Abstract
Plant-baserede systemer betragtes som en værdifuld platform til produktion af rekombinante proteiner som følge af deres veldokumenterede muligheder for fleksibel og billig produktion af høj kvalitet, bioaktive produkter.
I denne undersøgelse sammenlignede vi ekspressionen af et target human rekombinant protein i traditionelle fermentorbetingelser baseret cellekulturer (bakterielle og insekter) med plante-baserede ekspressionssystemer, både forbigående og stabile.
For hver platform, vi beskrev opsætning, optimering og længden af fremstillingsprocessen, det endelige produkt, og udbytterne og vi vurderet foreløbige produktionsomkostninger, der er specifikke for det valgte mål rekombinant protein.
Samlet set vores resultater viser, at bakterier er uegnet til produktion af målproteinet grundet dens akkumulering i uopløselige inklusionslegemer. På den anden side, plante-baserede systemer er alsidige platforme that tillade produktionen af den valgte protein ved lavere omkostninger end Baculovirus / insektcelle-systemet. Især stabile transgene linier viste det højeste udbytte af slutproduktet og forbigående udtrykker planter den hurtigste procesudvikling. Dog kan ikke alle rekombinante proteiner gavn af plante-baserede systemer, men den bedste produktionsplatform skal bestemmes empirisk med en sag til sag-tilgang, som beskrevet her.
Protocol
1. Konstruktion af ekspressionsvektorer
- Kommerciel rekombination kloning systemet:
- Amplificere fuld-længde sekvens af målgenet (hGAD65mut) med passende primere tillader tilsætning af en CACC klemme i 5'-enden af genet som tidligere beskrevet 2.
- Klone geloprenset amplifikationsprodukt ifølge de retningsbestemte kloning kit specifikationer, posten vektor (topoisomerase bundet) ved at samle reaktionen i et samlet volumen på 6 pi, ved anvendelse af en 1,5: 1 molforhold insert: vektor og 1 pi saltopløsning (0,2 M NaCl og 0,01 MgCl2). Inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Omdan hele reaktion i kemisk kompetente E. coli-celler ifølge retningsbestemte kloning kit specifikationer og skærmen opnåede kolonier ved koloni-PCR 3 under anvendelse af M13 frem og reverse primere indeholdt i retningsbestemt kloning kit. Isoler plasmid fra en posomt koloni efter plasmid-DNA forberedelse kit specifikationer og sekvens indlægget med M13 frem og reverse primere for at sikre fravær af mutationer 3.
- Brug det opnåede posten klon til at udføre rekombinationsreaktionen af Lambda rekombinasen Clonase II Enzyme (LR) med specifikke destination vektorer: for rekombinant protein ekspression i bakterieceller med pDEST17 (hvilket gav pDEST17.G65mut), i planter (forbigående eller stabile) med pK7WG2 (hvilket gav pK7WG2.G65mut), i Baculovirus / insektcelle-system med det lineariserede viral DNA (gav Baculo.G65mut) 4. Saml reaktionen ifølge CLONASE kit specifikationer, med 100 ng af post vektor, 150 ng destination vektor og 2 pi enzymblanding i et slutvolumen på 10 pi. Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 1 time.
- Transformer rekombination produktet i kemisk kompetente E. coli-celler ifølge CLONASE kit specifikationer. Screen opnåede kolonier ved PCR 3
- Isoler plasmid DNA under anvendelse af et kommercielt minipreparation DNA kit og bekræfte tilstedeværelsen af målsekvensen ved PCR 3 under anvendelse af de samme specifikke primerkombinationer beskrevet i det foregående trin.
- Brug de opnåede PCR-positive plasmider til at transformere forskellige målorganismer, afhængigt af den valgte til rekombinant proteinekspression som beskrevet i de følgende trin platform.
- MagnICON systemet 5-7:
- Klon målgenet i 3'-modul pICH31070, som tidligere beskrevet i detaljer 7, hvilket gav pICH31070.G65mut. Brugefter specifik reaktion cyklus: 30 min inkubation ved 37 ° C, 5 minutter ved 50 ° C og derefter 5 minutter ved 80 ° C.
2. Rekombinant Protein Expression
- Bakteriecelle systemet:
- Omdan pDEST17.G65mut ind i E. coli BL21 (DE3) elektrokompetente celler under anvendelse af standardteknikker og skærm kolonierne dyrket på ampicillin-holdige (100 pg / ml) LB-medium, ved koloni-PCR under anvendelse af følgende transgene-specifikke primere: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'og 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', med en annealingstemperatur på 58 ° C og en forlængelse på 20 sek. Udføre PCR-reaktionen i et totalt volumen på 20 pi efter opløsning bakterieceller med en plast spids i røret.
- Podes en enkelt koloni natten over ved 37 ° C i 3 ml ampicillin-holdige (100 pg / ml) LB-medium.
- Fortynd bakteriekulturen 1: 100 i 100 ml frisk LB-medium (herunder ampicilli), og der inkuberes ved 37 ° C i 1-6 timer, indtil en endelig OD 600 på 0,8.
- Fremkald rekombinant protein ekspression ved tilsætning af isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) til en slutkoncentration på 1 mM, og der inkuberes kulturen med kraftig omrystning i 3 timer ved 37 ° C.
- Saml cellerne ved centrifugering ved 4.000 xg i 20 minutter og anvende bakterielle pellet for protein ekstraktion (trin 3.1.1.1).
- Baculovirus / insektcelle-systemet:
- Seed Spodoptera frugiperda (Sf9) celler i 6-brønds plader (8 x 10 5 celler per brønd) og vaskes to gange med 2 ml af ikke-suppleret Grace Insect Medium.
- Fjern og udskift mellemlang dråbevist med transfektion blanding (5 pi LR rekombinant reaktion, 6 pi Celfectin løsning og 200 pi ikke-suppleret Graces Insect Medium).
- Pladerne inkuberes ved 27 ° C i 5 timer.
- Fjern og udskift transfektion blanding med 2 ml frisk SF-900 medium, suppleret med 10% føtalt bovint serum, 10 pg / ml gentamycin og 100 uM ganciclovir at vælge rekombinant baculovirus kloner.
- Efter inkubation i 96 timer ved 27 ° C, indsamle medium (V1 viral lager), centrifuger ved 4.000 xg for at fjerne celler og stort affald og butik i mørke ved 4 ° C.
- Seed 1 x 10 6 Sf9-celler per brønd i 2,5 ml Sf-900-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, 10 pg / ml gentamycin og 100 uM ganciclovir og inficeres med 100 pi V1 lager i hver brønd.
- Cellerne inkuberes i 3 dage ved 27 ° C.
- Saml og centrifugeres medium ved 4.000 x g.
- Opbevar supernatanten (V2 høj titer stock) ved 4 ° C.
- Seed 1 x 10 6 Sf9-celler per brønd i 2,5 ml Sf-900-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum, 10 pg / ml gentamycin og 100 uM ganciclovir og inficeres med 25 pi V2 lager i hver brønd.
- Cellerne inkuberes i 3 dage ved 27 ° C.
- Saml celler ved centrifugering ved 4000 xg og bruge insektcelle pellet for protein ekstraktion (trin 3.1.2. 1).
- Nicotiana benthamiana forbigående ekspressionssystemer:
- Grow N. benthamiana planter i et drivhus under naturligt lys i temperaturområdet 18-23 ° C. For agroinfektion bruge 4-5 uger gamle planter.
- Hold agroinfected planter i et klimakammer ved 22 ° C med en 13 timers dag / 11 timers nat fotoperiode.
- Kommerciel rekombination kloning systemet:
- Indførelse pK7WG2.G65mut i Agrobacterium tumefaciens-stamme EHA105 elektrokompetente celler som tidligere beskrevet 8 og screene kolonier dyrket på LB-medium indeholdende rifampicin (50 ug / ml), streptomycin (300 ug / ml) og spectinomycin (100 ug / ml) efter 2 dages inkubation ved 28 ° C, ved koloni-PCR 8 ved hjælp af følgende transgene-specifikke primere: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; og 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', med en annealingstemperatur på 58 ° C og en forlængelse på 50 sek. Udføre PCR-reaktionen i et totalt volumen på 20 pi.
- Podes bakterier i 30 ml LB-medium indeholdende rifampicin (50 ug / ml), streptomycin (300 ug / ml) og spectinomycin (100 ug / ml) i to dage ved 28 ° C.
- Saml bakterier ved centrifugering ved 4.000 xg i 20 minutter og resuspender pellet i 10 ml infiltration buffer (10 mM MES, 10 mM MgCl2, 100 pM acetosyringon, pH 5.6). Mål OD 600-værdi og derefter justere den til 0,9 ved fortynding i den samme buffer.
BEMÆRK: det samlede behov for at infiltrere tre N. volumen benthamiana planter er 30 ml. - Brug en 2,5 ml injektionssprøjte uden nål til at infiltrere Agrobacterium suspension i N. benthamiana blade. Forsigtigt og langsomt injicere blad paneler med suspensionen fra sprøjten. Infiltrere tre udvidet ltagudhæng per plante og bruge tre planter som triplikater.
BEMÆRK: for sundhed og sikkerhed slid øjenbeskyttelse under infiltration proces. - Saml agroinfiltrated blade 2 dage efter infektion (dpi) og fryse i flydende nitrogen. Store plantevæv ved -80 ° C.
- MagnICON systemet:
- Indfør de MagnICON vektorer - 5'modul (pICH20111), 3'-modulet (pICH31070.G65mut) og integrase modulet (pICH14011) - i A. tumefaciens GV3101 stammen anvendelse af standardteknikker. Screen kolonierne, dyrket på LB-medium indeholdende 50 ug / ml rifampicin og passende vektor-specifikke antibiotika (50 ug / ml carbenicillin for pICH20111 og pICH14011, 50 ug / ml kanamycin for pICH31070), ved koloni PCR med specifikke primere for hver vektor.
- Podes hver for de tre A. tumefaciens stammer i 5 ml LB-medium indeholdende 50 ug / ml rifampicin og passende vektor-specifikke antibiotikumog rystes natten over ved 28 ° C.
- Pellet natten bakteriekulturer ved centrifugering ved 4.000 xg i 20 minutter og resuspendere dem i to volumener af den oprindelige bakteriekultur af 10 mM MES (pH 5,5) og 10 mM MgSO4.
- Bland lige mængder bakteriesuspensioner indeholdende de tre vektorer og bruge suspension mix for sprøjte infiltration af N. benthamiana blade. Infiltrere tre udfoldede blade per plante.
- Saml agroinfiltrated blade på 4 dpi og fryse i flydende nitrogen.
- Store plantevæv ved -80 ° C.
- Nicotiana tabacum stabil ekspression systemet:
- Grow og vedligeholde in vitro kimplanter N. tabacum (var Sr1.) på fast plante dyrkningsmedium (4,4 g / L Murashige og Skoog - MS - medium, herunder vitaminer, 30 g / L saccharose, pH 5,8, 7 g / L plante agar) under kontrollerede forhold i klimakammer ved 25 ° C med 16 timer / 8 timers dag / niGHT regime.
- Start en præ-kultur af A. tumefaciens EHA105, der huser ekspressionsvektoren pK7WG2.G65mut i 5 ml flydende YEB medium med passende antibiotika (rifampicin 50 ug / ml, streptomycin 300 ug / ml spectinomycin 100 ug / ml) og vokser natten over ved 28 ° C i en orbitalryster sæt ved 200 rpm.
- Brug 1 ml forkultur til podning af en 50 ml Agrobacterium kultur i YEB medium plus antibiotika (rifampicin 50 ug / ml, streptomycin 300 ug / ml spectinomycin 100 ug / ml) og vokse i 24 timer, indtil bakteriekultur mættet (OD600 værdi på 0,5-1,0).
- Saml bakterier ved centrifugering ved 4.000 xg i 20 minutter og resuspender pellet i 50 ml flydende plante dyrkningsmedium. Gentag dette trin to gange helt at fjerne antibiotika.
- Tag første raske fuldt udfoldede blade fra in vitro tobaksplanter og skær dem i ca. 1 cm firkanter.
- Transfer bladstykkernedybe petriskåle indeholdende bakteriesuspension og forlade i mørke i 20 min.
- Fjern blade stykker fra suspension og tørres med sterilt filtrerpapir.
- Placer blad stykker med adaxial side (øverste blad overflade) på fast plante dyrkningsmedium indeholdende 1,0 ug / ml 6-benzylaminopurin (BAP) og 0,1 pg / ml naphthalen eddikesyre (NAA) og inkuberes plader til to dage i et klimakammer ved kontrolleret betingelser (25 ° C, 16 timer dag / 8 timer nat).
- Transfer bladstykkerne på fast dyrkningsmedium (herunder 1,0 ug / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500 ug / ml cefotaxim, 100 ug / ml kanamycin) med abaxial overflade (nedre overflade af blad) i kontakt med medium.
- Pladerne inkuberes i 2-3 uger i klimakammer ved 25 ° C med 16 timer / 8 timers dag / nat regime til at fremkalde skuddannelse. Subkultur hver 2. uge ved at overføre bladeksplantater til frisk solid plante dyrkningsmedium indeholdende 1,0 ug / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500ug / ml cefotaxim og 100 ug / ml kanamycin.
- Når skud vises overføre dem til Magenta kasser med fast dyrkningsmedium, herunder 500 ug / ml cefotaxim og 100 ug / ml kanamycin for at inducere roddannelse. Inkuber kimplanter med 16 timer dag / 8 timer nat lysperiode ved 25 ° C i 1-2 uger.
- Når rødder form, flytning planterne til jord i væksthuset.
- Saml et blad stykke for hvert anlæg og isolere genomisk DNA med et kommercielt kit.
- Detektere tilstedeværelsen af transgenet ved specifik PCR. Brug 30 ng af genomisk DNA som template for PCR-amplifikation ved anvendelse af de følgende transgene-specifikke primere: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'og 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', med en annealingstemperatur på 58 ° C og en forlængelse på 20 sek . Udføre PCR-reaktionen i et totalt volumen på 50 pi.
- Analyser 220 bp produkt ved elektroforese på 1% agarosegel i Tris-acetat-EDTA (TAE) puffer (40 mM Trer 20 mM eddikesyre, og 1 mM EDTA).
- Vælg transgene planter indeholdende målgenet.
- Saml et blad stykke fra hver af de udvalgte transgene plante og fryse i flydende nitrogen øjeblikkeligt.
- Forbered samlede proteinekstrakter af vegetabilsk bladvæv (trin 3.1.3) og teste hver prøve ved western blot-analyse som tidligere beskrevet 2 for at vælge den bedste rekombinante protein udtrykker tobaksplanten.
- Bag blomster af den valgte bedst ydende anlæg før blomstrende at forhindre krydsbestøvning.
- Efter blomstrende, frugtmodning og tørring frø, indsamle poser.
- Adskil frø fra bukkene og gemme dem i et tørt rum ved kontrolleret temperatur (20-24 ° C).
- Soen de tørrede frø til at producere anden generation transgene planter og efterfølgende vælge den bedste ydende anlæg til at være selvbestøvende.
- Gentag den samme procedure som beskrevet i trin 2.4.19-2.4.21 for efterfølgende generationer.
3. Rekombinante Protein Expression Analyser
- Total proteinekstraktion:
- Bakterieceller:
- Resuspender bakteriel cellepellet, opsamlet som beskrevet i trin 2.1.5, i halvdelen kulturen volumen Tris-bufret saltvand (TBS - 2 mM Tris / HCI, 500 mM NaCI), pH 7,4 suppleret med 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF).
- Lydbehandles resuspenderet cellepellet tre gange i 40 sekunder ved halv effekt, samtidig med at prøve på is.
- Afklare lysat ved centrifugering ved 14.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
- Overfør supernatanten til et rent rør og gemme både supernatanten og pelleten separat ved -80 ° C.
- Solubilisere inklusionslegemerne, indsamlet i pelleten i halv cellulære lysat volumen TBS pH 8,0 suppleret med 6 M urinstof ved kraftig rystning natten over ved stuetemperatur.
- Centrifugeres ved 10.000 xg i 25 min ved stuetemperatur og indsamle supernatanten i en renrør.
- Opbevar både supernatanten og pelleten ved -80 ° C.
- Insektceller:
- Vask inficeret insektcelle pellet, opsamlet som beskrevet i trin 2.2.12, med 1 ml phosphatbufret saltvand (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) pH 7,4.
- Resuspender celler i 200 pi lysisbuffer (20 mM Tris / HCI pH 8,0, 0,5 M NaCl, 3 mM β-mercaptoethanol og 1% Tween-20) og inkuber på is i 30 minutter.
- Centrifuge solubiliseret celler ved 14.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C.
- Saml opløselige fraktioner og opbevares ved -80 ° C og smid pillen.
- Plant blad væv:
- Grind N. benthamiana eller N. tabacum væv til fint pulver i flydende nitrogen under anvendelse af morter og støder.
- Homogeniseres 100 mg formalet væv i 300 pi ekstraktionsbuffer (40 mM Hepes pH 7,9, 5 mM DTT, 1,5% CHAPS), supplemented med 3 pi protease inhibitor cocktail og tø på is.
BEMÆRK: den valgte forhold mellem plantevæv vægt (g) til buffer volumen (ml) er 1: 3. - Centrifuge ekstrakt ved 30.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C.
- Saml supernatanten i et rent glas og opbevares ved -80 ° C.
- Bakterieceller:
- Coomassie gelfarvning:
- Laves en passende fortynding af den samlede proteinekstrakter (fx 2 pi planteekstrakt, 5 pi af bakterielle og insekt ekstrakter) til et slutvolumen på 10 pi ekstraktionspuffer og tilsættes 5 pi 3x prøvebuffer (1,5 M Tris / HCI pH 6,8, 3% SDS, 15% glycerol, 4% β-mercaptoethanol) til en endelig 1x koncentration.
- Kog prøverne i 10 min.
- Separate proteiner ved 10% SDS-PAGE.
- Efter elektroforese varme gel i nærvær af Coomassie opløsning A (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol, 10% eddikesyre) i en mikrobølgeovn til omkring to minutters indtil kogepunktet.
- Afkøl gel til stuetemperatur med forsigtig omrystning.
- Kassér Coomassie farveopløsning A.
- Affarvning gel ved opvarmning i nærvær af Coomassie opløsning B (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol), C (0,002% Brilliant Blue R-250, 10% eddikesyre) og D (10% eddikesyre), hver gang efter den samme protokol til farvning.
- Efter det sidste opvarmningstrin med løsning D, forlader gel affarvning till baggrunden er klar 9.
- Western blot-analyse:
- Efter elektroforese overføres separerede proteiner til en nitrocellulosemembran under anvendelse af standardteknikker og blok med 4% mælk i PBS pH 7,4 ved stuetemperatur i 1 time.
- Inkuberes blottet natten over ved 4 ° C eller i 4 timer ved stuetemperatur i den blokerende opløsning indeholdende kanin primære antistof rejst mod målproteinet ved 1: 10.000 og suppleret med 0,1% Tween-20.
- Efter primært antistof labelING vaskes membranen 3 gange i 5 minutter hver med blokerende opløsning indeholdende 0,1% Tween-20.
- Inkuber med peberrodsperoxidase (HRP) -conjugate anti-kanin-antistof på 1: 10.000 i 1,5 timer.
- Vask membranen 5 gange i 5 minutter hver med PBS-T (PBS suppleret med 0,1% Tween-20).
- Proces western blot under anvendelse af den kemiluminescerende peroxidasesubstrat.
- Radioimmunassay (RIA):
- Tillad reagenser (antiserum, sporstof og protein A Sepharose) til at nå stuetemperatur og pipette 20 pi proteinekstrakt prøver og standarder ved forskellige koncentrationer (fra 300-2,400 ng / ml kommerciel rekombinant hGAD65) i 12 x 75 mm polystyrenrør.
- Tilføj 20 pi antiserum, tilberedt fortynding 1:30 serum fra plasmaferese af en T1D patient.
- Der tilsættes 50 pi sporstof (125-I-GAD65) og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Sæt et rør med sporstof kun at estimere den samlede aktivitet.
- Der tilsættes 50 piprotein A Sepharose og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Dispenser 1 ml kold PBS-buffer i hvert rør og centrifugeres ved 1.500 xg ved 4 ° C i 30 minutter.
- Dekanteres rørene for at fjerne supernatanten og absorbere tilbageværende væske på trækpapir ved forsigtigt at banke røret.
- Mål immunpræcipiteret radioaktivitet i alle rør ved at tælle i 1 min i en gamma-tæller.
- Plot i log skala de bindende satser (B / T%) af kalibratorer relateret til den samlede aktivitet, at etablere standardkurven og læs GAD koncentrationen af prøver fra kalibreringskurven 10.
BEMÆRK: Begrænset områder bør være designet til opbevaring, håndtering og bortskaffelse af radioaktivt materiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En eksperimentel design til heterolog ekspression af et target rekombinant protein i forskellige produktionssystemer er beskrevet her. Den første var fokus opsætningen af de forskellige platforme ved at etablere de optimale betingelser for ekspression af målproteinet i hvert system.
Ekspressionen af målproteinet, hGAD65mut, blev induceret i tre eksemplarer E. coli kulturer. Efter 3 timer af ekspression ved 37 ° C, blev bakterieceller opsamlet ved centrifugering og lyseret ved sonikering. Efter centrifugering blev opløselige proteiner adskilt fra uopløselige inklusionslegemer og indledende analyser viste, at hGAD65mut akkumuleret prevalently i uopløselige inklusionslegemer (data ikke vist). Rekombinant protein solubilisering krævede anvendelse af urea 6 M, der interfererer med RIA-analyse for sine stærke denaturering egenskaber, gør det umuligt en ordentlig kvantificering af hGAD65mut. Adskillige strategier har væreOr rapporteret til at begrænse dannelsen af inklusionslegemer, der omfatter dyrkning af de mikrobielle celler ved lav temperatur 11. Kulturerne blev dyrket ved 15 ° C og 20 ° C, og rekombinant proteinekspression blev induceret ved de samme temperaturer. Som vist i figur 1A, solubilisering af hGAD65mut produceret ved begge temperaturer, igen kræver urinstof (baner S2). Således behøver lave temperaturer i dette eksperiment ikke forhindre hGAD65mut dannes uopløselige aggregater.
Baculovirus vektorer indeholdende hGAD65mut sekvensen (Baculo.G65mut) blev udtrykt i adhærente Sf9 cellekulturer. V1 og V2 høj titer lagrene blev fremstillet og de bedste resultater infektion betingelser var oprettet evaluere forskellige virale lagerbeholdninger 5-50 pi. Som vist i figur 1B, var den optimale viral stock volumen identificeret som 25 pi, hvilket gav 11,8 ± 0,8 ug af rekombinant protein pr ml dyrkningsmedium, som vurderet ved RIAanalyse (tabel 1).
Efter infiltration, tidsforløb analyse af agroinfected N. benthamiana blade blev gennemført i de to transiente ekspressionssystemer. For pK7WG2-baseret system, blev bladprøver samlet daglig i intervallet 1-5 dpi, blev de samlede opløselige proteiner (TSP) ekstraheret og lige mængder af TSP blev analyseret ved western blot (figur 1C). Denne analyse fremhæves, at den maksimale akkumulering af target rekombinant protein er nået 2 dpi. Derfor blev bladene høstet 2 dpi og proteinekstrakter blev analyseret ved RIA for at måle rekombinant protein akkumulering, hvilket viser et gennemsnit på 67,8 pg / g FLW (friske blade vægt, tabel 1). Rekombinant protein udtryk niveau ved hjælp af dette system kan forbedres yderligere, ved co-infiltrere bladene med en suppressor af posttranskriptionel gendæmpning (PTGS) ligesom P19 eller HC Pro 12.
Densamme tidsforløbet detektion blev udført med N. benthamiana blade agroinfected med MagnICON vektorer: inficerede blade blev indsamlet 1-8 dpi og lige store mængder af TSP blev analyseret ved Western blot. Denne analyse viste, at maksimale rekombinant protein akkumulering opnået 4 dpi (figur 1D) med en gennemsnitlig akkumulering af det rekombinante protein på 78,8 pg / g FLW (tabel 1), som vurderet ved hjælp af RIA.
Ekspressionen af hGAD65mut i transgene tobaksplanter er tidligere blevet rapporteret 12, viser, at rekombinante proteinniveauer varierede betydeligt blandt uafhængigt transformerede linier. Den bedste resultater hGAD65mut T1 transgen plante var selv krydses, og de afledte planter (T2) blev analyseret for at vælge igen de bedste resultater en. Denne procedure blev gentaget over flere generationer at udvikle en homogen produktionsplatform, kontrol af ydeevne i hver generation ved RIA, indtil der ikkeyderligere forbedring blev opnået (data ikke vist). I figur 1E er et repræsentativt Western blot af T5 transgene planter rapporteret, hvor homogenitet af rekombinant protein udbytter er indlysende. Som vist i figur 1F den gennemsnitlige hGAD65mut udbytte steg fra T2 til T6, nåede niveau på 99,1 pg / g FLW (tabel 1), og under udvælgelsesprocessen, standardafvigelsen af ekspressionsniveauet faldt.
Figur 1:. Platform opsætning Opsætning af bedste betingelser for hGAD65mut ekspression i hver platform. (A) E. coli inducerbar ekspression platform. Bakterieceller blev dyrket ved 15 ° C eller 20 ° C. Upper panel, Western blot af hGAD65mut i celleekstrakter (2 ug TSP per bane). Lower panel, loading kontrol farvet med Coomassie. n.C. = Negativ kontrol bakterieceller transformeret med pDEST17 vektoren indeholdende chloramphenicol-resistens-gen; T: Samlet prøver; S1: supernatanten efter lydbehandling og centrifugering; S2 og P: Supernatant (1) og pellet (2) efter centrifugering af prøven solubiliseres i urinstof-holdige buffer. (B) Baculovirus / insektcelle platform. Følgende virale lagerbeholdninger blev testet: 5, 25 og 50 pi Overpanel, western blot af hGAD65mut i celleekstrakter (5 ug TSP per bane) Nederste panel, lastning kontrol farvet med Coomassie... nc = negativ kontrol, ekstrakt af ikke-transformerede insektceller. (C) Transient ekspression i N. benthamiana anlæg, der anvender den pK7WG2 vektor. Prøver blev opsamlet dagligt, 1-5 dpi (bane 1-5). Øverste panel, Western blot af hGAD65mut i bladekstrakter (2,5 ug TSP per bane). Lavere panel, lastning kontrol farvet med Coomassie, hvor det store subunitaf Rubisco er indlysende. nc = negativ kontrol planter infiltreret med pK7WG2 vektor bærende GFP markørgenet. (D) Forbigående ekspression i N. benthamiana anlæg, der anvender MagnICON vektorer. Prøver blev opsamlet dagligt, 1-8 dpi (bane 1-8). Øverste panel, Western blot af hGAD65mut i bladekstrakter (5 ug TSP per bane). Lavere panel, lastning kontrol farvet med Coomassie hvor det store subunit af Rubisco er tydelig . nc = negativ kontrol, planter infiltreret kun med pICH20111 5'-modul og pICH14011 integrase-modul. Tal angiver molekylmasse markør i kDa. pc = positiv kontrol, 15 ng af kommercielle hGAD65 produceret i baculovirus / insektcelle-systemet. (E) Stabil ekspression i N. tabacum planter. Leaf prøver blev indsamlet fra forskellige T5 planter (bane 1-11). Overpanel, western blot af hGAD65mut i bladekstrakter (5 ug TSP per bane). Lavere panel, lastning kontrol farves wed Coomassie. nc = negativ kontrol, vildtype-planter. Tal angiver molekylmasse markør i kDa. pc = positiv kontrol, 15 ng af kommercielle hGAD65 produceret i baculovirus / insektcelle-systemet. (F) Stabil ekspression i N. tabacum planter. Boxplot repræsentation af hGAD65mut akkumulering over flere generationer, der stammer fra de bedste resultater hGAD65mut T1 transgen tobaksplanten rapporteret som pg / g FLW beregnet ud fra RIA-data. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
| System | [HGAD65mut] (ug / ml) | [HGAD65mut] |
| Baculo / insekt | 117,5 ± 7,7 | 11,8 ± 0,8 pg / ml dyrkningsmedium |
| Transient | 22,6 ± 0,9 | 67,8 ± 2,7 ug / g FLW |
| MagnICON | 26,3 ± 5,9 | 78,8 ± 17,8 pg / g FLW |
| Elite T6 | 33,0 ± 3,8 | 99,1 ± 11,3 pg / g FLW |
Tabel 1: hGAD65mut giver hGAD65mut udbytter i forskellige platforme - Fermenteringsprøver-baserede (Baculo / Insekt) og plantebaserede (pK7WG2- og MagnICON i N. benthamiana og elite T6 i N. tabacum). Anden kolonne - hGAD65mut koncentration i proteinekstrakter (ug / ml). Tredje kolonne - hGAD65mut indhold i friske blade vægt (ug / g FLW) for plantebaserede platforme og i cellekultur medium (pg / ml) for fermenter-baseret platform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse tre forskellige platforme blev sammenlignet for ekspression af et rekombinant humant protein: bakterieceller, Baculovirus / insektceller og planter. Anlægget-baseret platform blev yderligere udforsket ved at udnytte tre udbredte udtryk teknologier (dvs. forbigående - MagnICON og pK7WG2 baserede - og stabile). Målproteinet valgt til dette eksperiment, hGAD65mut, er tidligere blevet udtrykt i forskellige systemer 13 og produktionen og funktionalitet er let påviselige og målelige 14.
Bakterieceller var ikke en effektiv produktionsplatform fordi hGAD65mut dannet inklusionslegemer, selv ved lav temperatur vækstbetingelser, hvilket således kræver besværlig solubilisering og refoldning at nå sit native konformation. Det vigtigste svigt af denne platform til ekspression af komplekse rekombinante proteiner er den rigtige konformation af det endelige produkt.
DenBaculovirus / insektcelle platform medieret en høj ekspression af immunoreaktive rekombinante protein, men den vigtigste begrænsning af denne ekspressionssystem er de høje omkostninger af dyrkningsmediet, der kræves for at vokse insektceller. Det blev anslået, at de samlede produktionsomkostninger for 1 g hGAD65mut kunne nå € 700 i denne produktionsplatform (overvejer 9 L insekt celledyrkningsmedier påkrævet). En yderligere begrænsning af dette udtryk platform er behovet for sterile dyrkningen af insektceller, som kræver personale med aseptiske manipulation færdigheder. For at sikre en effektiv rekombinant protein ophobning to kritiske parametre skal kontrolleres omhyggeligt i denne ekspressionssystem: de virale lager til at inficere celler volumen og timingen af virusinfektion. Endvidere detergent, der anvendes til totalt opløseligt protein ekstraktion fra Sf9-insektceller, drastisk indflydelse rekombinant protein solubilisering.
Plant-baserede systemer var den mest gavnlige plarm at udtrykke hGAD65mut: planten-made rekombinant protein var immunreaktiv og akkumuleret i høje niveauer i bladvæv. Sammenligning af forskellige plante-baserede ekspressionssystemer blev de højeste udbytter opnået i stabile transformerede tobaksplanter (tabel 1) og, hvis overvejer den samlede biomasse af tobak sammenlignet med N. benthamiana, der anvendes til forbigående ekspression, er tydeligt den generelt højere produktivitet af tobak. Men den væsentligste begrænsning af stabile transformerede tobaksplante-baserede platform er den tid, der kræves til opsætning af systemet, som i vores undersøgelse tog 20 måneder. Faktisk bør vælges en homozygot linje for rekombinant protein ekspression homogenitet og det kan kræve gentagne selvstændige cross serier, startende fra det højeste T1 udtrykkende linjer. Især når den valgte T1 bærer mere end en kopi af den transgene træk, kan avlsprogram tage op til 3 år.
Transiente ekspressionssystemer tilbudtfordel af en hurtig opskalering på grund af en kort interval mellem transformation og udtryk og opsætning af udtrykket platform krævede 4 dage. , En begrænsning af de plantebaserede transiente systemer er, at deres automatisering er næppe gennemførlig på en lab-skala med mindre dedikerede high-grade udstyr til agro-infiltration bruges. Derfor kan en korrekt beregning af storstilet produktion af hGAD65 hjælp transiente systemer ikke udføres her. På den anden side, vi spekulere, at de samlede produktionsomkostninger for 1 g af rekombinant protein ved hjælp T6 stabil tobak linje kan beregnes på under 5 euro (overvejer jord til dyrkning 60 tobaksplanter). For at sikre en effektiv agroinfiltration og proteinproduktion flere kritiske parametre omhyggeligt bør kontrolleres (plante udviklingsstadiet, vokse og infiltration tilstand Agrobacterium), som tidligere rapporteret 15. Desuden er der for hvert udtryk eksperimentere et bestemt tidspunkt-kursus analyse bør væreudføres for at vælge den DPI, der tillader den højeste akkumulering af det rekombinante protein.
Eksemplet diskuteret her kan betragtes som en proof-of-principle casestudie, der sætter fokus på nogle af de konkrete fordele ved plante-baseret produktion i forhold til traditionelle systemer. Især kan tobak transgene linier homogent udtrykker det rekombinante protein betragtes som en værdifuld platform for masseproduktion af rekombinante proteiner, som er nødvendige i store mængder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | |
| Sf-900 II SFM medium | Gibco | 10902-088 | |
| Grace’s Insect Medium, unsupplemented | Gibco | 11595-030 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | 10362-100 | |
| MS medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Plant agar | Duchefa Biochemie | P1001 | |
| Ampicillin sodium | Duchefa Biochemie | A0104 | Toxic |
| Gentamycin sulphate | Duchefa Biochemie | G0124 | Toxic |
| Ganciclovir | Invitrogen | I2562-023 | |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO |
| Streptomycin sulfate | Duchefa Biochemie | S0148 | Toxic |
| Spectinomycin dihydrochloride | Duchefa Biochemie | S0188 | |
| IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) | Sigma | I5502 | Toxic |
| MES hydrate | Sigma | M8250 | |
| MgCl2 | Biochemical | 436994U | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Syringe (1 ml) | Terumo | ||
| MgSO4 | Fluka | 63136 | |
| BAP (6-Benzylaminopurine) | Sigma | B3408 | Toxic |
| NAA (Naphtalene acetic acid) | Duchefa Biochemie | N0903 | Irritant |
| Cefotaxime | Mylan Generics | ||
| Trizma base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| NaCl | Sigma | S3014 | 1 M stock |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) | Sigma | P7626 | Corrosive, toxic |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma | P5927 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma | D0632 | Toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
| CHAPS | Duchefa Biochemie | C1374 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | Do not freeze/thaw too many times |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flammable, toxic, corrosive – 10% stock |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flammable |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 | Sigma | G5163 | Do not freeze/thaw too many times |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| Sf9 Cells | Life Technologies | 11496 | |
| BL21 Competent E. coli | New England Biolabs | C2530H | |
| Protein A Sepharose | Sigma | P2545 | |
| Cell culture plates | Sigma | CLS3516 | |
| Radio Immuno Assay kit | Techno Genetics | 12650805 | Radioactive material |
References
- Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
- Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).
- Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
- Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).
- Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419 (2014).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).
- Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).
