Abstract
Atomic force spektroskopi er et ideelt værktøj til at studere molekyler ved overflader og grænseflader. En forsøgsprotokol at koble en lang række enkelte molekyler kovalent på en AFM spids præsenteres. Samtidig AFM spids passiveres at forhindre uspecifikke interaktioner mellem spidsen og substratet, hvilket er en forudsætning for at studere enkelte molekyler knyttet til AFM spids. Analyser til bestemmelse af vedhæftning kraft, vedhæftning længde, og den gratis energi af disse molekyler på faste overflader og bio-interfaces er kort præsenteret og eksterne henvisninger til yderligere læsning leveres. Eksempel molekyler er poly (aminosyre) polytyrosine, graftpolymeren PI- g-PS og phospholipidet POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin). Disse molekyler er desorberet fra forskellige overflader som CH 3 -SAMs, brint termineret diamant og støttede lipiddobbeltlag under forskellige opløsningsmiddelbetingelser. Endeligfordele ved force spektroskopiske enkelt molekyle eksperimenter diskuteres herunder midler til at beslutte, om virkelig en enkelt molekyle er blevet undersøgt i forsøget.
Introduction
I løbet af de seneste 30 år har atomic force mikroskopi (AFM) viste sig at være en værdifuld billeddannelse teknik til at studere biologiske 1,2 og syntetiske 3-materiale og overflader, da det giver molekylær rumlig opløsning i alle tre dimensioner, og kan betjenes i forskellige opløsningsmiddel miljøer. Desuden AFM-enkelt molekyle force spektroskopi (SMFS) gør det muligt at måle kræfter lige fra PN til μN regime og har givet hidtil uset indsigt f.eks til protein foldning 4,5, polymer fysik 6-8, og enkelt molekyle-overflade interaktionen 9 - 12 .Den rationale bag studere enkelte molekyler snarere end et ensemble af molekyler er at undgå gennemsnit virkninger, som ofte maskerer sjældne begivenheder eller skjulte molekylære tilstande. Endvidere kan en lang række molekylære parametre, såsom kontur længde, Kuhn længde adhæsionen fri energi, etc. væreopnået. Dette er nærmere beskrevet i eksemplerne nedenfor. I en typisk AFM-SMFS eksperiment probemolekylet koblet til en meget skarp spids via et linkermolekyle. Spidsen selv er placeret ved enden af en bøjelig cantilever. Hvis spidsen bringes i kontakt med overfladen probemolekylet vil interagere med denne overflade. Ved at observere afbøjningen af udliggeren ved tilbagetrækning af spidsen, den kraft og dermed den frie energi, for at frigøre molekylet fra overfladen kan bestemmes. For at opnå meningsfulde statistikker, har en lang række såkaldte force afstande kurver, der skal erhverves. Endvidere har sande enkelt molekyle forsøg (dvs. ved hjælp af en og samme probemolekyle over varigheden af hele forsøget) probemolekylet bør kobles kovalent til AFM spids. Her er en forsøgsprotokol til cantilever funktionalisering med et enkelt molekyle via en kovalent binding fremlagt. Den enkelt molekyle kan enten være koblet via en amino- eller en thiol gruppe AFM spids. Konjugeringen kan udføres i en bred række opløsningsmidler (organiske og vandige) redegøre for de solvatisering egenskaber af polymerer, der anvendes.
I den første del, en generel protokol covalent vedhæfte et enkelt molekyle ("probe molekyle") via et linkermolekyle til en AFM spids er beskrevet. Til dette formål, er økologisk NHS- eller maleimid-kemi anvendt 13. Sammen med protokollen for tre eksempel molekyler, er datafangst og dataanalyse processer beskrevet og referencer til yderligere læsning leveres. Eksemplet molekyler er: (lineær) polymer tyrosin, graftpolymeren PI- g-PS og lipid POPE. Dette omfatter små variationer i protokollen, for eksempel for at kovalent vedhæfte cysteiner. Desuden er en sektion dedikeret til fremstilling af forskellige overflader, såsom en diamant overflade, en CH3 -Self samlet monolag og lipiddobbeltlag. Disse grænseflader har proven til at være gode referencer og eksempler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Se figur 2 for et overblik over processen strøm omfattende forberedelse, dataopsamlingsorganerne og dataanalyse trin.
1. Reagens Setup
BEMÆRK: Alle kemikalier skal håndteres med forsigtighed, og dermed en kittel, bør anvendes handsker og øjenbeskyttelse. Alle operationer skal udføres på et laboratorium hætte. Især bør særlige handsker i tilfælde af chloroform brug.
- Brug kemikalier med lavt vandindhold såsom tør chloroform hurtigt og opbevare tørt, men ikke længere end en uge. Opbevar begge kemikalier ved -20 ° C og under nitrogen eller argon gas fordi APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilan) (se tabel 1) og PEG (polyethylenglycol) er hygroskopiske og PEG er udsat for oxidering i luft.
- For at undgå hyppig eksponering af bestanden til atmosfærisk ilt og fugt, forberede mindre portioner, helst inden for et handskerummet system med en nitrogen atmosphere.
2. Opsætning af udstyr
BEMÆRK: For at undgå eventuel krydskontaminering, bruge friske og rene skibe for hvert trin.
- Rent glas og pincetter i rengøringsmiddel i 30 minutter i et ultralydsbad ved 60 ° C.
- Skyl og soniker udstyr fra trin 2.1 to gange grundigt med ultrarent vand.
- Heat udstyr fra trin 2.1 i RCA opløsning (ultrarent vand, hydrogenperoxid og ammoniak (5: 1: 1)) til 75 ° C i en ovn i 45 minutter og derefter skylle dem med ultrarent vand.
- Endelig tør glas og pincet under en strøm af tør nitrogen eller i en ovn (100 ° C, 3 timer).
3. Tip Funktionalisering
BEMÆRK: Brug en pincet, skibe mv fremstillet af rustfrit stål, PTFE, glas eller andet materiale, som er kemisk stabilt i organiske løsninger, hvis relevant. Medmindre andet er angivet, at udføre alle trin ved RT. Mængden af inkubation opløsning nødvendige, afhænger af antallet af cantilever chips. Sørg for, at cantilevere er nedsænket i de respektive løsninger på alle tid.
BEMÆRK: Brug en hætte for at undgå indånding af organiske dampe.
- Dannelse af OH-grupper på cantilever overflade ("aktivering") (ca. 0,5 timer):
- Brug en pincet til at placere friske cantilever chips (materiale: synd, fjederkonstant: 10-100 pN / nm) på et rent objektglas, og læg dem i et plasma kammer (100 W).
- Evakuer kammer (~ 0,1 mbar).
- Flood kammer med ilt gas og evakuere igen.
- Aktiver plasma-processen (power: 20%, varighed: 15 min, proces pres: 0,25 mbar).
- Amino-silanisering af støtteben (ca. 1 time):
- Klargør 2,5 ml APTES-opløsning (se tabel 1) i et glas petriskål - gøre dette ideelt under plasma-processen.
- Immediately efter plasma proces, dyppe hver cantilever i 1 sek i acetone og placere dem umiddelbart efter i APTES løsning.
- Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Skyl forsigtigt cantilever chips to gange i 10 ml acetone og en gang i 10 ml chloroform.
- Valgfri endelige trin: Sted cantilever chips fra foregående trin på en ren glasplade og bage dem i 30 minutter ved 70 ° C. Bemærk, at der også alternative strategier for overfladen aktivering, fx UV-behandling 12.
- PEGylering (ca. 2 timer):
BEMÆRK: Udfør trin 3.3.1-3.3.4 under amino-silanisering. NHS og maleimidgrupper er genstand for hydrolyse i vandige miljøer og PEG selv er genstand for oxidation i luft. Derfor timing (især i mellem trin) er en kritisk parameter. Der henvises til 13 for yderligere information.- Forbered chloroformopløsning (se tabel 1).
- For at undgå kondens, Varme PEG pulvere op til RT, før du åbner portionen og vejning af den passende mængde.
- Til kobling af polymerer eller lipider med aminogrupper, separat løse NHS-PEG-NHS (6 kDa) og methyl-PEG-NHS (5 kDa) i chloroformopløsning ved hvirvelbehandling dem, indtil de er fuldstændig løst. Se Tabel 1 for koncentrationer.
- Alternativt. til kobling af polymerer med thiolgrupper separat løse Mal-NHS- PEG og methyl-PEG-NHS i chloroformopløsning.
- Bland løsninger som påkrævet for at justere en række forhold mellem NHS- eller maleimide- og methyl--termineret PEG-molekyler (typisk 1: 500). Bemærk, at det ideelle forhold skal bestemmes iterativt i en serie af præparat-eksperiment cyklusser.
- Inkuber cantilever chips i PEG-opløsningen i 1 time i en chloroform mættet atmosfære for at forhindre fordampning af chloroform.
- Probemolekyle konjugering(> 1 time):
BEMÆRK: I den følgende 3.4.1-3.4.3, er tre eksempler på den kovalente kobling af forskellige probemolekyler AFM spids beskrevet. For hvert molekyle protokollen skal justeres. Bemærk endvidere, at der i eksempel 1 og 3 NHS-kemi anvendes der i eksempel 2 thiolen funktionaliserede polymer PI- g-PS er koblet til PEG via maleimid-kemi. For detaljer se 14.- For poly (aminosyre) poly-D-tyrosin (40-100 kDa)
- Opløs polytyrosine konjugeret probemolekyle i 1 M NaOH. Juster koncentration til 1 mg / ml.
- Exchange NaOH for natriumboratpuffer (pH 8,1) under anvendelse af spin-afsaltningssøjler (7 kDa MWCO) umiddelbart før funktionalisering
- Skyl cantilevere først med 5 ml chloroform og derefter med 5 ml ethanol og endelig med 5 ml boratpuffer.
- Inkubér cantilever chips i 1 time i polytyrosine boratpufferopløsning og derefter skylles med boratbufferog ultrarent vand. Opbevar i ultrarent vand, indtil målingen.
- For polymerer med en lineær rygrad (polyisopren, 119 kDa), der har podede sidekæder (polystyren, 88 kDa) 14
- Opløs PI- g-PS i tør chloroform. Juster koncentrationen af konjugation løsning på 4 mg / ml.
- Skyl støtteben med 5 ml chloroform og inkuberes i mindst 1 time i konjugation opløsning.
- Skyl igen i 5 ml chloroform og opbevares i chloroform i en chloroform-mættet miljø (for at forhindre chloroform fordampning), indtil målingen.
- For lipid POPE
- Opløs POPE i tør chloroform. Justér koncentrationen til 20 mM.
- Skyl støtteben med 5 ml ethanol og 5 ml ultrarent vand før inkubering af støtteben i 1 time i lipidopløsningen.
- Efter inkubation skylles støtteben med 5 ml chloroform, 5 ml ethanol og 5 ml varmt, ultrarent vand (i denne rækkefølge) for at fjerne ubundne probemolekyler og at slippe af med chloroform rester. Brug funktionaliserede tips straks. Alternativt gemme dem i chloroform indtil de skal bruges.
- For poly (aminosyre) poly-D-tyrosin (40-100 kDa)
Figur 1. (A) Skematisk viser spidsen funktionalisering processen i eksemplet med NHS kemi. (B) Kemisk binding ansat til at vedhæfte en probemolekyle til spidsen via en aminogruppe. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
4. Forbehandling
- Self-samlet monolag (SAM)
BEMÆRK: Som overflade for det første eksempel blev en selv-samlet monolag valgt. Se litteratur 15 - Rene objektglas med rengøringsmiddel og derefter to gange i ultrarent vand i et ultrasonisk bad i 30 minutter hver. Derefter, som et yderligere rensningstrin, placere dem i RCA opløsning (se trin 2.3) ved 75 ° C i 15 min.
- Coat dias med 10 nm krom nikkel og 100 nm guld i et vakuum coater. Derefter opbevares i køleskabet og ren igen i RCA løsning direkte forud for det næste skridt.
- Glassene inkuberes i det foregående trin i 2 mM 1-dodecanthiol / ethanol-opløsning i 12 timer. De thiolgrupper binder til guldoverfladen og en hydrofob monolag selv samler. Skyl dias med ethanol og ultrarent vand og derefter tørre af en strøm af nitrogen gas. Bekræft hydrofobiciteten af den forberedte overflade med statiske kontaktvinkelmålinger i et goniometer med et CCD-kamera 10.
BEMÆRK: Som en overflade for det andet eksempel blev en hydrogen afsluttes diamant valgt. Forbehandlingen blev udført som beskrevet tidligere 16.
BEMÆRK: I det sidste eksempel, blev en overflade understøttet lipiddobbeltlag (SLB), der anvendes som en overflade. For at opnå en sådan overflade, blev en opløsning (0,1 mg / ml) af store unilamellare vesikler (LUVer) bestående af phospholipidet POPC dannet ved ekstrudering metode. Derefter 50 pi af LUV opløsning blev sat på en frisk spaltet glimmer ark (A = 1 cm) og inkuberet i 30 min. Endelig blev opløsningen skyllet med 20 ml ultrarent vand. Se 17,18 for en detaljeret beskrivelse af fremstillingen af SLBs.
5. Data Acquisition
BEMÆRK: forsøgene, bruge en AFM, som giver mulighed for at måle på væsker. Datafangstsystemet og dataanalyse procedurer gælder, uanset AFM anvendte model. I nogle forsøg er det fordelagtigt at have mulighed for at styre temperature i væsken celle. Cantilever udbøjning blev fundet via laserstrålen afbøjning metode 19. Spring konstanter blev bestemt med den termiske støj metode 20.
- Indsæt den funktionaliserede cantilever i en AFM cantilever holder, der er egnet til måling i væsker.
- Sæt overfladen (forberedelse se ovenfor), der skal udtages i AFM og dække det med væske. Begge bør cantilever og overflade nu blive nedsænket i væsken med cantilever spidsen pegende mod overfladen. Bemærk, at en dråbe af væske i mange tilfælde er nok. Under alle omstændigheder fordampning af væsken, bør undgås, fx ved hjælp af en lukket flydende celle.
- Eventuelt regulere ønskede temperatur på controlleren.
- Lad systemet i ligevægt i mindst en halv time.
- Optag en termisk støj spektrum af udliggeren med cantilever langt væk fra overfladen for at udelukke enhver overflade dæmpning virkninger. Bemærk, at sædvanligvis 10 eller flere spektre skal akkumuleret for at opnå en tilstrækkelig signal-til-støj-forholdet.
- Approach overfladen. Bemærk, at den fremgangsmåde processen for at bevare spidsen geometri og tip funktionalisering skal udføres omhyggeligt. Dette kan opnås ved for eksempel nærmer sig i periodisk kontakt mode.
- Bestem den inverse optiske løftestang følsomhed (InvOLS) målt i nm / volt. Gør dette ved at trykke på cantilever spids mod en hård overflade.
- Bestem InvOLS ved at måle hældningen af piezo rejseafstand vs. ændringen i fotodioden spænding. Tilpas en linje til den del af kraft-afstand-kurven, hvor cantilever spids er i kontakt med overfladen. I forsøg med en blød overflade som lipiddobbeltlagene udføre dette trin på områder, som ikke er dækket med et lipiddobbeltlag (»defekt spots ').
- Bestem fjederkonstanten (PN / nm) ved montering af en harmonisk oscillator til den termiske støj spektrum. Brugautomatiseret software-funktion til fjederkonstant bestemmelse; ellers kontakt litteratur 20.
- Start eksperimentet.
- Optag talrige kraft afstande kurver for hver eksperimentel betingelse. Typisk skal du bruge følgende værdier for de eksperimentelle parametre: samplingfrekvens på 5 kHz, tip hastighed på 1 um / sek, trække afstand af 1 um.
BEMÆRK: Nogle gange, afhængigt af dynamikken i den undersøgte eksperiment, kan det være nødvendigt at vente en vis tid med spidsen i kontakt med overfladen ("opholdstid").
BEMÆRK: Forsøget specifikke parametre kan afvige væsentligt fra værdierne ovenfor. - Under langsigtede målinger, nul laser position på fotodiode fra tid til anden ved at flytte den fotodiode.
- Valgfrit: Efter hver kraft kurve, flyt AFM-tip til et andet XY position.
- Ved afslutningen af forsøget, bestemmer følsomheden og fjederen constant igen for at kontrollere konsistens og systemets stabilitet.
BEMÆRK: Sammenligning af fjederkonstanten og følsomhed før og efter forsøget er også et middel til at sikre, at systemets egenskaber og egenskaberne af spidsen forblev uændret i løbet af eksperimentet. Hvis forskellen på forårets konstanter ikke er for stor (<= 15%), kan de i gennemsnit, da den iboende usikkerhed af fjederkonstant beslutsomhed er også omkring 15%. For større forskelle, er det tilrådeligt at først finde og fjerne årsagen til skiftende tilsyneladende fjederkonstant, før du fortsætter med yderligere eksperimenter.
- Optag talrige kraft afstande kurver for hver eksperimentel betingelse. Typisk skal du bruge følgende værdier for de eksperimentelle parametre: samplingfrekvens på 5 kHz, tip hastighed på 1 um / sek, trække afstand af 1 um.
6. data Forberedelse
BEMÆRK: I dette afsnit generelle forberedelse af data trin, der typisk foretaget uafhængigt af den specifikke type eksperiment til at konvertere enheder til at Newton og nanometer samt at korrigere data er beskrevet. Eksperimentet specifikke data analyser er briefly beskrevet yderligere nedenfor i de respektive repræsentativt eksempel sektion.
- Typisk udføre alle forberedelse af data og analyse trin automatisk af en hjemmelavet skriftlig algoritme, fx baseret på software IGOR Pro 6.
- Konverter rå afbøjning signal (Defl) [V] i kraft ved at gange den med InvOLS [nm / V] og fjederkonstanten [NN / nm].
- Offset kraften på en sådan måde, at kraften på udliggeren i tilstrækkelig afstand fra overfladen (losses cantilever) bliver 0 nN.
- Beregne den faktiske spids position (også kaldet separation målt i forhold til overfladen) z *, der tager bøjning af cantilever i betragtning:
- Offset z * på en sådan måde, at z * = 0 svarer til Z-position af overfladen.
BEMÆRK: Her F er den kraft, der virker på spidsen og dermed bøjes udliggeren (bestemt i trin 6.2.), z er den målte Z-sensor position (direkte givet af instrumentet), og k betegner fjederkonstanten (bestemt i trin 5.8).
Figur 2. Proces rutediagram, der viser prøveforberedelse, erhvervelse af oplysninger og analyse af data. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det følgende er resultaterne for det ovenfor beskrevne eksempel molekyler, nemlig polymerer poly (aminosyre) polytyrosine, graftpolymeren PI- g-PS og phospholipidet POPE, præsenteres. Først for hvert eksempel, eksperimentere specifikke oplysninger om erhvervelse af data og udarbejdelse af data til rådighed. Derefter er de eksemplariske resultater for eksperimenter, hvor disse molekyler blev desorberet fra forskellige overflader (CH3 -SAMs, brint termineret diamant og lipiddobbeltlagene) vist. Indføres Bestemmelse af adhæsionskraften, vedhæftning længde og den frie energi.
Eksempel 1: desorption af polytyrosine fra self-samlet monolag
Desorption af polytyrosine fra en hydrofob SAM i forskellige opløsninger med et varierende indhold af ethanol blev målt. I hver opløsning af cantilever InvOLS og foråret konstanter blev bestemt som beskrevet ovenfor, og mindst 300 kraft distance spor blev registreret for hver opløsning. Alle eksperimenter i en eksperimentel opstilling blev udført med en enkelt cantilever på en enkelt dag for at sikre, at en og samme indre poly (aminosyre) blev målt. Udvidelsen / tilbagetrækning hastighed af cantilever var 0,5 um / sek og dvæletiden på overfladen var 1 sek. Sporene kraft distance viste plateauer af konstant kraft. Hver plateau blev udstyret med en S-formet kurve, og plateau kraft samt plateau længde blev bestemt og afbildet i et histogram. Histogrammerne blev udstyret med en Gauss og spidsværdien samt standard variation (fejl) af distributionen blev ekstraheret. Indtil slutningen af den kraft, plateau, systemet er i ligevægt, og området under plateauet lig derfor fri energi pr polymer længde. Kun løsrivelse proces ved udløbet af plateauet er i ikke-ligevægt. På grund af dette, for typiske eksperimenter plateau længde er længere end equilibri um længde (ca. 30%) og området under sigmoidal passer en øvre estimat for vedhæftning fri energi 21.
Figur 3. (A) Kraft afstand spor (tilbagetrækning) af polytyrosine på en methyl-SAM i rent vand (vist med rødt). Kun et enkelt molekyle desorberer som det kan ses i enkelt trin dråbe af kraft til baseline (nul kraft). Den sigmoidal pasform vises i sort og den udvundne plateau længde og plateau kraft er angivet med pile. (B) Histogrammer af det ekstraherede plateau kraft til måling i rent vand og i vand / ethanol blandinger med forskellige molære ethanolindhold. (C) Plateau længde histogrammer af den samme eksperimentelle sæt. (D) Peak plateau længde vs. peak plateau kraft. "456 / 52456fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3A viser en enkelt kraft afstand spor af polytyrosine målt i rent vand. Plateau kraft og plateau længde udvindes. Hvis der kun er et molekyle på spidsen, der er desorberet fra SAM, plateauet længde histogram viser en smal og monomodal fordeling (typisk i forsøg standardafvigelsen i en gauss fit af længden histogram er omkring 5-20 nm). Omvendt hvis der er kun én smal top i plateau længde histogram, man kan være relativt sikker på, at hele forsøgsopstillingen blev gjort med en og samme polymer. Grunden til dette er, at polytyrosines er meget polydispersive i størrelse (50 til 100 kDa). Derfor to polymerer af nøjagtig samme længde er meget usandsynlig. Tilsætning af ethanol svækker hydrofobe interaktion mellem polytyrosine og overfladen 10,22 ogfører til en lavere adsorption fri energi og dermed til en lavere plateau kraft som det kan ses i plateau kraft histogrammer for de forskellige opløsningsmiddelbetingelser vist i figur 3B. Nu kan det undersøges, hvordan plateauet længden af en enkelt polytyrosine skifter til forskellige adsorption gratis energier. Som det kan ses i figur 3C plateauet længde aftager med tilsætning af ethanol. Samtidig Plateau aftager (figur 3D).
For at opnå alle relevante parametre for desorptionsprocessen nemlig kontur længde, den Kuhn længde, adsorptionen fri energi og den iboende monomere desorption sats, må man kombinere de ovenfor beskrevne målinger med konstant afstand eksperimenter. For detaljer se 21.
Eksempel 2: Desorption af graftpolymeren PI- g-PS fra en hydrofob diamant
I figur 4A 4B typiske kraft afstande kurver opnået med PI- g-PS på hydrogeneret diamant i vand ved stuetemperatur er vist. Opholdstiden på overfladen var 1 sek og hastigheden af cantilever var 1 um / sek. Enten plateauer af konstant kraft (figur 4A) eller brud hændelser blev observeret (figur 4B). For plateauer af konstant kraft, blev højden af plateauer bestemmes med en sigmoidal pasform og værdierne blev afbildet på et histogram (figur 4C). For at udelukke uspecifik vedhæftning peak forårsaget af direkte interaktion af spidsen med overfladen (første top i kraft-afstand-kurven i figur 4B), blev den maksimale kraft i en vis afstand fra overfladen bestemmes. De opnåede værdier for disse ruptur begivenheder blev derefter afbildet i et histogram (figur 4D). For yderligere analyse histogrammerne blev udstyret med en Gauss og den maksimale højde blev valgt som en gennemsnitlig værdi for dendatapunkt. Med denne form for eksperiment indflydelse af tilstedeværelsen af sidekæder og deres arkitektur blev undersøgt 14.
Figur 4. Kraft afstande opløft- kurver udføres med en lineær polyisopren rygrad podet med polystyren sidekæder (PI- g-PS). Enten plateauer med konstant kraft (A) eller brud hændelser (B) overholdes. For plateauer med konstant kraft, er højden af plateauer bestemt med en S-formet pasform og plottet i et histogram (C) for ruptur begivenheder, er den maksimale brud kraft bestemmes (D). Klik her for at se en større udgave af dette figur.
Eksempel 3: Ekstraktion af et enkelt phospholipid (POPE) fra et lipiddobbeltlag
Figur 5A viser en skematisk fremstilling af enkelt molekyle ekstraktionsprocessen. Ekstraktion blev udført ved vertikalt nærmer POPE-funktionaliserede AFM spids mod understøttede lipiddobbeltlag (ikke vist). Ved kontakt af spidsen med POPC dobbeltlag, er en lille kraft (~ 100 PN) holdes konstant ved en tilbagekoblingssløjfe til omkring 4 sek. Hvis POPE-molekylet indsættes i dobbeltlaget i denne opholdstid er det trukket ud eller "ekstraheret 'fra dobbeltlaget ved tilbagetrækning af AFM tip fra dobbeltlaget. Dette resulterer i karakteristiske kraft afstande kurver. Deres form er dybest set bestemt af den strækning elasticitet af PEG-linker, og kan monteres ved en wormlike kæde (WLC) model 23. En superposition af mere end 50 kurver er vist i figur 5B. Ægte enkelt molekyle begivenheder kan genkendes af enkelte toppede kraft histogrammer (figur 5C ong>). Bemærk, at for at opnå yderligere indsigt i størrelsen af visse molekylære parameter (fx den gennemsnitlige levetid for lipider i dobbeltlag), er det nødvendigt at foretage målinger med forskellige kraft lastning satser. For yderligere analyse af enkelt lipidekstraktion eksperimenter se 24.
Figur 5. (A) Skematisk til udvinding af et enkelt molekyle fra et lipiddobbeltlag. Bemærk, at lipid molekyle er kovalent koblet til spidsen. Derfor kan mange hundrede eller endda tusindvis af kraft-udvinding cykler udføres med et og samme molekyle. (B) overlejring af mere end 50 udvinding kurver 9. (C) Histogram af udvindingen kraftfordeling af den i (B) f.eks..jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| Step | Formål | Solut | Opløsningsmiddel | Typisk forhold eller koncentration |
| Silanisering | Opret aminogrupper på cantilever overflade | APTES (3-aminopropyl) tri-ethoxysilane (f.eks Vectabond ™) | tør acetone | 01:50 (v / v) - 1: 100 (v / v) |
| PEGylering | Giv cantilever overflade med amino eller thiol-reaktive grupper | NHS-PEG-NHS eller Mal-PEG-NHS | tør chloroform | 0,25-25 mM |
| PEGylering | Passivere cantilever overflade | methyl-PEG-NHS | tør chloroform | 25 mM |
| Konjugation af probemolekyle | Couple probe molekylet via en amino- eller thiolgruppe for bi-funktionelle PEG | probemolekyle (polymer, lipid, etc.) | tør chloroform eller boratpuffer | 0,1-10 mM |
Tabel 1. Løsninger behov for tippet funktionalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de seneste årtier er enkelt molekyle eksperimenter forudsat hidtil uset indsigt i molekylære mekanismer og viste sig at være en uvurderlig tilgang life science og videre. At opnå en god og meningsfulde statistikker fra SMFS eksperimenter, ideelt en og samme molekyle anvendes over hele forløbet af forsøget. I modsætning til forsøg med ensembler af molekyler, SMFS eksperimenter er i stand til at opdage sjældne begivenheder og skjulte molekylære tilstande. En anden fordel ved enkelt molekyle eksperimenter er, at de kan modelleres ved hjælp af molekylære simuleringer 24,25.
Cantilever funktionalisering ovenfor beskrevne protokol er en modificeret version af procedurer tidligere offentliggjorte 26 - 28. Efter aktivering og silanisering er AFM cantilever funktionaliseret med en blanding af to forskellige typer af polyethylen-glycol (PEG) -molekyler (linkermolekyler).
N- hydroxysuccinimid (NHS) gruppe (eller en thiolreaktiv maleimid gruppe), hvor senere probemolekylet konjugeres ("NHS-PEG", "Mal-PEG"). Se figur 1 for en skematisk afbildning af spidsen funktionalisering. Formålet med PEG er tredobbelt: det første passiverer spidsen overflade og derfor forhindrer uspecifik adsorption. For det andet, ved hjælp af en bestemt methyl-PEG / NHS-PEG-forholdet giver mulighed for justering af NHS-PEG-koncentration på spidsen overflade. Og for det tredje, det adskiller tip fra probemolekylet og derfor giver mulighed for kvantificering af interaktionen molekyle-overflade uden indblanding fra den direkte interaktion tip-overflade. Derefter probemolekylet er kovalent koblet til spidsen via NHS-PEG (eller Mal-PEG).
Denne protokol sikrer, at alle obligationer (*) i & #8220; kobling kæde "tip * OH * silan * PEG * probemolekyle er kovalente bindinger og derfor meget stærk. Dette vil til gengæld tillader, at én og samme probemolekyle måles over hele varigheden af eksperimentet. Dette er blevet eksemplificeret ovenfor i den repræsentative resultater, som viser ægte enkelt molekyle force spektroskopi.
Hvordan kan verificeres, at virkelig en enkelt molekyle måles? For enlige spor med plateauer med konstant kraft, en enkelt dråbe til grundlinjen er tilstrækkelig. Hvis mere end én polymer desorberes samtidig den kraft, falder til nul i flere diskrete trin, som hver polymer løsner på et andet punkt. Sværere er at beslutte, om det er hver gang den samme enkelt molekyle. Derfor fordelingen af udstationeringsprocedurer længder skal vurderes. En snæver fordeling med en enkelt top er en god indikation af, at en og samme enkelt molekyle blev probet i hver kraft-forlængelse spor. For enlige spor med RuptUre begivenheder overlejringen af alle spor er den bedste metode til at afgøre, om (en og samme) enkelt molekyle blev målt. Alternativt kan hver spor udstyres med en (WLC) model og derefter både vedholdenhed længde og brud længder på en defineret kraft kan plottes. Fordelingen af disse to parametre skal være smalle og enkelt toppet.
Afslutningsvis har en procedure til fastgørelse af en lang række af enkelte molekyler til AFM tips forberedelse blevet fremlagt. AFM lille spids (radius ~ 10 nm), dets laterale positionering kapaciteter og dens kraft følsomhed gør det til det ideelle værktøj til at studere vedhæftning egenskaber enkelte molekyler på biologiske og ikke-biologiske overflader i næsten enhver væske.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9%) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5%) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5 kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass Petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1,000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
- Scheuring, S., Sapra, K., Müller, D. Probing Single Membrane Proteins by Atomic Force Microscopy. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , 449-485 (2009).
- Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
- Magonov, S. N. Atomic Force Microscopy in Analysis of Polymers. Encyclopedia of Analytical Chemistry. , (2006).
- Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules. Nature Structural Biology. 6 (4), 346-349 (1999).
- Li, H., Linke, W. a, et al. Reverse engineering of the giant muscle protein titin. Nature. 418 (6901), 998-1002 (2002).
- Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D.
- Zhang, W., Zhang, X.
- Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory. Physical Review Letters. 94 (4), 048301 (2005).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction - The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid Ordered and Liquid Disordered Phases. Biophysical journal. 107 (5), (2014).
- Pirzer, T., Hugel, T. Adsorption mechanism of polypeptides and their location at hydrophobic interfaces. Chemphyschem. 10 (16), 2795-2799 (2009).
- Butt, H. -J., Cappella, B., Kappl, M. Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications. Surface Science Reports. 59 (1-6), 1-152 (2005).
- Nash, M. A., Gaub, H. E. Single-Molecule Adhesion of a Copolymer to Gold. ACS NANO. 6 (12), 10735-10742 (2012).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. New York. (1996).
- Kienle, S., et al. Effect of molecular architecture on single polymer adhesion. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (15), 4351-4357 (2014).
- Folkers, J. P., Laibinis, P. E., Whitesides, G. M. Self-assembled monolayers of alkanethiols on gold: comparisons of monolayers containing mixtures of short- and long-chain constituents with methyl and hydroxymethyl terminal groups. Langmuir. 8 (5), 1330-1341 (1995).
- Dankerl, M., et al. Diamond Transistor Array for Extracellular Recording From Electrogenic Cells. Advanced Functional Materials. 19 (18), 2915-2923 (2009).
- Leonenko, Z. V., Carnini, A., Cramb, D. T. Supported planar bilayer formation by vesicle fusion: the interaction of phospholipid vesicles with surfaces and the effect of gramicidin on bilayer properties using atomic force microscopy. Biochimica et biophysica acta. 1509 (1-2), 131-147 (2000).
- Stetter, F. W. S., Hugel, T. The Nanomechanical Properties of Lipid Membranes are Significantly Influenced by the Presence of Ethanol. Biophysical Journal. 104 (5), 1049-1055 (2013).
- Putman, C. A. J., De Grooth, B. G., Hulst, N. F., Greve, J. A detailed analysis of the optical beam deflection technique for use in atomic force microscopy. Journal of Applied Physics. 72 (1), 6-12 (1992).
- Hutter, J. L., Bechhoefer, J.
- Krysiak, S., Liese, S., Netz, R. R., Hugel, T. Peptide desorption kinetics from single molecule force spectroscopy studies. Journal of the American Chemical Society. 136 (2), 688-697 (2014).
- Li, I. T. S., Walker, G. C. Interfacial free energy governs single polystyrene chain collapse in water and aqueous solutions. Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6530-6540 (2010).
- Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).
- Stetter, F. W. S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases. Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).
- Horinek, D., et al. Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).
- Ebner, A., et al. Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy. Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).
- Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor. Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).
- Morfill, J., et al. Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy. Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).
