmente independiente del tipo específico de experimento para convertir las unidades de Newton y nanómetro, así como para corregir los datos se describen. Los análisis de datos específicos experimento se briefly describe más adelante en la respectiva sección de ejemplo representativo.
- Típicamente, llevar a cabo toda la preparación y análisis de datos los pasos automáticamente mediante un algoritmo de casa-escrita, por ejemplo, basado en el software IGOR Pro 6.
- Convertir la señal de deflexión prima (DEFL) [V] en vigor multiplicándolo con los InvOLS [nm / V] y la constante elástica [nN / nm].
- Offset la fuerza de tal manera que la fuerza sobre el voladizo en una distancia suficiente desde la superficie (en voladizo sin carga) se convierte en 0 nN.
- Calcular la posición de la punta real (también llamado de separación cuando se mide con relación a la superficie) * z, que toma la flexión del voladizo en cuenta:
- Offset z * de una manera tal que z * = 0 corresponde a la posición z de la superficie.
NOTA: Aquí, F es la fuerza que actúa sobre la punta y por lo tanto dobladaEs el voladizo (determinado en el paso 6.2.), z es la posición z-sensor de medición (directa dada por el instrumento) y k representa la constante del resorte (determinado en el paso 5.8).
Figura 2. Proceso de diagrama de flujo que muestra la preparación de la muestra, la adquisición de datos y el análisis de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
En lo siguiente, los resultados para el ejemplo de arriba describen moléculas, a saber, la politirosina polímeros de poli (aminoácido), polímero de injerto PI- g -PS y el Papa fosfolípido, se presentan. En primer lugar para cada ejemplo, experimentar detalles específicos de adquisición de datos y preparación de datos se proporcionan. A continuación, se muestran los resultados ejemplares para experimentos en los que estas moléculas se desorbe de diferentes superficies (CH 3 -SAMs, hidrógeno terminado de diamante y de lípidos bicapas). Determinación de la fuerza de adherencia, la longitud de la adhesión y la energía libre se introducen.
Ejemplo 1: Desorción de politirosina de capa monomolecular auto-ensamblada
Se midió la desorción de politirosina de un SAM hidrófobo en diferentes soluciones con un contenido variable de etanol. En cada solución de los InvOLS voladizo y constantes de resorte se determinaron como se ha descrito anteriormente y al menos 300 fuerza dtrazas Istance se registraron para cada solución. Todos los experimentos de un conjunto experimental se realizaron con un único voladizo en un solo día para asegurar que uno y el mismo poli sola (aminoácido) se midió. La velocidad de extensión / retracción del voladizo fue de 0,5 m / s, y el tiempo de permanencia en la superficie era de 1 seg. Las huellas fuerza por la distancia mostraron mesetas de fuerza constante. Cada meseta fue equipado con una curva sigmoidal y la fuerza de meseta, así como la longitud de meseta se determinaron y se representaron gráficamente en un histograma. Los histogramas se ajustaron con una gaussiana y el valor de pico, así como la variación estándar (error) se extrajo de la distribución. Hasta el final de la meseta de la fuerza, el sistema está en equilibrio y el área debajo de la meseta, por lo tanto es igual a la energía libre por longitud de polímero. Sólo el propio proceso de desprendimiento al final de la meseta está en no-equilibrio. Debido a esto, para los experimentos típicos de la longitud meseta es más largo que el equilibri um longitud (aproximadamente 30%) y el área debajo de la sigmoidal encaja una estimación superior para la energía libre de adherencia 21.
Figura 3. (A) Fuerza rastro distancia (retracción) de politirosina en un metil-SAM en agua pura (en rojo). Sólo una sola molécula desorbe como puede verse en el paso sola gota de la fuerza a la línea de base (fuerza cero). El ajuste sigmoidal se muestra en negro y la longitud de meseta extraída y la fuerza meseta se indican mediante flechas. (B) Histogramas de la fuerza de meseta extraída para mediciones en agua pura y en mezclas de agua / etanol con diferente contenido molar de etanol. (C) Plateau histogramas longitud del mismo conjunto experimental. (D) Longitud meseta Pico vs. fuerza meseta pico ".456 / 52456fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3A muestra un solo rastro de fuerza-distancia de politirosina medido en el agua pura. Meseta de la fuerza y duración de la meseta se extraen. Si sólo hay una molécula en la punta que se desorbe de la SAM, el histograma longitud meseta muestra una distribución estrecha y monomodal (típicamente en los experimentos de la desviación estándar en un ajuste gauss del histograma longitud es de alrededor de 5-20 nm). Viceversa, si sólo hay un pico estrecho en el histograma longitud meseta, uno puede ser relativamente seguro de que todo el conjunto experimental se hizo con uno y el mismo polímero. La razón de esto es que los polytyrosines son altamente polydispersive en tamaño (50 a 100 kDa). Por lo tanto, dos polímeros de exactamente la misma longitud son altamente improbable. Adición de etanol debilita la interacción hidrófoba entre politirosina y la superficie de 10,22 yconduce a una energía libre de adsorción más baja y por lo tanto a una fuerza de meseta inferior como puede verse en los histogramas de fuerza meseta para las diferentes condiciones de disolvente que se muestran en la Figura 3B. Ahora se puede investigar cómo la longitud de meseta de una sola politirosina cambia para diferentes adsorción energías libres. Como puede verse en la Figura 3C la longitud de meseta disminuye con la adición de etanol. Al mismo tiempo, la fuerza disminuye meseta (Figura 3D).
A fin de obtener todos los parámetros relevantes del proceso de desorción es decir, la longitud de contorno, la longitud Kuhn, la energía libre de adsorción y la tasa de desorción monomérica intrínseca, uno tiene que combinar las mediciones descritas anteriormente con los experimentos distancia constante. Para más detalles ver 21.
Ejemplo 2: La desorción del polímero de injerto PI- g-PS de un diamante hidrofóbica
En la Figura 4A 4B curvas típicas vigor distancia obtenidos con PI- g-PS en diamante hidrogenado en agua a temperatura ambiente se muestran. El tiempo de permanencia en la superficie era de 1 seg y la velocidad del voladizo era 1 m / seg. Se observaron Cualquiera de mesetas de fuerza constante (Figura 4A) o eventos de ruptura (Figura 4B). Para las mesetas de fuerza constante, la altura de las mesetas se determinó con un ajuste sigmoidal y los valores se representaron en un histograma (Figura 4C). Para excluir el pico adherencia inespecífica causada por la interacción directa de la punta con la superficie (primer pico en la curva de fuerza-distancia en la Figura 4B), se determinó la fuerza máxima en cierta distancia de la superficie. Los valores obtenidos para estos eventos de ruptura A continuación, se representan gráficamente en un histograma (Figura 4D). Para más análisis de los histogramas se ajustaron con una gaussiana y la altura máxima fue elegido como un valor medio para lapunto de datos. Con este tipo de experimento de la influencia de la presencia de cadenas laterales y su arquitectura se investigó 14.
Se observan Figura 4. Curvas de retracción Fuerza distancia realizadas con una cadena principal lineal poliisopreno injertado con cadenas laterales de poliestireno (PI- g -PS). Cualquiera de mesetas de fuerza constante (A) o eventos de ruptura (B). Para mesetas de fuerza constante, la altura de las mesetas se determina con un ajuste sigmoidal y se representó en un histograma (C), mientras que para los eventos de ruptura, la fuerza de ruptura máxima se determina (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ejemplo 3: Extracción de un solo phospholipid (PAPA) de una bicapa lipídica
La Figura 5A muestra una representación esquemática del proceso de extracción de una sola molécula. Mediciones de extracción se realizaron por acercarse verticalmente la punta del AFM funcionalizado-PAPA hacia la bicapa lipídica compatible (no mostrados). Tras el contacto de la punta con la bicapa POPC, una pequeña fuerza (~ 100 pN) se mantiene constante por un bucle de retroalimentación durante unos 4 segundos. Si la molécula PAPA inserta en la bicapa durante este tiempo de permanencia, se sacó o "extrae" de la bicapa al retraer la punta del AFM de la bicapa. Esto da lugar a curvas de fuerza-distancia característica. Su forma está determinada básicamente por la elasticidad estiramiento del enlazador PEG y se puede montar en un modelo de 23 cadenas de gusano (WLC). Una superposición de más de 50 curvas se muestra en la Figura 5B. Los verdaderos eventos de una sola molécula pueden ser reconocidos por histogramas fuerza puntiagudos individuales (Figura 5C ong>). Tenga en cuenta que con el fin de obtener una mayor comprensión del tamaño de cierto parámetro molecular (por ejemplo, el tiempo de vida media de lípidos en bicapas), es necesario para llevar a cabo mediciones con diferentes tasas de fuerza de carga. Para un análisis más detallado de solo lípidos experimentos de extracción ver 24.
Figura 5. (A) Esquema para la extracción de una sola molécula de una bicapa lipídica. Tenga en cuenta que la molécula de lípido se acopla covalentemente a la punta. Por lo tanto, muchos cientos o incluso miles de ciclos de la fuerza de extracción pueden llevarse a cabo con una y la misma molécula. (B) Superposición de más de 50 curvas de extracción 9. (C) Histograma de la distribución de la fuerza de extracción del ejemplo mostrado en (B)..jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Paso | Propósito | Soluto | Solvente | Proporción típica o concentración |
| Silanización | Crear grupos amino en la superficie en voladizo | APTES (3-aminopropil) tri-etoxisilano (por ejemplo, Vectabond ™) | acetona seca | 1:50 (v / v) - 1: 100 (v / v) |
| PEGilación | Proporcionar superficie en voladizo con amino o grupos reactivos tiol | NHS-PEG-NHS o Mal-PEG-NHS | cloroformo seco | 0,25-25 mM |
| PEGilación | Superficie del cantilever passivate | metil-PEG-NHS | cloroformo seco | 25 mM |
| Conjugación de la molécula de sonda | Pareja molécula de sonda a través de un grupo amino o tiol para PEG bi-funcional | molécula de sonda (polímero, lípido, etc.) | cloroformo seco o tampón de borato | 0,1 a 10 mM |
Tabla 1. Soluciones necesarias para la funcionalización punta.
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Discussion
Durante las últimas décadas, los experimentos de una sola molécula han proporcionado información sin precedentes sobre los mecanismos moleculares y que resultó ser un enfoque muy valiosa en ciencias de la vida y más allá. Para lograr buenas estadísticas y significativas de los experimentos SMFS, idealmente una y la misma molécula se utiliza en todo el curso del experimento. En contraste con los experimentos con conjuntos de moléculas, los experimentos SMFS son capaces de detectar eventos raros y estados moleculares ocultos. Otra ventaja de la única molécula de experimentos es que pueden ser modeladas por medio de simulaciones de dinámica molecular 24,25.
El protocolo de funcionalización en voladizo se ha descrito anteriormente es una versión modificada de los procedimientos publicados anteriormente 26-28. Después de la activación y la silanización, el voladizo AFM está funcionalizado con una mezcla de dos tipos diferentes de polietileno glicol (PEG) moléculas (moléculas de engarce).
N--amino grupo reactivo (NHS) (o un grupo maleimida reactivo con tiol), donde más tarde en la molécula sonda se conjuga ("NHS-PEG", "Mal-PEG"). Véase la Figura 1 para un esquema de la funcionalización punta. El propósito de la PEG es triple: En primer lugar, apacigua la superficie de la punta y por lo tanto evita la adsorción inespecífica. En segundo lugar, el uso de una cierta proporción metil-PEG / NHS-PEG permite el ajuste de la concentración de NHS-PEG en la superficie de la punta. Y tercero, se separa la punta de la molécula de sonda y por lo tanto permite la cuantificación de la interacción molécula de superficie sin interferencia de la interacción directa punta de la superficie. A continuación, la molécula de sonda se acopla covalentemente a la punta a través de la NHS-PEG (o Mal-PEG).
Este protocolo se asegura de que todos los bonos (*) en el & #8220; la cadena de acoplamiento de punta "* OH * silano * PEG * molécula sonda son enlaces covalentes y, por tanto, muy fuerte. Esto a su vez, permite que una y la misma molécula de sonda se mide en toda la duración del experimento. Esto se ha ejemplificado anteriormente en la sección de resultados representativo que muestra cierto espectroscopia de fuerza sola molécula.
¿Cómo se puede verificar que se mide realmente una sola molécula? Por las huellas individuales con mesetas de fuerza constante, una sola gota de la línea de base es suficiente. Si más de un polímero se desorbe al mismo tiempo, la fuerza cae a cero en varios pasos discretos, ya que cada polímero se separa en un punto diferente. Más difícil es decidir si es cada vez la misma molécula individual. Por lo tanto la distribución de longitudes de desprendimiento tiene que ser evaluado. Una distribución estrecha con un solo pico es una buena indicación de que una y la misma molécula sola se sondeó en todo rastro de fuerza de extensión. Por las huellas individuales con rupteventos ure, la superposición de todas las trazas es el mejor método para decidir si se midió (uno y el mismo) de una sola molécula. Alternativamente, cada traza puede estar equipado con un modelo (WLC) y después tanto la longitud de persistencia y las longitudes de ruptura en una fuerza definida se puede trazar. La distribución de estos dos parámetros tiene que ser estrecha y solo dos aguas.
En conclusión, se ha presentado un procedimiento de preparación para la fijación de una gran variedad de moléculas individuales a puntas de AFM. Pequeña punta del AFM (radio ~ 10 nm), sus capacidades de posicionamiento lateral y su sensibilidad vigor convierten en la herramienta ideal para estudiar las propiedades de adhesión de las moléculas individuales en superficies biológicas y no biológicas en casi cualquier líquido.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
