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Engineering

परमाणु शक्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा एकल अणु आसंजन की जांच कर

Published: February 27, 2015 doi: 10.3791/52456
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Physik-Department E22a, Technische Universität München, 2IMETUM, Technische Universität München

Abstract

परमाणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी सतहों और इंटरफेस में अणुओं का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण है। Covalently एक AFM टिप पर जोड़े एकल अणुओं की एक विशाल विविधता के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। एक ही समय में AFM टिप टिप AFM से जुड़ी एकल अणुओं का अध्ययन करने के लिए एक शर्त है जो टिप और सब्सट्रेट के बीच unspecific बातचीत को रोकने के लिए passivated है। विश्लेषण आसंजन बल, आसंजन लंबाई, और कुछ ही देर में प्रस्तुत कर रहे हैं और आगे पढ़ने के लिए बाहरी संदर्भ प्रदान की जाती हैं ठोस सतहों और जैव इंटरफेस पर इन अणुओं की मुक्त ऊर्जा निर्धारित करने के लिए। उदाहरण के अणुओं पाली (अमीनो एसिड) polytyrosine हैं, भ्रष्टाचार बहुलक PI- जी -PS और फॉस्फोलिपिड पोप (1-palmitoyl-2-oleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine)। इन अणुओं सीएच 3 -SAMs जैसे विभिन्न सतहों, हाइड्रोजन समाप्त कर हीरे से desorbed और विभिन्न विलायक शर्तों के तहत लिपिड bilayers समर्थन कर रहे हैं। अंत में,बल स्पेक्ट्रोस्कोपी एकल अणु प्रयोगों के फायदे सही मायने में एक अणु प्रयोग में अध्ययन किया गया है इसका मतलब है अगर तय करने के लिए सहित चर्चा कर रहे हैं।

Introduction

पिछले 30 वर्षों में, परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) यह सभी तीन आयामों में आणविक स्थानिक संकल्प प्रदान करता है और विभिन्न विलायक में संचालित किया जा सकता है के बाद से जैविक 1,2 और सिंथेटिक 3 सामग्री और सतहों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान इमेजिंग तकनीक होने के लिए बाहर कर दिया गया वातावरण। इसके अलावा, AFM के एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी (SMFS) शासन μN को पी.एन. से लेकर बलों को मापने के लिए सक्षम बनाता है और 4,5 तह प्रोटीन में उदाहरण के लिए अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि, बहुलक भौतिकी 6 दी है - 8, और एक अणु-सतह बातचीत 9 - एकल अणुओं के बजाय अणुओं का एक जोड़ा अध्ययन कर के पीछे 12 व्याप्ति तर्क अक्सर दुर्लभ घटनाओं या छिपा आणविक राज्यों मुखौटा जो प्रभाव के औसत से बचने के लिए है। इसके अलावा, इस तरह के आदि समोच्च लंबाई, कुहन लंबाई, आसंजन मुक्त ऊर्जा, के रूप में आणविक मापदंडों के एक भीड़ हो सकता हैप्राप्त की। यह नीचे दिए गए उदाहरणों में विस्तृत है। एक ठेठ है AFM-SMFS प्रयोग में, जांच अणु एक linker अणु के माध्यम से एक बहुत तेज टिप के लिए युग्मित है। टिप में ही एक bendable ब्रैकट के अंत में स्थित है। टिप सतह के साथ संपर्क में लाया जाता है तो जांच अणु इस सतह के साथ बातचीत करेंगे। सतह से अणु अलग करने के लिए, टिप, बल, और इसलिए मुक्त ऊर्जा का त्याग पर ब्रैकट के विक्षेपन के अवलोकन के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। सार्थक आँकड़े प्राप्त करने के लिए, तथाकथित बल दूरी घटता की एक बड़ी संख्या का अधिग्रहण किया जाना है। इसके अलावा, जांच अणु AFM टिप के लिए covalently मिलकर किया जाना चाहिए (यानी, एक और पूरे प्रयोग की अवधि से अधिक एक ही जांच अणु का उपयोग) सच्चे एकल अणु प्रयोगों के लिए है। इधर, एक सहसंयोजक बांड के माध्यम से एक ही अणु के साथ ब्रैकट functionalization के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। एक अणु या तो एक एमिनो या एक Thio के माध्यम से युग्मित किया जा सकता हैAFM टिप करने के लिए एल समूह। संयुग्मन प्रक्रिया का इस्तेमाल किया पॉलिमर के solvation गुणों के लिए खाते में (जैविक और जलीय) सॉल्वैंट्स का एक व्यापक विविधता में प्रदर्शन किया जा सकता है।

पहले भाग में, एक सामान्य प्रोटोकॉल covalently वर्णन किया गया है एक AFM टिप करने के लिए एक linker अणु के माध्यम से एक अणु ("जांच अणु") संलग्न करने के लिए। यह अंत करने, जैविक NHS- या maleimide-रसायन शास्त्र में 13 प्रयोग किया जाता है। तीन उदाहरण के अणुओं के लिए प्रोटोकॉल के साथ साथ, डाटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं में वर्णित हैं और आगे पढ़ने के लिए संदर्भ प्रदान की जाती हैं। उदाहरण के अणु होते हैं: (रैखिक) बहुलक टाइरोसीन, भ्रष्टाचार बहुलक PI- जी -PS और लिपिड पोप। उदाहरण covalently cysteines संलग्न करने के लिए इस प्रोटोकॉल के मामूली बदलाव भी शामिल है। इसके अलावा, एक खंड में इस तरह के एक हीरे की सतह, एक सीएच 3 -self-इकट्ठे monolayer और लिपिड bilayers के रूप में विभिन्न सतहों की तैयारी के लिए समर्पित है। इन इंटरफेस Prov हैएन अच्छे संदर्भ और उदाहरण हो।

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Protocol

नोट: तैयारी, डाटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण कदम शामिल प्रक्रिया प्रवाह के एक सिंहावलोकन के लिए चित्र 2 देखें।

1. अभिकर्मक सेटअप

नोट: सभी रसायनों देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए, और इस प्रकार एक प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और आंखों की सुरक्षा के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। सभी आपरेशनों एक प्रयोगशाला हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। विशेष रूप से, विशेष दस्ताने क्लोरोफॉर्म उपयोग के मामले में पहना जाना चाहिए।

  1. ऐसे शुष्क तेजी क्लोरोफॉर्म और दुकान शुष्क लेकिन एक सप्ताह से अधिक नहीं रह गया है के रूप में कम पानी की सामग्री के साथ रसायनों का प्रयोग करें। APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilan) और खूंटी (polyethylenglycol) (1 टेबल देखें) क्योंकि -20 डिग्री सेल्सियस पर और नाइट्रोजन या आर्गन गैस के तहत दोनों रसायनों की दुकान हीड्रोस्कोपिक हैं और खूंटी हवा में ऑक्सीकरण के अधीन है।
  2. आदर्श एक नाइट्रोजन वातावरण के साथ एक glovebox प्रणाली के भीतर, छोटे aliquots तैयार करते हैं, वायुमंडलीय ऑक्सीजन और नमी के लिए शेयर की लगातार जोखिम से बचने के लिएफिर से।

2. उपकरण सेटअप

नोट: यदि संभव हो पार संक्रमण से बचने के लिए, प्रत्येक चरण के लिए ताजा और साफ जहाजों का उपयोग करें।

  1. स्वच्छ कांच के बने पदार्थ और 60 डिग्री सेल्सियस पर एक अल्ट्रासोनिक स्नान में 30 मिनट के लिए डिटर्जेंट समाधान में चिमटी।
  2. कुल्ला और ultrapure पानी के साथ दो बार अच्छी तरह से कदम 2.1 से sonicate उपकरण।
  3. आरसीए समाधान में 2.1 कदम से हीट उपकरण (ultrapure पानी, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और अमोनिया (5: 1: 1)) को 75 डिग्री 45 मिनट के लिए एक ओवन में सी और बाद में ultrapure पानी के साथ उन्हें कुल्ला।
  4. अंत में, शुष्क नाइट्रोजन की एक धारा के तहत या एक ओवन (100 डिग्री सेल्सियस, 3 घंटा) में कांच के बने पदार्थ और चिमटी सूखी।

3. टिप functionalization

नोट: उपयोग चिमटी, बर्तन, आदि स्टेनलेस स्टील, PTFE, कांच या यदि लागू हो कार्बनिक समाधान में रासायनिक स्थिर है, जो किसी भी अन्य सामग्री से बनाया गया। जब तक अन्यथा निर्दिष्ट, अनुसंधान में सभी चरणों के लिए बाहर ले जानेऊष्मायन समाधान की राशि की जरूरत टी ब्रैकट चिप्स की संख्या पर निर्भर करता है। Cantilevers सभी समय पर संबंधित समाधान में डूब रहे हैं कि सुनिश्चित करें।

नोट: जैविक वाष्प की साँस लेना से बचने के लिए एक डाकू का प्रयोग करें।

  1. ब्रैकट सतह ('सक्रियण') (लगभग 0.5 घंटा) पर ओह-समूहों के गठन:
    1. एक साफ कांच स्लाइड पर और एक प्लाज्मा चैम्बर (100 डब्ल्यू) में डाल (10-100 पी.एन. / एनएम: पाप, वसंत निरंतर सामग्री) ताजा ब्रैकट चिप्स जगह को चिमटी का प्रयोग करें।
    2. चैम्बर (~ 0.1 मिलीबार) खाली।
    3. ऑक्सीजन गैस के साथ बाढ़ कक्ष और फिर खाली।
    4. (: 20%, अवधि: 15 मिनट, प्रक्रिया दबाव: 0.25 एम्बार शक्ति) प्लाज्मा प्रक्रिया को सक्रिय करें।
  2. Cantilevers के एमिनो silanization (लगभग 1 घंटा):
    1. प्लाज्मा प्रक्रिया के दौरान आदर्श रूप से ऐसा करते हैं - APTES समाधान के 2.5 मिलीलीटर की तैयारी एक गिलास पेट्री डिश में (1 टेबल देखें)।
    2. Immediatelप्लाज्मा प्रक्रिया के बाद वाई, एसीटोन में एक सेकंड के लिए प्रत्येक ब्रैकट डुबकी और APTES समाधान में तुरंत बाद उन्हें जगह है।
    3. आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. ध्यान से 10 एमएल एसीटोन और एक बार में 10 एमएल क्लोरोफॉर्म में दो बार ब्रैकट चिप्स कुल्ला।
    5. वैकल्पिक अंतिम चरण: एक साफ कांच स्लाइड पर पिछले चरण से जगह ब्रैकट चिप्स और 70 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए उन्हें सेंकना। सतह सक्रियण, जैसे, यूवी इलाज 12 के लिए वैकल्पिक रणनीतियों कि वहाँ भी ध्यान दें।
  3. PEGylation (लगभग 2 घंटा):
    नोट: अमीनो-silanization के दौरान कदम 3.3.1-3.3.4 बाहर ले। एन एच एस और maleimide समूहों जलीय वातावरण में hydrolysis के अधीन हैं और खूंटी में ही हवा में ऑक्सीकरण के अधीन है। इसलिए (विशेष रूप से कदम के बीच में) के समय एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। अधिक जानकारी के लिए 13 को देखें।
    1. क्लोरोफॉर्म समाधान (1 टेबल देखें) तैयार करें।
    2. संक्षेपण से बचने के लिएगर्म, खूंटी विभाज्य खोलने और उचित मात्रा में वजन से पहले आर टी अप करने के लिए पाउडर।
    3. पॉलिमर या एमिनो समूहों के साथ लिपिड का युग्मन के लिए अलग से वे पूरी तरह से हल कर रहे हैं जब तक उन्हें vortexing द्वारा क्लोरोफॉर्म समाधान में एन एच एस-खूंटी एनएचएस (6 केडीए) और मिथाइल-खूंटी एनएचएस (5 केडीए) हल। सांद्रता के लिए 1 टेबल को देखें।
      1. वैकल्पिक रूप से। thiol समूहों के साथ पॉलिमर के युग्मन के लिए अलग से क्लोरोफॉर्म समाधान में मल-NHS- खूंटी और मिथाइल-खूंटी एनएचएस हल।
    4. NHS- या maleimide- और मिथाइल समाप्त खूंटी अणु (: 500 आम तौर पर 1) के बीच एक निश्चित संख्या के अनुपात को समायोजित करने के लिए आवश्यक के रूप में समाधान मिलाएं। आदर्श अनुपात तैयारी-प्रयोग चक्र की एक श्रृंखला में iteratively निर्धारित किया है कि ध्यान दें।
    5. क्लोरोफॉर्म के वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक क्लोरोफॉर्म संतृप्त वातावरण के भीतर एक घंटा के लिए खूंटी समाधान में ब्रैकट चिप्स सेते हैं।
  4. अणु संयुग्मन जांच(> 1 घंटा):
    नोट: निम्न 3.4.1-3.4.3 में, AFM टिप करने के लिए अलग-अलग जांच के अणुओं के सहसंयोजक युग्मन के लिए तीन उदाहरण वर्णित हैं। प्रत्येक अणु के लिए प्रोटोकॉल के लिए समायोजित किया जाना है। उदाहरण 1 और 3 एनएचएस-रसायन शास्त्र में उदाहरण 2 में thiol functionalized बहुलक PI- जी -PS maleimide-रसायन शास्त्र के माध्यम से खूंटी के लिए युग्मित है जबकि प्रयोग किया जाता है कि आगे ध्यान दें। विवरण 14 देखें।
    1. पाली (अमीनो एसिड) पाली-डी-टाइरोसीन (40-100 केडीए) के लिए
      1. 1 एम NaOH में polytyrosine संयुग्मित जांच अणु भंग। 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर एकाग्रता को समायोजित करें।
      2. Functionalization के तुरंत पहले स्पिन desalting स्तंभ (7 केडीए MWCO) का उपयोग सोडियम borate बफर (पीएच 8.1) के लिए NaOH के का आदान-प्रदान
      3. फिर इथेनॉल के 5 मिलीलीटर के साथ और अंत में borate बफर के 5 मिलीलीटर के साथ क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीलीटर, साथ पहली cantilevers कुल्ला।
      4. Polytyrosine borate बफर समाधान में 1 घंटे के लिए ब्रैकट चिप्स सेते हैं और फिर borate बफर से कुल्लाऔर ultrapure पानी। माप तक ultrapure पानी में स्टोर।
    2. एक रेखीय रीढ़ की हड्डी (polyisoprene, 119 केडीए) होने grafted पक्ष श्रृंखला (polystyrene, 88 केडीए) के साथ 14 पॉलिमर के लिए
      1. शुष्क क्लोरोफॉर्म में PI- जी -PS भंग। 4 मिलीग्राम / एमएल के लिए संयुग्मन समाधान की एकाग्रता को समायोजित करें।
      2. क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीलीटर के साथ cantilevers कुल्ला और संयुग्मन समाधान में कम से कम एक घंटा के लिए सेते हैं।
      3. क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीलीटर में फिर से कुल्ला और एक क्लोरोफॉर्म संतृप्त वातावरण में क्लोरोफॉर्म में स्टोर माप तक (क्लोरोफॉर्म वाष्पीकरण रोकने के लिए)।
    3. लिपिड पोप के लिए
      1. शुष्क क्लोरोफॉर्म में पोप भंग। 20 मिमी के लिए एकाग्रता को समायोजित करें।
      2. इथेनॉल के 5 मिलीलीटर और लिपिड समाधान में 1 घंटे के लिए cantilevers के ऊष्मायन से पहले ultrapure पानी के 5 मिलीलीटर के साथ cantilevers कुल्ला।
      3. ऊष्मायन के बाद, क्लोरोफॉर्म के 5 मिलीलीटर, ethano के 5 मिलीलीटर के साथ cantilevers कुल्लाएल और (इस क्रम में) गर्म, ultrapure पानी के 5 मिलीलीटर अनबाउंड जांच के अणुओं को दूर करने और क्लोरोफॉर्म अवशेषों से छुटकारा पाने के लिए। तुरंत Functionalized युक्तियों का उपयोग करें। जब तक जरूरत वैकल्पिक रूप से, क्लोरोफॉर्म में उन्हें दुकान।

चित्र 1
चित्रा 1. (ए) योजनाबद्ध एनएचएस रसायन शास्त्र के उदाहरण का उपयोग टिप functionalization प्रक्रिया दिखा। एक एमिनो समूह के माध्यम से टिप करने के लिए एक जांच अणु संलग्न करने के लिए कार्यरत (बी) रासायनिक संबंध। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. भूतल तैयारी

  1. आत्म इकट्ठे monolayer (एसएएम)
    नोट: पहला उदाहरण के लिए सतह के रूप में, एक आत्म इकट्ठे monolayer चुना गया था। साहित्य 15 का संदर्भ लें
  2. 30 मिनट प्रत्येक के लिए एक अल्ट्रासोनिक स्नान में ultrapure पानी में दो बार तो डिटर्जेंट समाधान और साथ स्वच्छ गिलास स्लाइड। फिर, एक अतिरिक्त सफाई कदम के रूप में, 15 मिनट के लिए 75 डिग्री सेल्सियस पर आरसीए समाधान (2.3 कदम देखें) में उन्हें जगह है।
  3. कोट 10 एनएम क्रोमियम निकल और एक निर्वात coater में 100 एनएम सोने के साथ स्लाइड। फिर सीधे से पहले अगले कदम के लिए आरसीए समाधान में फिर से फ्रिज और स्वच्छ में स्टोर।
  4. 12 घंटा के लिए 2 मिमी 1-dodecanthiol / इथेनॉल समाधान में पिछले चरण की स्लाइड्स सेते हैं। thiol समूहों सोने की सतह के लिए बाध्य है और एक हाइड्रोफोबिक monolayer स्वयं assembles। नाइट्रोजन गैस की एक धारा से इथेनॉल और ultrapure पानी और फिर सूखे के साथ स्लाइड कुल्ला। एक सीसीडी कैमरा 10 के साथ एक गोनियोमीटर में स्थिर संपर्क कोण माप के साथ तैयार की सतह के hydrophobicity की पुष्टि करें।
  • हाइड्रोजन से समाप्त हीरा
    नोट: दूसरा उदाहरण के लिए एक सतह के रूप में, एक हाइड्रोजन समाप्त कर हीरा चुना गया था। पहले से 16 के रूप में वर्णित सतह तैयार किया गया था।
  • समर्थित लिपिड bilayer
    नोट: पिछले उदाहरण में, एक सतह समर्थित लिपिड bilayer (SLB) एक सतह के रूप में इस्तेमाल किया गया था। इस तरह के एक सतह प्राप्त करने के लिए, फॉस्फोलिपिड POPC से मिलकर बड़े unilamellar पुटिकाओं (luvs) का एक समाधान (0.1 मिलीग्राम / एमएल) बाहर निकालना विधि द्वारा गठित किया गया। तब LUV समाधान के 50 μl एक हौसले cleaved अभ्रक शीट (एक = 1 सेमी ²) पर रख दिया और 30 मिनट के लिए incubated रहे थे। अंत में समाधान ultrapure पानी की 20 मिलीलीटर के साथ rinsed गया था। SLBs की तैयारी की एक विस्तृत विवरण के लिए 17,18 देखें।

    • 5. डाटा अधिग्रहण

    नोट: प्रयोगों के लिए, तरल पदार्थ में उपाय करने के लिए क्षमता प्रदान करता है जो एक AFM, का उपयोग करें। डाटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं की परवाह किए बिना इस्तेमाल किया AFM के मॉडल के लागू होते हैं। इसके अलावा, कुछ प्रयोगों में यह temperatur को नियंत्रित करने की संभावना है के लिए फायदेमंद हैतरल कोशिका के भीतर ई। ब्रैकट विक्षेपन लेजर बीम नीचे को झुकाव विधि 19 के माध्यम से पता चला था। स्प्रिंग स्थिरांक थर्मल शोर विधि 20 के साथ निर्धारित किया गया है।

    1. तरल पदार्थ में मापने के लिए उपयुक्त है जो एक AFM ब्रैकट धारक में क्रियाशील ब्रैकट डालें।
    2. (तैयारी ऊपर देखें) सतह रखो AFM के में जांचा जा करने के लिए और तरल के साथ कवर। दोनों, ब्रैकट और सतह अब ब्रैकट टिप सतह की ओर इशारा करते हुए के साथ तरल में डूब जाना चाहिए। कई मामलों में तरल पदार्थ की एक बूंद के लिए पर्याप्त है कि ध्यान दें। तरल पदार्थ के किसी भी मामले वाष्पीकरण में एक बंद द्रव सेल का उपयोग करके, जैसे, बचा जाना चाहिए।
    3. यदि लागू हो, नियंत्रक पर वांछित तापमान को समायोजित।
    4. प्रणाली में कम से कम आधे घंटे के लिए संतुलित करना।
    5. प्रभाव भिगोना किसी भी सतह को बाहर करने के क्रम में दूर दूर सतह से ब्रैकट साथ ब्रैकट के एक थर्मल शोर स्पेक्ट्रम रिकार्ड। नोट: आमतौर पर एक कि0 या अधिक स्पेक्ट्रा एक पर्याप्त संकेत करने वाली शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए संचित किया जाना है।
    6. सतह दृष्टिकोण। टिप ज्यामिति और टिप functionalization के संरक्षण के क्रम में दृष्टिकोण प्रक्रिया को ध्यान से बाहर ले जाने के लिए है कि ध्यान दें। इस आंतरायिक संपर्क मोड में आ रहा है, उदाहरण के लिए, के द्वारा पूरा किया जा सकता है।
    7. एनएम / वाल्ट में मापा उलटा ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता (InvOLS) निर्धारित करते हैं। एक कठिन सतह के खिलाफ ब्रैकट टिप धक्का द्वारा यह मत करो।
      1. फोटोडायोड वोल्टेज में परिवर्तन बनाम पीजो यात्रा की दूरी के ढलान को मापने के द्वारा InvOLS निर्धारित करते हैं। ब्रैकट टिप सतह के साथ संपर्क में है, जहां बल-दूरी की अवस्था का हिस्सा करने के लिए एक लाइन फिट। लिपिड bilayers की तरह एक नरम सतह से जुड़े प्रयोगों में, एक लिपिड bilayer ('दोष' स्पॉट) के साथ कवर नहीं कर रहे हैं, जो क्षेत्रों पर इस कदम के लिए बाहर ले।
    8. थर्मल शोर स्पेक्ट्रम के लिए एक हार्मोनिक थरथरानवाला फिटिंग द्वारा लगातार वसंत (पी.एन. / एनएम) निर्धारित करते हैं। यूज़लगातार वसंत निर्धारण के लिए स्वचालित सॉफ्टवेयर समारोह; अन्यथा साहित्य 20 से परामर्श करें।
    9. प्रयोग शुरू करें।
      1. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत में रिकॉर्ड अनेक बल दूरी घटता। एक माइक्रोन की दूरी वापस लेना, 5 किलोहर्ट्ज़, 1 माइक्रोन / सेकंड की नोक गति का नमूना दर: आमतौर पर, प्रयोगात्मक मापदंडों के लिए निम्न मान का उपयोग करें।
        नोट: कभी-कभी, अध्ययन प्रयोग की गतिशीलता पर निर्भर करता है, यह ('समय ध्यान केन्द्रित') की सतह के साथ संपर्क में टिप के साथ समय की एक निश्चित राशि प्रतीक्षा करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
        नोट: प्रयोग विशिष्ट मानदंडों ऊपर दिए गए मूल्यों से काफी विचलित कर सकते हैं।
      2. लंबी अवधि के माप के दौरान, फोटोडायोड repositioning द्वारा समय-समय पर फोटोडायोड पर लेजर स्थिति शून्य।
      3. वैकल्पिक: हर बल की अवस्था के बाद, एक और XY स्थिति के लिए AFM के नोक स्थानांतरित।
      4. प्रयोग के अंत में, संवेदनशीलता और वसंत का निर्धारण constaप्रणाली की निरंतरता और स्थिरता के लिए जाँच करने के लिए फिर से NT।
        नोट: पहले और प्रयोग के बाद वसंत निरंतर और संवेदनशीलता की तुलना करना भी प्रणाली के गुण और टिप के गुणों को प्रयोग के पाठ्यक्रम पर अपरिवर्तित बनी हुई है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक साधन है। वसंत स्थिरांक का अंतर (<= 15%) बहुत बड़ी नहीं है, तो वसंत लगातार दृढ़ संकल्प के आंतरिक अनिश्चितता भी लगभग 15% है, के बाद से वे औसतन किया जा सकता है। बड़े मतभेद के लिए, यह पहली बार मिल रहा है और आगे के प्रयोगों के साथ जारी रखने से पहले बदलते स्पष्ट लगातार वसंत के लिए कारण को खत्म करने की सलाह दी जाती है।

    6. डेटा तैयारी

    नोट: आमतौर पर न्यूटन और नैनोमीटर के रूप में अच्छी तरह से डेटा वर्णित हैं सही करने के लिए इकाइयों को परिवर्तित करने के लिए प्रयोग के विशिष्ट प्रकार के स्वतंत्र बाहर किया जाता है जो इस खंड सामान्य डेटा तैयारी चरणों में। प्रयोग विशिष्ट डेटा का विश्लेषण बीआर हैंiefly संबंधित प्रतिनिधि उदाहरण खंड में आगे नीचे वर्णित है।

    1. आमतौर पर, सभी डेटा तैयार करने के लिए बाहर ले और विश्लेषण सॉफ्टवेयर इगोर 6 प्रो पर आधारित है, जैसे एक घर में लिखा एल्गोरिथ्म, द्वारा स्वचालित रूप से दोहराएँ।
    2. InvOLS [एनएम / वी] और लगातार वसंत [एनएन / एनएम] के साथ यह गुणा करके बल में कच्चे विक्षेपन संकेत (Defl) [वी] कन्वर्ट।
    3. सतह (उतार दिया ब्रैकट) से पर्याप्त दूरी में ब्रैकट पर बल 0 एन हो जाता है कि इस तरह से बल ऑफसेट।
    4. वास्तविक टिप स्थिति को ध्यान में ब्रैकट के झुका लेता है जो Z * (सतह के सापेक्ष मापा जब भी बुलाया जुदाई) की गणना:
      1 समीकरण
    5. Z * = 0 सतह के Z स्थिति से मेल खाती है कि इस तरह से Z * ऑफसेट।
      नोट: यहाँ, एफ टिप और इसलिए मोड़ पर कार्य करता है जो शक्ति हैब्रैकट (6.2 कदम में निर्धारित की।), जेड (सीधे साधन के द्वारा दिए गए) और कश्मीर वसंत निरंतर (कदम 5.8 में निर्धारित) का प्रतिनिधित्व करता है मापा Z-सेंसर स्थिति है है।

    चित्र 2
    नमूना तैयार करने, डाटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण दिखा चित्रा 2. प्रक्रिया प्रवाह आरेख। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Representative Results

    बाद में, इसके बाद के संस्करण के लिए परिणाम उदाहरण अणु, अर्थात् पॉलिमर पाली (अमीनो एसिड) polytyrosine वर्णित है, भ्रष्टाचार बहुलक PI- जी -PS और फॉस्फोलिपिड पोप, प्रस्तुत कर रहे हैं। पहले प्रत्येक उदाहरण के लिए, प्रदान की जाती हैं डाटा अधिग्रहण और डेटा तैयार करने के लिए विशिष्ट विवरण प्रयोग। फिर, इन अणुओं विभिन्न सतहों से desorbed गया जहां प्रयोगों के लिए अनुकरणीय परिणाम (सीएच 3 -SAMs, हाइड्रोजन समाप्त कर हीरे और लिपिड bilayers) दिखाए जाते हैं। आसंजन बल, आसंजन लंबाई और मुक्त ऊर्जा का निर्धारण पेश कर रहे हैं।

    उदाहरण 1: आत्म इकट्ठे monolayer से polytyrosine की Desorption

    इथेनॉल की एक अलग सामग्री के साथ अलग अलग समाधान में एक हाइड्रोफोबिक सैम से polytyrosine की desorption मापा गया था। ऊपर और कम से कम 300 बल डी के रूप में वर्णित प्रत्येक समाधान में ब्रैकट InvOLS और वसंत स्थिरांक निर्धारित किया गया हैistance निशान प्रत्येक समाधान के लिए दर्ज किए गए। एक प्रयोगात्मक सेट के सभी प्रयोगों कि एक और एक ही एकल पाली (अमीनो एसिड) मापा गया था सुनिश्चित करने के लिए एक ही दिन पर एक भी ब्रैकट के साथ किया गया। ब्रैकट के विस्तार / त्याग वेग 0.5 माइक्रोन / सेक था और सतह पर ध्यान केन्द्रित करना समय 1 सेकंड था। बल दूरी निशान निरंतर बल के पठारों दिखाया। प्रत्येक पठार एक sigmoidal वक्र और पठार शक्ति के रूप में अच्छी तरह से पठार लंबाई निर्धारित और एक हिस्टोग्राम में साजिश रची थे साथ लगाया गया था। histograms के वितरण निकाला गया था की एक गाऊसी और चोटी के मूल्य के रूप में अच्छी तरह से मानक भिन्नता (त्रुटि) के साथ लगाया गया था। बल पठार के बहुत अंत तक, प्रणाली संतुलन में है और पठार के नीचे क्षेत्र इसलिए बहुलक लंबाई प्रति मुक्त ऊर्जा के बराबर होती है। पठार के अंत में ही सेना की टुकड़ी की प्रक्रिया ही गैर संतुलन में है। इस वजह से, ठेठ प्रयोगों के लिए पठार लंबाई equilibri से अधिक समय है उम लंबाई (लगभग 30%) और sigmoidal नीचे क्षेत्र आसंजन मुक्त ऊर्जा 21 के लिए एक ऊपरी अनुमान फिट बैठता है।

    चित्र तीन
    (लाल रंग में दिखाया गया है) शुद्ध पानी में एक मिथाइल-एसएएम पर polytyrosine की चित्रा 3 (ए) सेना दूरी का पता लगाने (त्याग)। केवल एक ही अणु आधारभूत (शून्य बल) के लिए बल का भी कदम बूंद में देखा जा सकता है के रूप में desorbs। sigmoidal फिट काले रंग में दिखाया गया है और निकाले पठार लंबाई और पठार बल तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। शुद्ध पानी में और अलग अलग दाढ़ इथेनॉल सामग्री के साथ पानी / इथेनॉल के मिश्रण में मापन के लिए निकाले पठार बल (बी) Histograms। एक ही प्रयोगात्मक सेट (सी) के पठार लंबाई histograms। (डी) शिखर पठार बल बनाम पीक पठार लंबाई। "456 / 52456fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 3A शुद्ध पानी में मापा polytyrosine की एक भी बल-दूरी का पता लगाने से पता चलता है। पठार बल और पठार लंबाई निकाले जाते हैं। सैम से desorbed है कि नोक पर केवल एक अणु है, तो पठार लंबाई हिस्टोग्राम एक संकीर्ण और monomodal वितरण से पता चलता है (आमतौर पर प्रयोगों में लंबाई हिस्टोग्राम की एक गॉस फिट में मानक विचलन के आसपास है 5-20 एनएम)। पठार लंबाई हिस्टोग्राम में केवल एक संकीर्ण चोटी अगर वहाँ इसके विपरीत, एक पूरे प्रयोगात्मक सेट एक और एक ही बहुलक साथ किया गया था कि अपेक्षाकृत यकीन किया जा सकता। इस के लिए कारण polytyrosines आकार (50-100 केडीए) में अत्यधिक polydispersive कर रहे हैं। इसलिए, वास्तव में एक ही लंबाई के दो पॉलिमर अत्यधिक असंभव हैं। इथेनॉल जोड़ना polytyrosine और सतह 10,22 और बीच हाइड्रोफोबिक बातचीत को कमजोरचित्रा 3 बी में दिखाया अलग विलायक स्थितियों के लिए पठार बल histograms में देखा जा सकता है के रूप में एक कम पठार बल को इस प्रकार एक कम सोखना मुक्त ऊर्जा की ओर जाता है और। अब यह एक एकल polytyrosine के पठार लंबाई अलग सोखना मुक्त ऊर्जा के लिए कैसे परिवर्तन की जांच की जा सकती है। चित्रा -3 सी में देखा जा सकता है पठार लंबाई इथेनॉल के अलावा के साथ कम हो जाती है। एक ही समय में पठार बल कम हो जाती है (चित्रा 3 डी)।

    Desorption प्रक्रिया के सभी प्रासंगिक मापदंडों अर्थात् समोच्च लंबाई, कुहन लंबाई, सोखना मुक्त ऊर्जा और आंतरिक मोनोमेरिक desorption दर प्राप्त करने के लिए, एक निरंतर दूरी प्रयोगों के साथ ऊपर वर्णित माप गठबंधन करने के लिए है। विवरण 21 देखें।

    उदाहरण 2: एक हाइड्रोफोबिक हीरे से भ्रष्टाचार बहुलक PI- जी -PS की Desorption

    चित्रा -4 ए में जी -PS के साथ प्राप्त 4B ठेठ बल दूरी घटता दिखाए जाते हैं। सतह पर ध्यान केन्द्रित करना समय 1 सेकंड था और ब्रैकट के वेग / सेक एक माइक्रोन था। निरंतर बल (चित्रा -4 ए) या ​​टूटना घटनाओं की या तो पठारों (4B चित्रा) मनाया गया। निरंतर बल के पठारों के लिए, पठारों की ऊंचाई एक sigmoidal फिट के साथ निर्धारित किया गया था और मूल्यों को एक हिस्टोग्राम (चित्रा 4C) में साजिश रची थे। सतह (चित्रा 4 बी में बल-दूरी की अवस्था में पहली शिखर) के साथ टिप के प्रत्यक्ष संपर्क के कारण unspecific आसंजन शिखर बाहर करने के लिए, सतह से कुछ दूरी में अधिक से अधिक बल निर्धारित किया गया था। इन टूटना घटनाओं के लिए प्राप्त मूल्यों फिर एक हिस्टोग्राम (चित्रा 4D) में साजिश रची थे। आगे के विश्लेषण के लिए histograms एक गाऊसी के साथ लगाया गया है और अधिक से अधिक ऊंचाई के लिए एक औसत मूल्य के रूप में चुना गया थाडेटा बिंदु। प्रयोग के इस तरह के साथ कंधे चेन और उनकी वास्तुकला की उपस्थिति के प्रभाव से 14 की जांच की गई थी।

    चित्रा 4
    चित्रा 4. सेना दूरी त्याग polystyrene के पक्ष श्रृंखला के साथ grafted एक रेखीय polyisoprene रीढ़ की हड्डी (PI- जी -PS) के साथ प्रदर्शन घटता। या तो निरंतर बल (ए) या ​​टूटना घटनाओं (बी) के पठारों मनाया जाता है। निरंतर बल के पठारों के लिए, पठारों की ऊंचाई एक sigmoidal फिट के साथ निर्धारित किया जाता है और एक हिस्टोग्राम टूटना घटनाओं के लिए, अधिक से अधिक टूटना बल निर्धारित किया जाता है, जबकि (सी) (डी) में साजिश रची है। यहाँ क्लिक करें इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए आंकड़ा।

    उदाहरण 3: एक ही फोटो का निष्कर्षणएक लिपिड bilayer से spholipid (पोप)

    चित्रा 5A एक अणु निकासी की प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है। निष्कर्षण माप खड़ी समर्थित लिपिड bilayer की ओर पोप-क्रियाशील AFM टिप आ द्वारा प्रदर्शन किया गया () नहीं दिखाया। POPC दोहरी परत के साथ टिप के संपर्क करने पर, एक छोटे से बल (~ 100 PN) के बारे में 4 सेकंड के लिए एक राय पाश से स्थिर रखा जाता है। पोप अणु इस बसना समय के दौरान दोहरी परत में सम्मिलित करता है, तो इसे बाहर खींच लिया है या दोहरी परत से AFM टिप retracting पर दोहरी परत से 'निकाली गई'। यह विशेषता बल दूरी घटता में यह परिणाम है। उनका आकार मूल रूप से खूंटी लिंकर की खींच लोच द्वारा निर्धारित किया जाता है और एक wormlike श्रृंखला (WLC) मॉडल 23 से लगाया जा सकता है। 50 से अधिक घटता की एक superposition चित्रा 5 ब में दिखाया गया है। यह सच है कि एक अणु की घटनाओं एकल नुकीला बल histograms (चित्रा 5C द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है ओंग>)। कुछ आणविक पैरामीटर के आकार में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए ध्यान दें कि (जैसे, bilayers में लिपिड का मतलब जीवन समय), यह अलग बल लोड हो रहा दरों के साथ माप बाहर ले जाने के लिए आवश्यक है। एकल लिपिड के आगे के विश्लेषण के लिए निष्कर्षण प्रयोगों 24 देखें।

    चित्रा 5
    एक लिपिड bilayer से एक अणु की निकासी के लिए चित्रा 5 (ए) योजनाबद्ध। लिपिड अणु covalently टिप करने के लिए युग्मित है कि ध्यान दें। इसलिए, बल-निष्कर्षण चक्रों के कई सौ या भी हजारों एक और एक ही अणु के साथ बाहर किया जा सकता है। (बी) के 50 से अधिक निकासी घटता 9 के superposition। (बी) में दिखाए गए उदाहरण की निकासी के बल वितरण (सी) हिस्टोग्राम।जेपीजी "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चरण उद्देश्य घुला हुआ पदार्थ विलायक ठेठ अनुपात या एकाग्रता
    Silanization ब्रैकट सतह पर अमीनो समूह बनाएं APTES (3-aminopropyl) त्रि-ethoxysilane (जैसे, Vectabond ™) शुष्क एसीटोन 01:50 (वी / वी) - 1: 100 (वी / वी)
    PEGylation अमीनो या thiol प्रतिक्रियाशील समूहों के साथ ब्रैकट सतह प्रदान एन एच एस-खूंटी एनएचएस या मल-खूंटी एनएचएस शुष्क क्लोरोफॉर्म 0.25-25 मिमी
    PEGylation Passivate ब्रैकट सतह मिथाइल-खूंटी एनएचएस शुष्क क्लोरोफॉर्म 25 मिमी
    जांच अणु के विकार द्वि-कार्यात्मक खूंटी के लिए एक एमिनो या thiol समूह के माध्यम से दम्पत्ति जांच अणु जांच अणु (पॉलिमर, लिपिड, आदि) शुष्क क्लोरोफॉर्म या borate बफर 0.1-10 मिमी

    तालिका 1. समाधान टिप functionalization के लिए की जरूरत है।

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    Discussion

    पिछले दशकों के दौरान, एक अणु प्रयोगों आणविक तंत्र में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान की है और जीवन विज्ञान और परे में एक अमूल्य दृष्टिकोण होने के लिए बाहर कर दिया है। SMFS प्रयोगों, आदर्श एक और एक ही अणु प्रयोग के पूरे पाठ्यक्रम पर प्रयोग किया जाता है से अच्छा और सार्थक आँकड़े प्राप्त करने के लिए। अणुओं की टुकड़ियों के साथ प्रयोग करने के लिए इसके विपरीत, SMFS प्रयोगों दुर्लभ घटनाओं और छिपा आणविक राज्यों का पता लगाने में सक्षम हैं। एकल अणु प्रयोगों का एक अन्य लाभ यह है कि वे आणविक गतिशीलता सिमुलेशन 24,25 के माध्यम से मॉडलिंग की जा सकती है।

    28 - ऊपर वर्णित ब्रैकट functionalization के प्रोटोकॉल पहले से 26 प्रकाशित प्रक्रियाओं का एक संशोधित संस्करण है। सक्रियण और silanization के बाद, AFM के ब्रैकट पॉलीथीन-ग्लाइकॉल के दो विभिन्न प्रकार (खूंटी) अणुओं (लिंकर अणुओं) का एक मिश्रण के साथ क्रियाशील है।

    एन hydroxysuccinimide द्वारा दूसरा (एनएचएस) समूह (या एक thiol प्रतिक्रियाशील maleimide समूह) द्वारा समाप्त होता है, जहां बाद में जांच अणु पर ("मल-खूंटी", "एन एच एस-खूंटी") संयुग्मित है। टिप functionalization के एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें। खूंटी के उद्देश्य तिगुना है: सबसे पहले, यह टिप सतह passivates और इसलिए unspecific सोखना रोकता है। दूसरा, एक निश्चित मिथाइल-खूंटी / एन एच एस-खूंटी अनुपात का उपयोग टिप सतह पर एन एच एस-खूंटी एकाग्रता को एडजस्ट करने के लिए अनुमति देता है। और तीसरा, यह जांच अणु से टिप अलग करती है और इसलिए प्रत्यक्ष टिप-सतह बातचीत से बिना किसी हस्तक्षेप के अणु-सतह बातचीत की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है। तो फिर जांच अणु covalently एनएचएस-खूंटी (या मल-खूंटी) के माध्यम से टिप करने के लिए युग्मित है।

    इस प्रोटोकॉल सुनिश्चित करता है कि & # सभी बांड (*)8220; युग्मन श्रृंखला "टिप * ओह * silane * खूंटी * जांच अणु सहसंयोजक बांड और इसलिए बहुत मजबूत हैं। यह बदले में, एक और एक ही जांच अणु प्रयोग की पूरी अवधि में मापा जाता है कि अनुमति देता है। यह सच है एक अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी दिखा प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग में उपरोक्त उदाहरण दिया गया है।

    कैसे सही मायने में एक अणु मापा जाता है कि सत्यापित किया जा सकता है? निरंतर बल के पठारों के साथ एकल निशान के लिए, आधारभूत की एक बूंद के लिए पर्याप्त है। एक से अधिक बहुलक एक ही समय में desorbed जाता है तो प्रत्येक बहुलक एक अलग बिंदु पर detaches के रूप में, बल, कई असतत चरणों में शून्य करने के लिए चला जाता है। और अधिक मुश्किल यह एक ही अणु हर बार है कि अगर तय करने के लिए है। इसलिए टुकड़ी लंबाई के वितरण का मूल्यांकन किया जाना है। एक भी चोटी के साथ एक संकीर्ण वितरण कि एक और एक ही अणु हर बल-विस्तार का पता लगाने में जांच की गई थी एक अच्छा संकेत है। Rupt साथ ही निशान के लिएure घटनाओं, सभी निशान के superposition (एक और एक ही) एक अणु मापा गया था कि अगर तय करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है। वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक का पता लगाने के एक (WLC) मॉडल के साथ फिट किया जा सकता है और फिर हठ लंबाई और एक परिभाषित बल पर टूटना लंबाई दोनों साजिश रची जा सकता है। इन दो मापदंडों के वितरण संकीर्ण और नुकीला एकल हो गया है।

    अंत में, AFM के सुझावों के लिए एकल अणुओं की एक बड़ी विविधता की कुर्की के लिए एक तैयार करने की प्रक्रिया प्रस्तुत किया गया है। AFM के छोटे टिप (त्रिज्या ~ 10 एनएम) ने अपने पार्श्व स्थिति क्षमताओं और अपने बल संवेदनशीलता यह लगभग किसी भी तरल में जैविक और गैर जैविक सतहों पर एकल अणुओं के आसंजन गुणों का अध्ययन करने के लिए आदर्श उपकरण बनाते हैं।

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Materials
    Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) Hellma
    RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) Sigma
    Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane Vectorlabs
    Dry acetone (< 50 ppm H2O) Sigma
    Dry chloroform (> 99.9%) Sigma
    Triethylamine Sigma
    Ultrapure water Biochrom, Germany
    Di-sodium tetraborate (> 99.5%) Biochrom, Germany
    Boric Acid Biochrom, Germany
    Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” Rapp, Germany
    Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” Rapp, Germany
    Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” Rapp, Germany
    Probe molecule (polymer, lipid, etc.)
    Equipment
    Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids VWR International GmbH, Germany
     
     
     
     
     
     
    Name Company Catalog Number Comments
    Laboratory oven model UF30 Memmert, Germany
    Temperature controlled sonicator VWR International GmbH, Germany
    Plasma system "Femto", 100 W Diener, Germany
    One separate glass syringe for each organic solvent VWR International GmbH, Germany
    Vortex mixer VWR International GmbH, Germany
    Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) Eppendorf
    Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl Eppendorf
    AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) Asylulm Research, Santa Barbara
    Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) Bruker AXS, Santa Barbara

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    References

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    भौतिकी अंक 96 AFM functionalization एक अणु पॉलिमर लिपिड आसंजन परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी बल स्पेक्ट्रोस्कोपी
    परमाणु शक्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा एकल अणु आसंजन की जांच कर
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    Stetter, F. W. S., Kienle, S.,… More

    Stetter, F. W. S., Kienle, S., Krysiak, S., Hugel, T. Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (96), e52456, doi:10.3791/52456 (2015).

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