Protocol
注：ゼブラフィッシュを使用した手順は、UCSFの施設内動物管理使用委員会によって承認された。
ツールの調製
- ピンホルダーに特徴点のピンを挿入し、ピンをクランプ。
- 先端の細い鉗子を使用して、慎重にわずかにフックを作成するために、ピンの先端を曲げる。
- 負傷中の胚の操作および安定化のために、ラジオペンチを使用して、インスリン注射器に取り付けられた28ゲージ1/2インチの針の端を曲げ。
傷害のためのゼブラフィッシュ胚の作製
- ゼブラフィッシュの繁殖ペアを設定し、以前に22示すように、卵の水（60ug / mLの水族館塩）で卵を集める。
- 胚はメラニン化を防ぐために、約8時間後に受精（HPF）であるとき、卵の水に0.003％、N-フェニルチオ尿素（PTU）を追加します。
- 先端の細い鉗子を用いた実験に先立ってDechorionate 2日後の受精（DPF）の胚。
- 0.02％緩衝化3-アミノ安息香酸（トリカイン）前の操作に約10分を有する胚を麻酔。
胚の3。機械的血管損傷
- 転送ピペットを用いて、解剖実体顕微鏡でうつ病のスライドに麻酔をかけた胚を転送します。
- 利き手で胚を操作するために注射針の短い平らな面を使用して、腹面が針から離れて向けてその側に胚を配置する。
- 先端で特徴点のピンの位置を決め泌尿生殖器の開口部に魚の後部の腹面に対して直接指摘した。湾曲した先端が尾静脈（ 図1 <に直接周皮を貫通することができるようにわずかな角度で特徴点のピンを配置します/強い>）。
- 胚を操作するために注射針を使用して、少し静脈にピンをフックするピンに胚をタップして特徴点ピンと尾静脈を貫通。
- 注射針を使用して、容器内の小さな涙を作成するために離れて特徴点ピンから胚を引き出します。
注：成功した損傷は静脈から即時の出血になります。
止血4.分析
- 目に見えて、この手順のために血液細胞の循環を持つ唯一の胚を選択してください。
- とすぐに特徴点ピンが容器から引っ張られるようにタイマーを開始する準備をします。
- とすぐに血液損失を傷から可視化することができるようにタイマーを起動します。傷口からの血液損失がなくなると、タイマーを停止し、出血時間として総時間を記録する。凝固が抑制される場合には、もはや目に見えて循環する血液細胞が存在しないときまでの時間を記録する。
創傷治癒の5.分析
- 転送POS顕微鏡用ガラスボトムイメージング皿上にT-傷害動物。
- 卵の水の大部分を削除します。
- アガロース42〜45ºCに加熱し、卵の水に溶解し、0.02％トリカインで補充0.3から1.2パーセントの低融点で胚をカバーする。
- ピンセットを用いて、その両側に位置胚。
- アガロースが冷却した後、卵の水中の0.02％トリカインで料理を埋める。
- 明視野、落射蛍光、または共焦点顕微鏡を用いて画像を取得する。
- ピンセットを用いてアガロースから胚を取り出し、卵の水に戻って転送する。
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Representative Results
機械的な血管損傷が2 dpfの胚（ - C図2A）で行った。 （ 図2D）出血の停止までの時間によって測定されるように、迅速かつ信頼性の高い凝固応答の傷害をもたらす。凝固応答の差異を測定することができたか否かを判断するために、抗凝固ヒルジンはのために（直前に（水に溶解μlのヒルジンあたり1単位の5~10オランダ）を創傷にキュビエのダクトへの注入によって胚に投与したキュビエのダクト内に注射のデモンストレーション、前回のJoveの記事23）24を参照してください。損傷前にヒルジンの投与は、車両制御（ 図2D）対出血時間の増加大幅にもたらした。
と赤血球（gata1a：DsRedの：血管損傷及び凝固の証拠は、直ちに損傷後の内皮のためのトランスジェニック系統（EGFP kdrl）を使用して見ることができますEM>）25,26マーカー。画像を順次エピ蛍光を用いて、12時間の期間のために5分ごとに取得した。代表的な静止画像（ 図3）創傷治癒の異なる段階を通して示されている。微分干渉コントラスト（DIC）及び蛍光顕微鏡の組み合わせを用いて、創傷修復の異なるパラメータを測定することが可能である。創傷修復は、実験全体で再現可能なパターンに従っているか否かを判断するために、血流を再確立するための時間は、魚の4群で測定した。血管損傷が負傷した血管を通る血流の再確立に253±16分の信頼性のあるステレオタイプの応答をもたらした（n =実験あたり4-5魚、平均±SEM）。
図1：2 DPF胚の図がPERFのための特徴点ピンの配置を示す尾静脈（CV）の機械的損傷をorming。血管区画は灰色で影されている。
図2：出血時間は、視覚的に機械的損傷後に測定することができる静止2のdpf胚におけるゼブラフィッシュの血管損傷のリアルタイム映像から。画像は、創傷（B）からの活性失血中、および血液損失（C）の停止後、損傷の時点（A）に示されている。示されたすべての時間は秒単位です。胚左に面した上部と腹面での前方横方向に配向されている。スケールバーは100μm。抗凝固ヒルジンの投与は、ビヒクル対照（D）した（p <0.0001、Studentのt検定）に対する出血時間の増加につながった。PG "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：血管内皮（kdrl：EGFP）のためのマーカーを用いて、血管損傷後のタイムラプスDICおよび蛍光顕微鏡から静止ジェニックマーカーを使用して、機械的損傷および修復を可視化し、赤血球（gata1a：DsRedの ）2のdpf胚。画像は、血管内のギャップとローカル赤血球蓄積た（t = 25）、再確立された血流（トン= 210）と部分補修、および正常な血管構造（トン= 615）を明らかに完全な回復を示した。時間は分単位で表示されます。胚左に面した上部と腹面での前方横方向に配向されている。 *背側大動脈の位置を示している。傷害（矢頭）が尾静脈と尾叢の一部を破壊した。スケール25ミクロンのバー。
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Discussion
ゼブラフィッシュは、レーザー傷害13-15、レーザー誘発血栓16、および上皮創傷10を含む創傷の異なるタイプのモデルとして成功裡に使用されている。我々は、実行が簡単であり、リアルタイムの顕微鏡検査に非常に適しているin vivoモデルで制御怪我を生産機械的損傷の方法を報告している。迅速かつ測定可能な止血応答映像やタイムラプス顕微鏡を用いてモニターすることができる再現可能な創傷修復プログラムで損傷をもたらす。
そのシンプルかつ血管微視的に定義され、アクセス可能な部位で再現性のある損傷を許容する解剖学、最も血管および造血細胞型の存在をステレオタイプは、傷害に対する応答を研究するためのゼブラフィッシュ胚を特に有用にする。しかし、ゼブラフィッシュの胚は、ほとんどのAPこのシステムを作り、開発5,6の最初の数週間の間に機能的なリンパ球を持っていない炎症および修復における自然免疫の寄与を研究するためpropriate。現在、トランスジェニックゼブラフィッシュの多種多様な血小板、フィブリノゲン、赤血球、白血球と血管内皮を標識線を含む血栓形成、凝固、炎症、創傷修復に関与する細胞およびタンパク質用のマーカーが存在し17,21,25- 31。これらおよび他のツールにより、重要な詳細に止血および修復に関与するプロセスに従うことを確認する必要があります。
機械的損傷は、ゼブラフィッシュにおける止血の研究のためのレーザー損傷を補完します。レーザ誘起損傷は、ゼブラフィッシュ胚およびマウスモデルにおいて血栓形成を誘発するために長年使用されているが、レーザー傷害は、凝固および血小板/血小板の活性化を誘発するメカニズムは完全には16,32が知られていない。機械的損傷は、おそらく、血管違反により凝固を誘導するための生理学的に関連する方法を提供し、かつ組織因子依存性凝固カスケードの開始。ヒルジン処置は、損傷後の出血時間を増加させることを知見は、このモデルはトロンビン依存性であることを示唆している。機械的損傷は、さらに、血管修復を追跡する機会を提供するために、血管の十分な崩壊を提供することにより、レーザー傷害を補完する。これまでの研究では、成功した薬理学的および遺伝子操作19,33の条件で出血時間の違いを示すために、メス切開し、針穿刺による機械的損傷を使用してきた。現在のモデルで使用される特徴点ピンの損傷が原因でそれが生成する傷の小さなと定義されたサイズにし、より良い血管再開通と修復を勉強する機会を提供することで、より再現性の傷害を提供することで、他の損傷モデルを補完することがあります。
ゼブラフィッシュにおける創傷の上皮は、炎症および創傷修復10を研究する際の強力なモデルであることが証明された。への能力血管損傷は、フィブリンが暫定マトリックス、血栓や破片がクリアされ、血管が再生成されています設定で、より複雑な傷の修復を評価する機会を提供し紹介する。これらのプロセスは、通常、組織修復および急性および慢性炎症および血管病理に関与するように、この方法は、細胞の挙動は、全動物モデルにおいてリアルタイムでモニターすることができるシステム内のヒトの疾患の側面をモデル化するのに役立つだろう。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
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