Abstract
Espectroscopia de força atômica é uma ferramenta ideal para estudar moléculas em superfícies e interfaces. Um protocolo experimental para acoplar uma grande variedade de moléculas individuais de forma covalente para uma ponta de AFM é apresentado. Ao mesmo tempo, a ponta de AFM é passivado para evitar interacções não específicas entre a ponta e o substrato, o que é um pré-requisito para estudar moléculas individuais ligados à ponta de AFM. As análises para determinar a força de adesão, o comprimento de aderência, e a energia livre destas moléculas em superfícies sólidas e bio-interfaces são pouco apresentados e referências externas para leitura são fornecidos. Exemplos são as moléculas a polytyrosine poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas são dessorvida a partir de diferentes superfícies como CH 3 -SAMs, hidrogénio terminada diamante e suportado bicamadas lipídicas sob várias condições do solvente. Finalmente, ovantagens da força espectroscópicas experiências de moléculas individuais são discutidas, incluindo meios para decidir se verdadeiramente uma única molécula tem sido estudada no experimento.
Introduction
Ao longo dos últimos 30 anos, microscopia de força atômica (AFM) acabou por ser uma técnica valiosa imagem para estudar biológicos 1,2 e sintéticas 3 materiais e superfícies, uma vez que fornece resolução espacial molecular em todas as três dimensões e pode ser operado em vários solvente ambientes. Além disso, a força molécula espectroscopia AFM-single (SMFS) permite medir forças que vão desde o PN a μN regime e deu uma visão sem precedentes por exemplo em proteína dobrar 4,5, física polímero 6-8, e interação molécula de superfície única 9 - 12 .A lógica por trás estudar moléculas individuais, em vez de um conjunto de moléculas é para evitar efeitos que muitas vezes mascaram eventos raros ou estados moleculares escondidos em média. Além disso, um grande número de parâmetros moleculares, tais como o comprimento do contorno, o comprimento Kuhn, a energia livre de adesão, etc., podem serobtida. Este é detalhado nos exemplos abaixo. Numa experiência típica AFM-SMFS, a molécula de sonda é acoplada a uma ponta muito afiada através de uma molécula ligante. A ponta em si está localizado na extremidade de um braço de suporte flexível. Se a ponta é colocada em contacto com a superfície da molécula de sonda irá interagir com esta superfície. Observando-se a deflexão do braço de suporte à retracção da ponta, a força, e, por conseguinte, a energia livre, para separar a molécula de superfície pode ser determinada. Para obter estatísticas significativas, um grande número de chamadas curvas força-distância tem que ser adquirido. Além disso, para ter verdadeiros experimentos única molécula (isto é, utilizando uma e a mesma molécula sonda ao longo da duração de todo o experimento) a molécula sonda deve ser acoplado de forma covalente à ponta de AFM. Aqui, um protocolo experimental para a funcionalização cantilever com uma única molécula através de uma ligação covalente é apresentado. A única molécula ou pode ser acoplada por via de um grupo amino ou um tiol grupo para a ponta do AFM. O processo de conjugação pode ser realizada numa ampla variedade de solventes orgânicos e aquosos () para ter em conta as propriedades de solvatação dos polímeros usados.
Na primeira parte, um protocolo geral para ligar covalentemente uma molécula única ("molécula sonda") através de uma molécula ligante de uma ponta de AFM é descrito. Para este fim, NHS- orgânico ou maleimida-química é utilizado 13. Junto com o protocolo por três moléculas de exemplo, os processos de aquisição de dados e análise de dados são descritos e referências para leitura são fornecidos. Os exemplos de moléculas são: o (linear) tirosina polímero, o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA lipídica. Isto inclui ligeiras variações do protocolo, por exemplo, para ligar covalentemente cisteínas. Além disso, uma secção dedicada à preparação de superfícies diferentes, tais como uma superfície de diamante, um CH3 montado -auto-monocamada e bicamadas lipídicas. Essas interfaces tem proven ser boas referências e exemplos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Consulte a Figura 2 para uma visão geral do fluxo do processo que compreende a preparação, as etapas de aquisição de dados e análise de dados.
1. Instalação do Reagente
NOTA: Todos os produtos químicos devem ser manuseados com cuidado, e, portanto, um jaleco, luvas e proteção para os olhos devem ser usados. Todas as operações devem ser realizadas numa hote de laboratório. Em particular, as luvas especiais devem ser usados em caso de utilização de clorofórmio.
- Use produtos químicos com baixo teor de água, tais como clorofórmio seca rapidamente e armazenar seco, mas não mais de uma semana. Armazenar os produtos químicos a -20 ° C e sob atmosfera de azoto ou árgon no estado gasoso, porque APTES ((3-aminopropil) triethoxysilan) (ver Tabela 1) e PEG (polietilenoglicol) são higroscópicos e PEG é sujeito a oxidação no ar.
- Para evitar a exposição freqüente do estoque de oxigênio atmosférico e umidade, preparar alíquotas menores, de preferência dentro de um sistema de porta-luvas com uma atmosphe nitrogêniore.
2. Preparação do Equipamento
NOTA: Para evitar uma possível contaminação cruzada, use vasos frescas e limpas para cada etapa.
- Limpa vidros e uma pinça em solução detergente durante 30 minutos num banho de ultra-sons a 60 ° C.
- Enxágüe e equipamentos sonicate do passo 2.1 duas vezes com água ultrapura.
- Equipamento de calor a partir do passo 2.1 em solução RCA (água ultrapura, peróxido de hidrogénio e amoníaco (5: 1: 1)) a 75 ° C num forno durante 45 minutos e, subsequentemente, lavar com água ultrapura.
- Finalmente, secar os utensílios de vidro e pinças sob uma corrente de azoto seco ou num forno (100 ° C, 3 h).
3. Dica funcionalização
NOTA: Use uma pinça, navios, etc. feita a partir de aço inoxidável, PTFE, vidro ou qualquer outro material que seja quimicamente estável em soluções orgânicas, se aplicável. Salvo disposição em contrário, realizar todas as etapas em RT. A quantidade de solução de incubação necessário depende do número de fichas de cantilever. Certifique-se de que as consolas estão imersos nas respectivas soluções em todos os tempos.
NOTA: Use um capuz para evitar a inalação de vapores orgânicos.
- A formação de grupos OH na superfície do cantilever ("activação") (aproximadamente 0,5 horas):
- Use uma pinça para colocar fichas frescos cantilever (materiais: o pecado, constante da mola: 10-100 PN / nm) sobre uma lâmina de vidro limpa e colocá-los em uma câmara de plasma (100 W).
- Evacuar câmara (~ 0,1 mbar).
- Flood câmara com gás oxigênio e evacuar novamente.
- Ative o processo de plasma (poder: 20%, duração: 15 min, a pressão do processo: 0,25 mbar).
- Amino-silanização de consolas (aproximadamente 1 hr):
- Prepare os 2,5 ml de solução de APTES (ver Tabela 1) numa placa de Petri de vidro - fazer isso idealmente durante o processo de plasma.
- Immediately após o processo de plasma, mergulhe cada cantilever por 1 segundo em acetona e colocá-los logo em seguida na solução APTES.
- Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente.
- Cuidadosamente lavar os chips cantilever duas vezes em 10 ml de acetona e uma vez com 10 ml de clorofórmio.
- Opcionais etapa final: fichas Lugar cantilever a partir da etapa anterior em uma lâmina de vidro limpa e asse por 30 minutos a 70 ° C. Note-se que também existem estratégias alternativas para a ativação de superfície, por exemplo, o tratamento UV 12.
- PEGuilação (aproximadamente 2 horas):
NOTA: Execute as operações de 3.3.1-3.3.4 durante amino-silanização. NHS e grupos maleimida estão sujeitas a hidrólise em ambientes aquosos e PEG em si é sujeito a oxidação no ar. Portanto, o tempo (em especial entre as etapas) é um parâmetro crítico. Consulte a 13 para obter mais informações.- Preparar a solução de clorofórmio (ver Tabela 1).
- Para evitar a condensação, Quente PEG pulveriza até RT antes de abrir a alíquota e pesando a quantidade apropriada.
- Para o acoplamento de polímeros ou de lípidos com grupos amino, resolver separadamente NHS-PEG-NHS (6 kDa) e metil-PEG-NHS (5 kDa) em solução de clorofórmio com vortex até que eles estão completamente resolvido. Consulte a Tabela 1 para concentrações.
- Alternativamente. para o acoplamento de polímeros com grupos tiol resolver separadamente NHS- PEG-Mal e metil-PEG-NHS em solução de clorofórmio.
- Misturar as soluções como necessária para ajustar uma determinada relação entre o número ou o NHS- maleimide- e as moléculas de PEG terminado em metilo (tipicamente 1: 500). Note-se que a proporção ideal tem de ser determinada de forma iterativa em uma série de ciclos de preparação-experimentais.
- Incubar fichas cantilever na solução de PEG durante 1 hora num ambiente saturado de clorofórmio para evitar a evaporação do clorofórmio.
- Sonda conjugação molécula(> 1 hora):
NOTA: No seguinte 3.4.1-3.4.3, três exemplos para o acoplamento covalente de diferentes moléculas sonda para a ponta do AFM são descritos. Para cada molécula do protocolo tem de ser ajustada. Além disso, note, que no exemplo 1 e 3 do SNS-química é utilizada ao passo que no exemplo 2, o polímero funcionalizado tiol PI-g-PS é acoplado ao PEG por meio de maleimida-química. Para mais detalhes ver 14.- Para poli (aminoácido) poli-D-tirosina (40-100 kDa)
- Dissolver o polytyrosine conjugado molécula sonda em NaOH 1 M. Ajustar a concentração de 1 mg / ml.
- Troque o NaOH para tampão de borato de sódio (pH 8,1), utilizando colunas de spin dessalinização (7 kDa MWCO) imediatamente antes da funcionalização
- Lavar as consolas primeiro com 5 ml de clorofórmio, em seguida, com 5 ml de etanol e finalmente com 5 ml de tampão de borato.
- Incubar os chips cantilever durante 1 hora na solução tampão polytyrosine borato e depois enxaguar com tampão boratoe água ultrapura. Guarde em água ultrapura até que a medição.
- Para polímeros com uma espinha dorsal linear (poli-isopreno, 119 kDa), que tem cadeias laterais enxertadas (poliestireno, 88 kDa) 14
- Dissolve-se o PI- g -PS em clorofórmio seco. Ajustar a concentração da solução de conjugação a 4 mg / ml.
- Lavar as consolas com 5 ml de clorofórmio e incubar durante pelo menos 1 h na solução de conjugação.
- Lavar novamente em 5 ml de clorofórmio e armazenar em clorofórmio num ambiente saturado-clorofórmio (para evitar a evaporação clorofórmio) até que a medição.
- Para o Papa lipídico
- Dissolver PAPA em clorofórmio seco. Ajustar a concentração para 20 mM.
- Lavar as consolas com 5 ml de etanol e 5 ml de água ultrapura antes da incubação das consolas de 1 h na solução de lípidos.
- Após a incubação, lavar consolas com 5 ml de clorofórmio, 5 ml de etanol e 5 ml de, água ultrapura quente (por esta ordem) para remover moléculas de sonda não ligados e se livrar de resíduos de clorofórmio. Use dicas funcionalizados imediatamente. Alternativamente, armazená-los em clorofórmio até ser necessário.
- Para poli (aminoácido) poli-D-tirosina (40-100 kDa)
Figura 1. (A) esquemático, mostrando o processo de funcionalização ponta usando o exemplo de NHS química. Ligação (B) Chemical empregada para anexar uma molécula sonda para a ponta através de um grupo amino. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Preparação 4. Superfície
- Auto-montado monocamada (SAM)
NOTA: Como a superfície para o primeiro exemplo, uma monocamada auto-montada foi escolhido. Consulte a literatura 15 - Lâminas de vidro limpas com uma solução de detergente e em seguida, duas vezes em água ultrapura num banho de ultra-sons durante 30 min cada. Em seguida, como um passo adicional de limpeza, colocá-los na solução de RCA (ver passo 2.3) a 75 ° C durante 15 min.
- Brasão as lâminas com 10 níquel cromo nm e 100 nm de ouro em um coater vácuo. Então guarde na geladeira e limpo novamente na solução RCA diretamente antes da próxima etapa.
- Incubar as lâminas do passo anterior em 2 mM de solução de 1-dodecanthiol / etanol durante 12 horas. Os grupos tiol que se ligam a superfície de ouro e uma monocamada auto hidrofóbico monta. Lavar as lâminas com etanol e água ultrapura e depois seco por uma corrente de azoto gasoso. Confirme a hidrofobicidade da superfície preparada com medidas de ângulo de contato estáticos em um goniômetro com uma câmera CCD de 10.
NOTA: Como uma superfície para o segundo exemplo, um diamante terminada hidrogénio foi escolhido. A preparação da superfície foi realizada como descrito anteriormente 16.
NOTA: No último exemplo, uma superfície apoiada bicamada lipídica (SLB), foi utilizado como uma superfície. Para obter uma tal superfície, uma solução (0,1 mg / ml) de vesículas unilamelares grandes (LUV), contendo o fosfolipido POPC foram formados pelo método de extrusão. Em seguida, 50 ul da solução LUV foram colocadas sobre uma folha de mica clivada de fresco (A = 1 cm) e incubadas durante 30 min. Finalmente a solução foi lavada com 20 ml de água ultrapura. Veja 17,18 para uma descrição detalhada da preparação do SLBS.
5. Aquisição de Dados
NOTA: Para os experimentos, use um AFM, que oferece a capacidade de medir em líquidos. Os procedimentos de aquisição de dados e análise de dados são aplicáveis independentemente do modelo de AFM usado. Além disso, em algumas experiências, é vantajoso ter a possibilidade de controlar a temperature líquido no interior da célula. Cantilever deflexão foi detectado através do método de deflexão do feixe de laser 19. Constantes de flexão foram determinados com o método térmico ruído 20.
- Inserir o braço de suporte funcionalizado em um suporte de AFM cantilever que é adequado para a medição de fluidos.
- Colocar a superfície (preparação ver acima) para ser amostrada na AFM e cobri-lo com o líquido. Ambos, o braço de suporte e a superfície deve agora ser imerso no líquido com a ponta cantilever que aponta na direcção da superfície. Note-se que, em muitos casos, uma gota de líquido é suficiente. Em qualquer caso, a evaporação do fluido deve ser evitado, por exemplo, usando uma célula de fluido em circuito fechado.
- Se for o caso, ajustar a temperatura desejada no controlador.
- Deixar o sistema equilibrar durante pelo menos meia hora.
- Gravar um espectro de ruído térmico do cantilever com o cantilever longe a partir da superfície, a fim de excluir quaisquer efeitos de amortecimento superfície. Note-se que geralmente 10 ou mais espectros têm de ser acumulados para obter uma razão sinal-para-ruído suficiente.
- Aproxime-se da superfície. Note-se que, a fim de conservar a geometria da ponta e ponta funcionalização o processo de abordagem tem de ser realizada com cuidado. Isto pode ser conseguido através de, por exemplo, aproximando-se em modo de contacto intermitente.
- Determinar a sensibilidade inversa óptica alavanca (InvOLS) medido em nm / volt. Para fazer isso, empurrando a ponta cantilever contra uma superfície dura.
- Determinar os InvOLS medindo a inclinação da distância do curso de piezo versus a mudança na tensão fotodiodo. Unir a parte da curva de força-distância, em que a ponta do braço de suporte se encontra em contacto com a superfície. Em experimentos envolvendo uma superfície macia como bicamadas lipídicas, realizar esta etapa em áreas que não são cobertas com uma bicamada lipídica ("pontos de defeitos").
- Determinar a constante da mola (pN / nm) por montagem de um oscilador de harmónica do espectro de ruído térmico. Usofunção de software automatizado para a primavera determinação constante; caso contrário, consultar a literatura 20.
- Iniciar a experiência.
- Curvas numerosos força-recorde distância em cada condição experimental. Normalmente, usar os seguintes valores para os parâmetros experimentais: Taxa de amostragem de 5 kHz, velocidade de ponta de 1 mm / s, retrair distância de 1 m.
NOTA: Por vezes, dependendo da dinâmica do experimento estudado, pode ser necessário esperar uma certa quantidade de tempo com a sua extremidade em contacto com a superfície ("Tempo paragem").
NOTA: O experimento parâmetros específicos pode desviar-se substancialmente dos valores indicados acima. - Durante a medição a longo prazo, de zero a posição do laser sobre o fotodíodo de tempos a tempos, reposicionando o fotodiodo.
- Opcional: Depois de cada curva de força, mudar o local da AFM-ponta para outra posição xy.
- No final da experiência, determinam a sensibilidade e a mola CONSTAnt novamente para verificar a consistência e estabilidade do sistema.
NOTA: Comparando a constante da mola e sensibilidade antes e depois da experiência é também um meio para assegurar que as propriedades do sistema e as propriedades da ponta permaneceu inalterada ao longo do curso do experimento. Se a diferença das constantes de mola não é demasiado grande (<= 15%), que pode ser calculada a média, uma vez que a incerteza intrínseca da mola determinação constante é também cerca de 15%. Para diferenças maiores, é aconselhável primeiro encontrar e eliminar a causa para a constante de mola aparente mudança antes de prosseguir com mais experiências.
- Curvas numerosos força-recorde distância em cada condição experimental. Normalmente, usar os seguintes valores para os parâmetros experimentais: Taxa de amostragem de 5 kHz, velocidade de ponta de 1 mm / s, retrair distância de 1 m.
6. Data Preparation
NOTA: Nesta seção geral etapas de preparação de dados que são tipicamente realizadas independente do tipo específico de experiência para converter unidades de Newton e nanométrica, bem como para corrigir os dados são descritos. As análises de dados específicos da experiência estão briefly descrito mais abaixo na respectiva seção exemplo representativo.
- Normalmente, realizar toda a preparação e análise de dados passos automaticamente por um algoritmo de home-escrita, por exemplo, com base no software IGOR Pro 6.
- Converter o sinal de deflexão raw (Defl) [V] em vigor, multiplicando-o com os InvOLS [nm / V] e primavera constante [nN / nm].
- Compensar a força de tal forma que a força sobre o braço de suporte de uma distância suficiente da superfície (cantilever descarregada) torna-se 0 nN.
- Calcula-se a posição real da ponta (também chamado de separação, quando medido em relação à superfície) z *, o que leva a flexão do braço de suporte em conta:
- Deslocamento z *, de tal maneira que z * = 0 corresponde à posição z da superfície.
NOTA: Aqui, F é a força que actua sobre a ponta e, por conseguinte, curvaé o braço de suporte (determinado no passo 6.2.), z é a posição medida do sensor z (determinado directamente pelo instrumento) e o símbolo k representa a constante da mola (determinado no passo 5.8).
Figura 2. Processo de diagrama de fluxo mostrando a preparação da amostra, a aquisição de dados e análise dos dados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
No que se segue, os resultados para o exemplo acima descrito, ou seja, a moléculas polytyrosine polímeros de poli (aminoácidos), o polímero de enxerto PI- g -PS e o PAPA fosfolípido, são apresentados. Primeiro para cada exemplo, experimentar detalhes específicos para a aquisição de dados e preparação de dados são fornecidos. Em seguida, os resultados exemplares para experimentos onde essas moléculas foram dessorvidas de superfícies diferentes (CH3 -SAMs, hidrogênio encerrado diamante e lipídios bicamadas) são mostrados. Determinação da força de adesão, o comprimento de aderência e a energia livre são introduzidos.
Exemplo 1: A dessorção dos polytyrosine de monocamada auto-montada
A dessorção de polytyrosine de um SAM hidrofóbico em soluções diferentes, com um teor variável de etanol foi medido. Em cada solução InvOLS as constantes de mola cantilever e foram determinados tal como descrito acima e, pelo menos, 300 d forçavestígios istance foram registrados para cada solução. Todas as experiências de um conjunto experimental foi feito com um único braço de suporte num único dia, para garantir que uma e a mesma único poli (aminoácido) foi medido. A velocidade de extensão / retração do cantilever foi de 0,5 mm / segundo e o tempo de permanência na superfície foi de 1 seg. Os traços vigor distância mostrou planaltos de força constante. Cada patamar foi equipado com uma curva sigmoidal e a força de planalto, bem como o comprimento do planalto foram determinados e representados num histograma. Os histogramas foram equipadas com uma gaussiana e o valor de pico, bem como a variação do padrão (erro) de distribuição foi extraída. Até ao final do patamar de força, o sistema está em equilíbrio e a área por baixo do planalto, portanto, igual à energia livre por comprimento de polímero. Apenas o próprio processo de desprendimento na extremidade do planalto está em não-equilíbrio. Devido a isso, para experiências típicas do comprimento patamar é mais longo do que o equilibri hum comprimento (cerca de 30%) e a área sob o sigmoidal adapta uma estimativa superior para a energia livre de aderência 21.
Figura 3. (A) Força trace distância (retração) do polytyrosine em um metil-SAM em água pura (mostrado em vermelho). Apenas uma única molécula é dessorvido como pode ser visto na etapa única gota de força para a linha de base (força zero). O ajuste sigmoidal é mostrado em preto e o comprimento do planalto e extraída força planalto são indicados por setas. (B) Os histogramas da força de planalto extraído para medições em água pura e em misturas de água / etanol com diferente teor de etanol molar. histogramas de comprimento (C) Plateau do mesmo conjunto experimental. (D) comprimento Peak planalto vs. pico de força plateau ".456 / "target =" _ 52456fig3large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3A mostra um único vestígio de força-distância de polytyrosine medido em água pura. Força Plateau e comprimento planalto são extraídos. Se houver apenas uma molécula na ponta que é dessorvido da SAM, o histograma comprimento planalto mostra uma distribuição estreita e monomodal (tipicamente em experiências o desvio padrão em um ajuste gauss do histograma comprimento é de cerca de 5-20 nm). Vice-versa, se há apenas um pico estreito no histograma comprimento planalto, pode ser relativamente certeza de que todo o conjunto experimental foi feito com um único e mesmo polímero. A razão para isto é que os polytyrosines são altamente polydispersive em tamanho (de 50 a 100 kDa). Portanto, dois polímeros de exactamente o mesmo comprimento são altamente improvável. A adição de etanol enfraquece a interacção hidrofóbica entre polytyrosine e a superfície e 10,22conduz a uma menor energia livre de adsorção e, portanto, a uma força de patamar mais baixo, como pode ser visto nos histogramas de força patamar para as diferentes condições do solvente mostrado na Figura 3B. Agora ele pode ser investigado como o comprimento planalto de um único polytyrosine muda para energias livres de adsorção diferentes. Como pode ser visto na Figura 3C o comprimento planalto diminui com a adição de etanol. Ao mesmo tempo, as diminuições da força planalto (Figura 3D).
A fim de obter todos os parâmetros relevantes do processo de dessorção a saber, o comprimento do contorno, o comprimento Kuhn, a energia livre de adsorção e de dessorção, a taxa intrínseca monomérica, tem de se combinar as medições acima descritas com experiências à distância constante. Para mais detalhes ver 21.
Exemplo 2: A dessorção do polímero de enxerto PI- -PS g de um diamante hidrofóbico
Na Figura 4A 4B curvas típicas força-distância obtida com PI- g -PS no diamante hidrogenada em água à temperatura ambiente são mostrados. O tempo de permanência na superfície foi de 1 segundo e a velocidade do cantilever era de 1 mm / seg. Ou os planaltos de força constante (Figura 4A) ou eventos de ruptura foram observadas (Figura 4B). Para os planaltos de força constante, a altura dos planaltos foi determinada com um ajuste sigmoidal e os resultados foram representados num histograma (Figura 4C). Para excluir o pico de adesão inespecífica causada por interacção directa da ponta com a superfície (primeiro pico na curva de força-distância na Figura 4B), a força máxima em alguma distância a partir da superfície foi determinada. Os valores obtidos para esses eventos de ruptura foram então representados num histograma (Figura 4D). Para posterior análise dos histogramas foram equipadas com uma gaussiana e a altura máxima foi escolhido como um valor médio para oponto de dados. Com este tipo de experiência, a influência da presença de cadeias laterais e a sua arquitectura foi investigada 14.
Figura 4. Curvas de retração Force-distância percorrida com um backbone polisopreno linear enxertado com cadeias laterais de poliestireno (PI- g -PS). Ou os planaltos de força constante (A) ou eventos de ruptura (B) são observados. Para planaltos de força constante, a altura dos platôs é determinada com um ajuste sigmoidal e plotados em um histograma (C), enquanto que para os eventos de ruptura, a força de ruptura máxima é determinada (D). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Exemplo 3: Extracção de uma única phospholipid (POPE) a partir de uma bicamada lipídica
A Figura 5A mostra uma representação esquemática do processo de extracção de molécula única. Extracção medições foram realizadas por verticalmente aproximando-se da ponta de AFM POPE-funcionalizado para a bicamada lipídica suportado (não mostrado). Após o contacto da ponta com a bicamada POPC, uma pequena força (~ 100 pN) é mantido constante por um circuito de retroalimentação durante cerca de 4 seg. Se a molécula PAPA insere na bicamada durante este tempo de permanência, que é puxado para fora ou "extraído 'a partir da bicamada ao retrair a ponta do AFM a partir da bicamada. Isso resulta em curvas características vigor distância. Sua forma é basicamente determinada pela elasticidade estiramento do vinculador PEG e pode ser equipado por um modelo de 23 cadeia wormlike (WLC). A sobreposição de mais de 50 curvas é mostrado na Figura 5B. Eventos única molécula verdadeiros podem ser reconhecidos por histogramas individuais força pontiagudos (Figura 5C ong>). Note-se que, a fim de obter mais conhecimentos sobre o tamanho de certo parâmetro molecular (por exemplo, o tempo de vida médio de lípidos em bicamada), é necessário efectuar medições com diferentes taxas de força de carga. Para uma análise mais aprofundada da única lipídico experimentos de extração ver 24.
Figura 5. (A) Diagrama esquemático para a extracção de uma molécula única a partir de uma bicamada lipídica. Note-se que a molécula de lípido está ligada covalentemente à ponta. Portanto, muitas centenas ou mesmo milhares de ciclos de força de extracção pode ser realizada com uma única e mesma molécula. (B) A sobreposição de mais de 50 curvas de extracção 9. (C) Histograma da distribuição da força de extracção do exemplo mostrado em (B)."target =" _ blank .jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo | Propósito | Soluto | Solvente | Proporção ou concentração típica |
| Silanização | Criar grupos amino na superfície cantilever | APTES (3-aminopropil) tri-ethoxysilane (por exemplo, Vectabond ™) | acetona seca | 01:50 (v / v) - 1: 100 (v / v) |
| PEGylation | Fornecer superfície cantilever com amino ou grupos tiol reactivos | NHS-PEG-Mal ou NHS-PEG-NHS | clorofórmio seco | 0,25-25 mM |
| PEGylation | Superfície cantilever passivate | metil-PEG-NHS | clorofórmio seco | 25 mM |
| Conjugação de molécula sonda | Pares molécula sonda através de um grupo amino ou tiol para PEG bi-funcional | molécula de sonda (polímero, de lípidos, etc.) | clorofórmio seco ou tampão borato | 0,1-10 mM |
Tabela 1. soluções necessárias para a funcionalização ponta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Durante as últimas décadas, os experimentos única molécula ter fornecido informações sem precedentes sobre mecanismos moleculares e acabou por ser uma abordagem de valor inestimável em ciências da vida e além. Para alcançar bons e estatísticas significativas de experiências SMFS, de preferência uma e a mesma molécula é usado ao longo de todo o decurso da experiência. Em contraste com as experiências com conjuntos de moléculas, as experiências SMFS são capazes de detectar eventos raros e estados moleculares escondidos. Outra vantagem dos experimentos única molécula é que eles podem ser modelados por meio de simulações de dinâmicas moleculares 24,25.
O protocolo de funcionalização cantilever descrito acima é uma versão modificada de procedimentos publicados anteriormente 26 - 28. Após a activação e a silanização, o cantilever AFM é funcionalizado com uma mistura de dois tipos diferentes de polietileno-glicol (PEG) moléculas (moléculas de ligação).
N- amino-reativa grupo (NHS) (ou um grupo maleimide reativa tiol), onde mais tarde na molécula sonda é conjugado ("NHS-PEG", "Mal-PEG"). Ver Figura 1 para uma representação esquemática da funcionalização ponta. O propósito do PEG é triplo: Em primeiro lugar, passivantes superfície da ponta e, por conseguinte, impede que a adsorção inespecífica. Em segundo lugar, usando uma determinada relação de metil-PEG / NHS-PEG permite o ajustamento da concentração de NHS-PEG na superfície da ponta. E em terceiro lugar, que separa a ponta da sonda a partir da molécula e, portanto, permite a quantificação da interacção molécula de superfície, sem interferência da interacção directa ponta da superfície. Em seguida, a molécula sonda está covalentemente acoplada à ponta através do NHS-PEG (ou Mal-PEG).
Este protocolo garante que todas as obrigações (*) no & #8220; ponta da cadeia de acoplamento "* OH * * silano PEG * molécula sonda são ligações covalentes e, portanto, muito forte. Este, por sua vez, permite que uma e a mesma molécula de sonda é medida ao longo de toda a duração da experiência. Isto foi exemplificado acima, na seção representante resultados mostrando verdadeiro espectroscopia de força molécula única.
Como pode-se verificar que verdadeiramente uma única molécula é medido? Para traços individuais com platôs de força constante, uma única gota para a linha de base é suficiente. Se mais do que um polímero é dessorvido, ao mesmo tempo, a força cai para zero em vários passos discretos, como cada polímero separa num ponto diferente. Mais difícil é decidir se é cada vez que a mesma molécula única. Por conseguinte, a distribuição de comprimentos de descolamento deve ser avaliada. Uma distribuição estreita de um único pico é uma boa indicação de que uma e a mesma molécula única foi sondado em todos os vestígios de força de extensão. Para traços individuais com rupteventos ure, a sobreposição de todos os vestígios é o melhor método para decidir se (uma e a mesma) numa molécula única foi medido. Alternativamente, cada traço pode ser equipado com um modelo (WLC) e, em seguida, o comprimento de persistência e os comprimentos de ruptura na uma força definida pode ser traçada. A distribuição destes dois parâmetros deve ser estreita e único pico.
Em conclusão, um procedimento de preparação para a fixação de uma grande variedade de moléculas individuais a sonda de AFM foi apresentado. Pequena ponta do AFM (raio ~ 10 nm), as suas capacidades de posicionamento lateral e sua sensibilidade vigor tornam a ferramenta ideal para estudar as propriedades de adesão de moléculas individuais em superfícies biológicas e não biológicas em quase todo o líquido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
