Abstract
Plantaardige systemen worden beschouwd als een waardevol platform voor de productie van recombinante eiwitten ten gevolge van hun goed gedocumenteerde potentieel voor de flexibele, goedkope productie van hoogwaardige biologisch actieve producten.
In deze studie hebben we de expressie van een doelwit menselijk recombinant eiwit in traditionele fermentatie gebaseerde celkweken (bacteriën en insecten) met plantaardige expressiesystemen, zowel transiënte en stabiele.
Voor elk platform, beschrijven we de opzet optimalisatie en lengte van het productieproces kan de uiteindelijke kwaliteit van het product en de opbrengst en we voorlopig productiekosten, specifiek voor het gekozen doelwit recombinante eiwit geëvalueerd.
Kortom, onze resultaten aan dat bacteriën niet voor de bereiding van het doeleiwit door de ophoping ervan in onoplosbare inclusielichamen. Anderzijds, plantaardige systemen zijn veelzijdig platforms thoed kan de productie van het geselecteerde eiwit tegen lagere kosten dan baculovirus / insectencel-systeem. Vooral stabiele transgene lijnen toonde de hoogste opbrengst van het eindproduct en voorbijgaande expressie planten de snelste procesontwikkeling. Kunnen echter niet alle recombinante eiwitten profiteren van plantaardige systemen, maar de beste productie platform moet empirisch worden bepaald met een case-by-case benadering, zoals hier beschreven.
Protocol
1. Bouw van Expression Vectoren
- Commerciële recombinatie kloneringssysteem:
- Versterken van de volledige lengte sequentie van het doelwitgen (hGAD65mut) met geschikte primers waarbij toevoeging van een CACC klem aan het 5'-uiteinde van het gen zoals eerder beschreven 2.
- Kloon de gel-gezuiverde amplificatieproduct volgens de gerichte klonering kit specificaties in de vermelding vector (topoisomerase gebonden) door het samenvoegen van de reactie in een totaal volume van 6 pl, met een 1,5: 1 molverhouding insert: vector en 1 pi zoutoplossing (0,2 M NaCl en 0,01 MgCl2). Incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur (RT).
- Transformeer de gehele reactie in chemisch competente E. coli cellen volgens gerichte klonering kit specificaties en scherm verkregen kolonies door kolonie PCR 3, met M13 forward en reverse primers in de gerichte klonering kit. Isoleer het plasmide uit een positief kolonie volgens plasmide-DNA voorbereidingskit specificaties Type de insertie met M13 forward en reverse primers voor de afwezigheid van mutaties 3 te garanderen.
- Gebruik de verkregen toegang kloon aan de recombinatie reactie uit te voeren door de Lambda Recombinase Clonase II Enzyme (LR) met specifieke bestemming vectoren: voor recombinant eiwit expressie in bacteriële cellen met pDEST17 (opbrengst pDEST17.G65mut), in planten (voorbijgaande of stabiel) met pK7WG2 (opbrengst pK7WG2.G65mut), in met Baculovirus / insectencel-systeem met de gelineariseerde viraal DNA (hetgeen Baculo.G65mut) 4. Monteer de reactie volgens clonase kit specificaties, met 100 ng van vector binnenkomst, 150 ng bestemmingsvector en 2 pl enzymmengsel in een eindvolume van 10 pl. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Transformeer de recombinatie product in chemisch competente E. coli cellen volgens clonase set specificaties. Scherm verkregen kolonies door PCR 3
- Isoleer plasmide-DNA met een commercieel minipreparation DNA kit en bevestigen de aanwezigheid van de targetsequentie door PCR 3, met dezelfde specifieke primer combinaties in de voorgaande stap beschreven.
- Met de verkregen PCR-positieve plasmiden verschillende doelorganismen transformeren, afhankelijk van de gekozen recombinante eiwitexpressie zoals beschreven in de volgende stappen platform.
- MagnICON systeem 5-7:
- Kloon het doelgen in de 3'-module pICH31070, zoals eerder in detail 7, waarbij pICH31070.G65mut. Gebruik devolgende specifieke reactie cyclus: 30 min incubatie bij 37 ° C, 5 min bij 50 ° C en daarna 5 minuten bij 80 ° C.
2. Recombinante eiwitexpressie
- Bacteriële cel-systeem:
- Transformeren pDEST17.G65mut in E. coli BL21 (DE3) elektrocompetente cellen onder toepassing van standaardtechnieken en screenen de kolonies gegroeid op ampicilline-bevattende (100 ug / ml) LB-medium met kolonie-PCR met de volgende transgen-specifieke primers: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'en 5' -CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', met een hybridisatietemperatuur van 58 ° C en een rek van 20 sec. Voer de PCR-reactie in een totaal volume van 20 gl na oplossen bacteriële cellen met een plastic tip in de buis.
- Inoculeer een enkele kolonie gedurende de nacht bij 37 ° C in 3 ml ampicilline bevatten (100 ug / ml) LB-medium.
- Verdun de bacteriekweek 1: 100 in 100 ml vers LB-medium (inclusief ampicillin) en incubeer bij 37 ° C gedurende 1-6 uur totdat een uiteindelijke OD600 van 0,8.
- Laten recombinant eiwit expressie door toevoeging van isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) tot een eindconcentratie van 1 mM en incubeer cultuur onder krachtig schudden gedurende 3 uur bij 37 ° C.
- Verzamel cellen door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 20 minuten en gebruik bacteriële pellet voor eiwitextractie (stap 3.1.1.1).
- Baculovirus / insectencelsysteem:
- Zaad Spodoptera frugiperda (Sf9) cellen in 6-well platen (8 x 10 5 cellen per putje) en tweemaal wassen met 2 ml van niet-aangevuld Grace's Insect Medium.
- Verwijder en vervang het medium druppelsgewijs met transfectie mengsel (5 ul LR recombinant reactie, 6 pl Celfectin oplossing en 200 ul niet-aangevuld Grace's Insect Medium).
- Incubeer de platen bij 27 ° C gedurende 5 uur.
- Verwijder en vervang transfectie mengsel met 2 ml verse Sf-900 medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml gentamycine en 100 uM ganciclovir recombinant Baculovirus klonen selecteren.
- Na incubatie gedurende 96 uur bij 27 ° C, verzamel medium (V1 virale stock), centrifugeer bij 4000 xg cellen en grof vuil en slaan verwijderen in het donker bij 4 ° C.
- Zaad 1 x 10 6 Sf9 cellen per putje in 2,5 ml Sf-900 medium bevattende 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml gentamycine en 100 uM ganciclovir infecteren met 100 ui V1 voorraad in elke put.
- Incubeer cellen gedurende 3 dagen bij 27 ° C.
- Verzamelen en centrifuge medium bij 4000 x g.
- Bewaar het supernatant (V2 high-titer stock) bij 4 ° C.
- Zaad 1 x 10 6 Sf9 cellen per putje in 2,5 ml Sf-900 medium bevattende 10% foetaal runderserum, 10 ug / ml gentamycine en 100 uM ganciclovir infecteren met 25 gl V2 voorraad in elke put.
- Incubeer cellen gedurende 3 dagen bij 27 ° C.
- Verzamel cellen door centrifugeren bij 4000 xg en insectenwerend celpellet eiwitextractie (stap 3.1.2. 1).
- Nicotiana benthamiana voorbijgaande expressie systemen:
- Groeien N. benthamiana planten in een kas, onder natuurlijk licht binnen het temperatuurbereik 18-23 ° C. Voor agro-infectie gebruiken 4-5 weken oude planten.
- Houd agroinfected planten in een klimaatkamer bij 22 ° C met een 13 uur dag / 11 uur nacht fotoperiode.
- Commerciële recombinatie kloneringssysteem:
- Breng pK7WG2.G65mut in Agrobacterium tumefaciens-stam EHA105 elektrocompetente cellen zoals eerder beschreven 8 en screenen de kolonies na 2 gekweekt op LB medium dat rifampicine (50 ug / ml), streptomycine (300 ug / ml) en spectinomycine (100 ug / ml) dagen incubatie bij 28 ° C, door kolonie-PCR 8 met de volgende transgen-specifieke primers: 5'-CATGGTGGAGCACGACACGCT-3 & #8217; en 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3 ', met een hybridisatietemperatuur van 58 ° C en een verlengingstijd van 50 sec. Voer de PCR-reactie in een totaal volume van 20 pl.
- Inoculeer bacteriën in 30 ml LB medium met rifampicine (50 ug / ml), streptomycine (300 ug / ml) en spectinomycine (100 ug / ml) gedurende twee dagen bij 28 ° C.
- Verzamel bacteriën door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 20 min en resuspendeer pellet in 10 ml infiltratie buffer (10 mM MES, 10 mM MgCl2, 100 pM acetosyringoon, pH 5,6). Meet de OD600 waarde en vervolgens aanpassen tot 0,9 door verdunning in dezelfde buffer.
OPMERKING: het totale volume nodig is voor het infiltreren van drie N. benthamiana planten is 30 ml. - Gebruik een 2,5 ml naaldloze injectiespuit aan de Agrobacterium suspensie in N. infiltreren benthamiana bladeren. Voorzichtig en langzaam te injecteren blad panelen met de vering van de spuit. Infiltreren drie uitgebreid ldakranden per plant en het gebruik van drie planten als drievoud.
OPMERKING: voor de gezondheid en veiligheid redenen oogbescherming tijdens infiltratie proces. - Verzamel agroinfiltrated bladeren 2 dagen na infectie (dpi) en vries in vloeibare stikstof. Bewaren plantenweefsel bij -80 ° C.
- MagnICON systeem:
- Breng de MagnICON vectoren - de 5 'module (pICH20111), de 3'module (pICH31070.G65mut) en het integrase module (pICH14011) - in A. tumefaciens GV3101 stam met standaardtechnieken. Zeef de kolonies gegroeid op LB medium dat 50 ug / ml rifampicine en geschikte vector-antibioticum (50 ug / ml carbenicilline voor pICH20111 en pICH14011, 50 ug / ml kanamycine voor pICH31070) door kolonie-PCR met behulp van specifieke primers voor elke vector.
- Te enten afzonderlijk de drie A. tumefaciens stammen in 5 ml LB medium dat 50 ug / ml rifampicine en geschikte vector-specifieke antibioticumen schud gedurende de nacht bij 28 ° C.
- Pellet overnacht bacteriële kweken door centrifugatie bij 4000 xg gedurende 20 min en resuspendeer ze in twee delen van de oorspronkelijke bacteriekweek van 10 mM MES (pH 5,5) en 10 mM MgSO4.
- Meng gelijke volumes van bacteriële suspensies die de drie vectoren en gebruik maken van de schorsing mix voor spuit infiltratie van N. benthamiana bladeren. Infiltreren drie uitgebreid bladeren per plant.
- Verzamel agroinfiltrated bladeren op 4 dpi en vries in vloeibare stikstof.
- Bewaren plantenweefsel bij -80 ° C.
- Nicotiana tabacum stabiele expressie systeem:
- Groei en in vitro plantjes N. handhaven tabacum (var Sr1.) op vaste planten kweekmedium (4,4 g / l Murashige en Skoog - MS - medium waaronder vitaminen, 30 g / l sucrose, pH 5,8, 7 g / l fabriek agar) onder gecontroleerde omstandigheden in de klimaatkamer bij 25 ° C met 16 uur / 8 uur dag / night regime.
- Start een pre-cultuur van A. tumefaciens EHA105 de expressievector pK7WG2.G65mut in 5 ml vloeibaar YEB-medium met geschikte antibiotica (rifampicine 50 ug / ml, streptomycine 300 ug / ml spectinomycine 100 ug / ml) en overnacht groeien bij 28 ° C in een orbitale schudder set bij 200 rpm.
- Gebruik 1 ml van de voorkweek in een 50 ml Agrobacterium kweek in YEB medium met antibiotica inoculeren (rifampicine 50 ug / ml, streptomycine 300 ug / ml spectinomycine 100 ug / ml) en kweken gedurende 24 uur, totdat de bacteriële cultuur verzadigde (OD 600 waarde van 0,5-1,0).
- Verzamel bacteriën door centrifugeren bij 4000 xg gedurende 20 min en resuspendeer pellet in 50 ml vloeibaar planten kweekmedium. Herhaal deze stap twee keer tegen antibiotica volledig te verwijderen.
- Neem de eerste gezonde volledig ontwikkelde bladeren van in vitro tabaksplanten en snijd ze in ongeveer 1 cm pleinen.
- Transfer bladstukkendiepe platen met bacteriële suspensie en laat in het donker gedurende 20 min.
- Verwijder blad stukken uit schorsing en dep droog op steriele filter papier.
- Plaats blad stukken met adaxiale zijde (bovenste bladoppervlak) op vaste planten kweekmedium met 1,0 ug / ml 6-benzylaminopurine (BAP) en 0,1 ug / ml naftaleen azijnzuur (NAA) en incubeer platen voor twee dagen in een klimaatkamer bij een gecontroleerde omstandigheden (25 ° C, 16 uur dag / nacht 8 uur).
- Transfer bladstukken op vast kweekmedium (inclusief 1,0 ug / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500 mg / ml cefotaxime, 100 ug / ml kanamycine) met abaxiale oppervlak (onderste oppervlak van het blad) in contact met medium.
- Incubeer de platen gedurende 2-3 weken in de klimaatruimte bij 25 ° C met 16 uur / 8 uur dag / nacht regime scheutvorming induceren. Subcultuur om de 2 weken door de overdracht van bladexplantaten frisse stevige planten kweekmedium met 1,0 ug / ml BAP, 0,1 ug / ml NAA, 500gg / ml cefotaxime en 100 ug / ml kanamycine.
- Wanneer scheuten overbrengen naar Magenta dozen met vast kweekmedium met 500 ug / ml cefotaxime en 100 ug / ml kanamycine voor wortelvorming induceren. Incubeer plantjes met 16 uur dag / nacht 8 uur fotoperiode bij 25 ° C gedurende 1-2 weken.
- Wanneer wortels vormen, dragen de planten in de grond in de kas.
- Verzamel een blad stuk voor elke plant en te isoleren genomisch DNA met een commerciële kit.
- Detecteren van de aanwezigheid van het transgen door specifieke PCR. Met 30 ng genomisch DNA als matrijs voor PCR-amplificatie met de volgende transgen-specifieke primers: 5'-CTGGTGCCAAGTGGCTCAGA-3 'en 5'-CACACGCCGGCAGCAGGT-3', met een hybridisatietemperatuur van 58 ° C en een rek van 20 sec . Voer de PCR-reactie in een totaalvolume van 50 ul.
- Analyseer het 220 bp product door elektroforese op 1% agarosegel in Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA).
- Selecteer transgene planten die het doelgen.
- Verzamel een blad stukje uit elk van de geselecteerde transgene plant en vries in vloeibare stikstof direct.
- Bereid totaal proteïne-extracten van plantaardige blad weefsel (stap 3.1.3) en test elke monster door western blot analyse zoals eerder beschreven 2 om de beste recombinant eiwit fabriek uiten van tabak te selecteren.
- Zak bloemen van de geselecteerde best presterende planten voor de bloei om kruisbestuiving te voorkomen.
- Na de bloei, rijping van fruit en zaad drogen, het verzamelen van zakken.
- Aparte zaden van het kaf en bewaar ze in een droge ruimte bij een gecontroleerde temperatuur (20-24 ° C).
- Zaai de gedroogde zaden tot de tweede generatie transgene planten produceren en vervolgens selecteert u de best presterende plant om zelf-bestoven zijn.
- Herhaal dezelfde stappen in 2.4.19-2.4.21 beschreven voor de volgende generaties procedure.
3. recombinant eiwit expressie Analyses
- Totaal eiwitextractie:
- Bacteriële cellen:
- Resuspendeer de bacteriële celpellet, verzameld zoals beschreven in stap 2.1.5, de helft van de kweek volume Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS - 2 mM Tris / HCl, 500 mM NaCl), pH 7,4 aangevuld met 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF).
- Sonicaat geresuspendeerd cel pellet drie keer voor 40 sec op halve kracht, terwijl het monster op het ijs.
- Geef lysaat door centrifugatie bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Overdracht supernatant naar een schone buis en beide supernatant en pellet afzonderlijk bij -80 ° C.
- Oplosbaar De insluitlichaampjes in de pellet verzameld doormidden cellulaire lysaat volume TBS pH 8,0 aangevuld met 6 M ureum door krachtig schudden gedurende de nacht bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 25 min bij kamertemperatuur en laat supernatant in een schonebuis.
- WINKEL zowel supernatant en pellet bij -80 ° C.
- Insectencellen:
- Was geïnfecteerde insectencel pellet verzameld zoals beschreven in stap 2.2.12 met 1 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS - 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2PO 4) pH 7,4.
- Resuspendeer cellen in 200 ul lysisbuffer (20 mM Tris / HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 3 mM β-mercaptoethanol en 1% Tween-20) en incubeer op ijs gedurende 30 min.
- Centrifugeer cellen gesolubiliseerd bij 14.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C.
- Verzamel oplosbare fracties en bewaar bij -80 ° C en de pellet weggegooid.
- Plant bladweefsel:
- Grind N. benthamiana en N. tabacum weefsel tot fijn poeder in vloeibare stikstof met behulp van een mortier en een stamper.
- Homogeniseren 100 mg van de grond weefsel in 300 ul van extractie buffer (40 mM Hepes pH 7,9, 5 mM DTT, 1,5% CHAPS), supplemented met 3 ul van proteaseremmer cocktail en ontdooien op ijs.
OPMERKING: de gekozen verhouding tussen plantenweefsel gewicht (g) naar buffer volume (ml) is 1: 3. - Centrifugeer extract bij 30.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C.
- Verzamel supernatant in een schone buis en bewaar bij -80 ° C.
- Bacteriële cellen:
- Coomassie kleuring gel:
- Bereid een geschikte verdunning van de totale eiwitextracten (bijvoorbeeld 2 ui plantenextract, 5 gl bacteriën en insecten extracten) tot een eindvolume van 10 pl extractiebuffer en voeg 5 ul 3x monsterbuffer (1,5 M Tris / HCl pH 6,8, 3% SDS, 15% glycerol, 4% β-mercaptoethanol) tot een uiteindelijke concentratie van 1x.
- Kook monsters gedurende 10 min.
- Afzonderlijke eiwitten door 10% SDS-PAGE.
- Na elektroforese warmte gel in aanwezigheid van Coomassie-oplossing A (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol, 10% azijnzuur) in een magnetron gedurende ongeveer twee minutens tot aan het kookpunt.
- Afkoelen gel tot kamertemperatuur onder zacht schudden.
- Discard Coomassiekleuring oplossing A.
- Destain gel door verwarmen in aanwezigheid van Coomassie oplossing B (0,05% Brilliant Blue R-250, 25% isopropanol), C (0.002% Brilliant Blue R-250, 10% azijnzuur) en D (10% azijnzuur) telkens volgens hetzelfde protocol voor kleuring.
- Na de laatste verhittingstrap met oplossing D, laat gel ontkleuren tot achtergrond is duidelijk 9.
- Western blot-analyse:
- Na elektroforese overdracht gescheiden eiwitten op een nitrocellulosemembraan met behulp van standaard technieken en blok met 4% melk in PBS pH 7,4 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Incubeer de blot overnacht bij 4 ° C of 4 uur bij kamertemperatuur in de blokkerende oplossing bevattende konijnen primair antilichaam opgewekt tegen het doeleiwit bij 1: 10.000 en aangevuld met 0,1% Tween-20.
- Na het primaire antilichaam labeling, was het membraan 3 maal gedurende 5 minuten elk met blokkerende oplossing bevattende 0,1% Tween-20.
- Incubeer met mierikswortel peroxidase (HRP) -conjugate anti-konijn antilichaam bij 1: 10.000 1,5 uur.
- Was membraan 5 keer gedurende 5 minuten elk met PBS-T (PBS aangevuld met 0,1% Tween-20).
- Proces western blot met de chemiluminescente peroxidase substraat.
- Radioimmuno assay (RIA):
- Laat reagentia (antiserum, tracer en proteïne A Sepharose) tot kamertemperatuur en pipet 20 pl proteïne extract monsters en standaarden in verschillende concentraties (van 300-2,400 ng / ml commercieel recombinant hGAD65) in 12 x 75 mm polystyreen buizen bereiken.
- Voeg 20 ul van antiserum, bereide verdunning 1:30 het serum van plasmaferese van een T1D patiënt.
- Voeg 50 ul van tracer (125-I-GAD65) en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd. Stel een buis met tracer slechts een schatting van de totale activiteit.
- Voeg 50 ulproteïne A Sepharose en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Breng 1 ml koude PBS buffer in elke buis en centrifugeer bij 1500 xg bij 4 ° C gedurende 30 min.
- Schenk de buizen om supernatant te verwijderen en te absorberen resterende vloeistof op vloeipapier door zachtjes te tikken buis.
- Meet immunologisch radioactiviteit in alle buizen door het tellen gedurende 1 min in een gammateller.
- Perceel in log-schaal de bindende tarieven (B / T%) van calibratoren met betrekking tot de totale activiteit, de standaard curve vast te stellen, en te lezen GAD concentratie van monsters uit de ijkcurve 10.
LET OP: Beperkt gebieden moeten worden ontworpen voor de opslag, verwerking en berging van radioactief materiaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een experimenteel ontwerp voor de heterologe expressie van een doel recombinant proteïne in verschillende productiesystemen wordt beschreven. De eerste focus lag de set-up van de verschillende platformen door de oprichting van de optimale omstandigheden voor de expressie van het doelwit eiwit in elk systeem.
De expressie van het doeleiwit, hGAD65mut, geïnduceerd in drievoud E. coli kweken. Na 3 uur van expressie bij 37 ° C werden de bacteriële cellen verzameld door centrifugeren en gelyseerd door sonicatie. Na een centrifugatie stap werden oplosbare eiwitten gescheiden van onoplosbare inclusielichamen en eerste analyses toonden dat hGAD65mut overwegend opgebouwd in onoplosbare inclusielichamen (gegevens niet getoond). Recombinant eiwit oplosbaar maken vereist het gebruik van ureum 6 M, die op zijn sterke denaturerende eigenschappen, interfereert met RIA analyse, waardoor mogelijk een kwantificering van hGAD65mut. Verschillende strategieën zijnen gerapporteerd voor het beperken van de vorming van insluitingslichamen, omvattende het kweken van de microbiële cellen bij lage temperatuur 11. De kweken werden bij 15 ° C en 20 ° C, en recombinante eiwitexpressie werd geïnduceerd bij dezelfde temperatuur. Zoals getoond in figuur 1A, de solubilisatie van hGAD65mut geproduceerd bij beide temperaturen, vereist opnieuw ureum (lanen S2). Zo weet lage temperaturen in dit experiment niet te voorkomen hGAD65mut vorming van onoplosbare aggregaten.
Baculovirus vectoren die de hGAD65mut sequentie (Baculo.G65mut) uitgedrukt in Sf9 hechtende celkweken. V1 en V2 hoge titer voorraden werden voorbereid en de best presterende infectie voorwaarden werden opgezet evalueren van verschillende virale voorraad volumes 5-50 pi. Zoals getoond in figuur 1B, is de optimale virale stock volume geïdentificeerd als 25 pl, waardoor 11,8 ± 0,8 ug recombinant eiwit per ml kweekmedium, zoals geëvalueerd door RIAanalyse (Tabel 1).
Naar aanleiding van infiltratie, tijdsverloop analyse van agroinfected N. benthamiana bladeren werd op twee tijdelijke expressiesystemen uitgevoerd. Voor de pK7WG2-gebaseerd systeem, werden blad monsters dagelijks samengevoegd in het bereik 1-5 dpi, werden de totale oplosbare eiwitten (TSP) gewonnen en gelijke hoeveelheden van TSP werden geanalyseerd door western blot (figuur 1C). Deze analyse benadrukt dat de maximale accumulatie van target recombinant eiwit wordt bereikt 2 dpi. Daarom werden de bladeren geoogst 2 dpi en de eiwitextracten werden geanalyseerd door RIA voor het meten van recombinant eiwit accumulatie, die gemiddeld 67.8 ug / g FLW (vers blad gewicht, Tabel 1) laat zien. Recombinant eiwit expressie niveaus, met behulp van dit systeem, kan verder worden verbeterd, door co-infiltreren de bladeren met een onderdrukker van posttranscriptionele gen silencing (PTGS) zoals P19 of HC Pro 12.
DeTegelijkertijd-gangen detectie werd uitgevoerd met N. uitgevoerd benthamiana bladeren agroinfected met de MagnICON vectoren: geïnfecteerde bladeren werden verzameld 1-8 dpi en gelijke hoeveelheden van TSP werden geanalyseerd door western blot. Deze analyse toonde aan dat maximaal recombinant eiwit accumulatie verkregen 4 dpi (figuur 1D), met een gemiddelde accumulatie van het recombinante eiwit van 78,8 ug / g FLW (tabel 1), zoals geëvalueerd door RIA.
De expressie van hGAD65mut in transgene tabaksplanten werd eerder gemeld 12, blijkt dat recombinant eiwit niveaus significant varieerden tussen onafhankelijk getransformeerde lijnen. De best presterende hGAD65mut T1 transgene plant was zelf-gekruist en de afgeleide planten (T2) werden geanalyseerd om te kiezen opnieuw de best presterende één. Deze procedure werd herhaald over meerdere generaties een homogene productieplatform ontwikkelen functiecontrole in elke generatie van RIA totdat geenverdere verbetering werd bereikt (gegevens niet getoond). In figuur 1E is een representatieve Western blot T5 transgene planten gerapporteerd, waarin de homogeniteit van recombinant eiwit opbrengst is evident. Zoals getoond in figuur 1F, de gemiddelde hGAD65mut opbrengst steeg van T2 tot T6, bereiken niveau van 99,1 ug / g FLW (tabel 1) en, tijdens het selectieproces, de standaardafwijking van het expressieniveau afgenomen.
Figuur 1:. Platform set-up Set up van de beste voorwaarden voor hGAD65mut expressie in elk platform. (A) E. coli induceerbare expressie platform. Bacteriële cellen werden gekweekt bij 15 ° C of 20 ° C. Bovenpaneel, western blot van hGAD65mut in celextracten (2 ug TSP per laan). Onderste paneel loading control gekleurd met Coomassie. n.c. = Negatieve controle bacteriële cellen getransformeerd met het pDEST17 vector die het chloramfenicol resistentie gen; T: totaal monsters; S1: Supernatant na sonicatie en centrifugeren; S2 en P: supernatant (1) en Pellet (2) na centrifugeren van de gesolubiliseerd in ureum bevattende buffer monster. (B) Baculovirus- / insect mobiele platform. De volgende virale voorraad volumes werden getest: 5, 25 en 50 pi bovenste paneel, western blot van hGAD65mut in cel extracten (5 ug TSP per baan) Onderste paneel, het laden van controle met Coomassie... NC = negatieve controle, extract van niet-getransformeerde insectencellen. (C) Tijdelijke expressie in N. benthamiana planten met behulp van de pK7WG2 vector. Monsters werden dagelijks verzameld, 1-5 dpi (lanen 1-5). Bovenste paneel, western blot van hGAD65mut in bladextracten (2,5 ug TSP per baan). Onderste paneel, het laden van controle met Coomassie, waar de grote subunitvan Rubisco is evident. nc = negatieve controle, plant geïnfiltreerd met de pK7WG2 vector die het GFP-marker-gen. (D) Tijdelijke expressie in N. benthamiana planten met behulp van MagnICON vectoren. Monsters werden dagelijks verzameld, 1-8 dpi (lanen 1-8). Bovenste paneel, western blot van hGAD65mut in bladextracten (5 ug TSP per baan). Onderste paneel, het laden van controle met Coomassie waar de grote subeenheid van Rubisco is duidelijk . nc = negatieve controle, plant geïnfiltreerd alleen met de pICH20111 5'-module en pICH14011 integrase-module. Getallen geven moleculaire massa marker in kDa. PC = positieve controle, 15 ng commerciële hGAD65 geproduceerd in het baculovirus / insectencel-systeem. (E) Stabiele expressie in N. tabacum planten. Blad monsters werden verzameld uit verschillende T5 planten (lanen 1-11). Bovenste paneel, western blot van hGAD65mut in bladextracten (5 ug TSP per baan). Onderste paneel, laden controle gekleurd with Coomassie. NC = negatieve controle, wildtype planten. Getallen geven moleculaire massa marker in kDa. PC = positieve controle, 15 ng commerciële hGAD65 geproduceerd in het baculovirus / insectencel-systeem. (F) Stabiele expressie in N. tabacum planten. Boxplot vertegenwoordiging van hGAD65mut accumulatie over meerdere generaties afgeleid van de best presterende hGAD65mut T1 transgene tabaksplant gerapporteerd als ug / g FLW berekend op basis van RIA gegevens. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Systeem | [HGAD65mut] (ug / ml) | [HGAD65mut] |
| Baculo / insect | 117,5 ± 7,7 | 11,8 ± 0,8 ug / ml kweekmedium |
| Transient | 22,6 ± 0,9 | 67,8 ± 2,7 ug / g FLW |
| MagnICON | 26,3 ± 5,9 | 78,8 ± 17,8 ug / g FLW |
| Elite T6 | 33,0 ± 3,8 | 99,1 ± 11,3 ug / g FLW |
Tabel 1: hGAD65mut levert hGAD65mut opbrengsten in verschillende platforms --vergister gebaseerd (Baculo / Insect) en op basis van planten (pK7WG2- en MagnICON in N. benthamiana en elite T6 in N. tabacum). Kolom - hGAD65mut concentratie eiwitextracten (ug / ml). Derde kolom - hGAD65mut in zoet- poortvleugelgewicht (ug / g FLW) voor plantaardige platforms en in celkweekmedium (ug / ml) voor vergister platform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werden drie verschillende platforms vergeleken voor de expressie van een recombinant humaan eiwit: bacteriële cellen, met baculovirus / insectencellen en planten. De plantaardige platform werd verder onderzocht door de exploitatie van drie veel gebruikte technologieën expressie (dat wil zeggen, van voorbijgaande aard - MagnICON en pK7WG2 basis - en stabiel). Het doeleiwit voor dit experiment gekozen, hGAD65mut, eerder uitgedrukt in verschillende systemen 13, en de productie en functionaliteit zijn gemakkelijk detecteerbaar en meetbaar 14.
Bacteriële cellen niet effectief productieplatform omdat hGAD65mut gevormd inclusielichamen, zelfs bij lage temperaturen groeiomstandigheden, waarvoor derhalve omslachtig solubilisatie en hervouwing zijn natieve conformatie bereiken. Inderdaad, de belangrijkste falen van dit platform voor de expressie van recombinante eiwitten complex de juiste conformatie van het eindproduct.
DeBaculovirus / insectencel platform gemedieerde een hoge expressie van het immunoreactieve recombinante eiwit, maar de belangrijkste beperking van dit expressiesysteem is de hoge kosten van kweekmedia, moeten insectencellen groeien. Er werd geschat dat de totale productiekosten van 1 g hGAD65mut € 700 in deze productie platform kon bereiken (gezien 9 L van insecten celcultuur media vereist). Een verdere beperking van deze uitdrukking platform is de behoefte van steriele kweek van insecten cellen, die personeel met aseptische manipulatie vaardigheden vereist. De virale voorraadvolumes gebruikt om cellen te infecteren en het tijdstip van virale infectie: Om efficiënte recombinante eiwit accumulatie twee kritische parameters zorgvuldig worden gecontroleerd in deze uitdrukking systeem. Bovendien is de wasmiddel gebruikt voor totale oplosbare eiwit extractie uit Sf9 insectencellen, drastisch beïnvloedt recombinant eiwit oplosbaar.
Plantaardige systemen waren de meest gunstige platform naar hGAD65mut uitdrukken: de deze recombinante eiwitten was immuunreactieve en geaccumuleerde op een hoog niveau in bladweefsels. Vergelijking van verschillende plantaardige expressiesystemen werden de hoogste rendementen stabiel getransformeerde tabaksplanten (tabel 1) en bereikt indien gezien de totale biomassa van tabak vergelijking met N. benthamiana, gebruikt voor transiënte expressie, de algehele hogere productiviteit van tabak is evident. De belangrijkste beperking van stabiel getransformeerde tabak plantaardige platform is de tijd vereist voor het opzetten van het systeem, dat in onze studie duurde 20 maanden. Inderdaad, zou een homozygote lijn geselecteerd voor recombinante eiwitexpressie homogeniteit en kan vereisen herhaalde zelf-cross cycli vanaf de hoogste T1 expressie lijnen. In het bijzonder wanneer de gekozen T1 neemt meer dan één kopie van de transgene eigenschap kan het fokprogramma tot 3 jaar.
Transiënte expressiesystemen boodvoordeel van snelle opschaling te wijten aan een kort interval tussen transformatie en expressie en de set-up van de uitdrukking platform vereist 4 dagen. Echter, een beperking van de plantaardige transiënte systemen is dat hun automatisering nauwelijks uitvoerbaar op laboratoriumschaal tenzij speciale hoogwaardige machines agro-infiltratie wordt gebruikt. Vandaar dat een juiste berekening voor de grootschalige productie van hGAD65 behulp van transiënte systemen hier niet worden uitgevoerd. Anderzijds, we speculeren dat de totale productiekosten van 1 g recombinant eiwit met T6 stabiele tabakslijn worden berekend minder dan 5 € (gezien grond voor de teelt 60 tabaksplanten). Te zorgen voor een efficiënt agroinfiltration en eiwitproductie aantal kritische parameters moeten zorgvuldig worden gecontroleerd (in de fabriek ontwikkelingsstadium, groeien en infiltratie conditie van Agrobacterium), zoals eerder gemeld 15. Verder is het voor elke uitdrukking experimenteren een bepaald tijdsverloop analyse zou moeten zijnuitgevoerd om de dpi de hoogste accumulatie van het recombinante eiwit mogelijk maakt selecteren.
Het voorbeeld hier besproken kan worden beschouwd als een case study, proof-of-principle dat sommige van de specifieke voordelen van plantaardige productie ten opzichte van traditionele systemen belicht. In het bijzonder kan tabak transgene lijnen homogeen expressie brengen van het recombinante eiwit worden beschouwd als een waardevol platform voor de massaproductie van recombinante eiwitten die nodig zijn in grote hoeveelheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract | Sigma | Y1333 | |
| Tryptone | Formedium | TRP03 | |
| Agar Bacteriological Grade | Applichem | A0949 | |
| Sf-900 II SFM medium | Gibco | 10902-088 | |
| Grace’s Insect Medium, unsupplemented | Gibco | 11595-030 | |
| Cellfectin II Reagent | Invitrogen | 10362-100 | |
| MS medium including vitamins | Duchefa Biochemie | M0222 | |
| Sucrose | Duchefa Biochemie | S0809 | |
| Plant agar | Duchefa Biochemie | P1001 | |
| Ampicillin sodium | Duchefa Biochemie | A0104 | Toxic |
| Gentamycin sulphate | Duchefa Biochemie | G0124 | Toxic |
| Ganciclovir | Invitrogen | I2562-023 | |
| Carbenicillin disodium | Duchefa Biochemie | C0109 | Toxic |
| Kanamycin sulfate | Sigma | K4000 | Toxic |
| Rifampicin | Duchefa Biochemie | R0146 | Toxic – 25 mg/ml stock in DMSO |
| Streptomycin sulfate | Duchefa Biochemie | S0148 | Toxic |
| Spectinomycin dihydrochloride | Duchefa Biochemie | S0188 | |
| IPTG (isopropil-β-D-1-tiogalattopiranoside) | Sigma | I5502 | Toxic |
| MES hydrate | Sigma | M8250 | |
| MgCl2 | Biochemical | 436994U | |
| Acetosyringone | Sigma | D134406 | Toxic – 0.1 M stock in DMSO |
| Syringe (1 ml) | Terumo | ||
| MgSO4 | Fluka | 63136 | |
| BAP (6-Benzylaminopurine) | Sigma | B3408 | Toxic |
| NAA (Naphtalene acetic acid) | Duchefa Biochemie | N0903 | Irritant |
| Cefotaxime | Mylan Generics | ||
| Trizma base | Sigma | T1503 | Adjust pH with 1 N HCl to make Tris-HCl buffer |
| HCl | Sigma | H1758 | Corrosive |
| NaCl | Sigma | S3014 | 1 M stock |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| PMSF (Phenylmethanesulfonylfluoride) | Sigma | P7626 | Corrosive, toxic |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma | P5927 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| DTT (Dithiothreitol) | Sigma | D0632 | Toxic – 1 M stock, store at -20 °C |
| CHAPS | Duchefa Biochemie | C1374 | Toxic |
| Plant protease inhibitor cocktail | Sigma | P9599 | Do not freeze/thaw too many times |
| SDS (Sodium dodecyl sulphate) | Sigma | L3771 | Flammable, toxic, corrosive – 10% stock |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B7920 | |
| Isopropanol | Sigma | 24137 | Flammable |
| Acetic acid | Sigma | 27221 | Corrosive |
| Anti-Glutamic acid decarboxylase 65/67 | Sigma | G5163 | Do not freeze/thaw too many times |
| Horseradish peroxidase (HRP)-conjugate anti-rabbit antibody | Sigma | A6154 | Do not freeze/thaw too many times |
| Sf9 Cells | Life Technologies | 11496 | |
| BL21 Competent E. coli | New England Biolabs | C2530H | |
| Protein A Sepharose | Sigma | P2545 | |
| Cell culture plates | Sigma | CLS3516 | |
| Radio Immuno Assay kit | Techno Genetics | 12650805 | Radioactive material |
References
- Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding. FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).
- Avesani, L., et al. Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant. Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).
- Sambrook, J., et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Second Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (1989).
- Avesani, L., et al. Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen. Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).
- Marillonnet, S., Giritch, A., Gils, M., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. In planta engineering of viral RNA replicons: efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 101 (18), 6852-6857 (2004).
- Gleba, Y., Klimyuk, V., Marillonnet, S. Viral vectors for the expression of proteins in plants). Curr. Opin. Biotechnol. 18, 134-141 (2007).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), (2008).
- Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods. 4 (4), 1-7 (2008).
- Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).
- Falorni, A., et al. Radioimmunoassay detects the frequent occurrence of autoantibodies to the Mr 65,000 isoform of glutamic acid decarboxylase in Japanese insulin-dependent diabetes. Autoimmunity. 19, 113-125 (1994).
- Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
- Arzola, L., et al. Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein. Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).
- Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective. Biomed. Res. Int. 2014, 136419 (2014).
- Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).
- Leuzinger, K., et al. Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins. J Vis Exp. (77), (2013).
