Protocol
NOT: Zebra balığı kullanarak Prosedürleri UCSF Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Araçlar 1. Hazırlık
- Bir iğne tutucu içine minutia pimini takın ve pin kelepçe.
- Ince uçlu forseps kullanarak, dikkatli bir hafif kanca oluşturmak için pimin ucunu bükün.
- Manipülasyon ve yaralanma sırasında embriyonun stabilizasyonu için, iğne-burun pense kullanarak bir insülin şırınga üzerine monte edilmiş bir 28 guage ½ inç iğne ucunu bükün.
Sakatlık için Zebra balığı Embriyolar 2. Hazırlık
- Zebra balığı yetiştiriciliği çiftleri kurmak ve daha önce 22 gösterildiği gibi yumurta su (60ug / ml akvaryum tuzları) yumurta toplamak.
- Embriyolar yaklaşık melanization önlemek için 8 saat sonra döllenme (hpf) olduğunda yumurta suya% 0.003 N-feniltiyoüre (PTU) ekleyin.
- Ince uçlu forseps kullanarak deney öncesinde dechorionate iki gün sonrası fertilizasyon (dpf) embriyolar.
- % 0.02 tamponlanmış 3-aminobenzoik asit (Tricaine), önceki kontroller için yaklaşık 10 dakika ile embriyolar anestezisi.
3. Mekanik Gemi Embriyolar yaralanması
- Bir transfer pipeti kullanarak bir diseksiyon stereomikroskopta bir depresyon slayt anestezi embriyolar transfer.
- Dominant elin ile embriyo işlemek için şırınga iğnesi kısa düz tarafını kullanarak, uzak iğne bakan ventral yüzeyi ile yan embriyo yerleştirin.
- Ucu ile minutia pimi ürogenital açılış balık posterior ventral yüzeyine doğrudan işaret yerleştirin. Hafif bir açıyla minutia pimini yerleştirin böyle kavisli ucu kaudal ven (Şekil 1 <doğrudan periderm delip mümkün olduğunu/ Strong>).
- Embriyo işlemek için şırınga iğnesi kullanarak, hafifçe damar içine iğne kanca pin içine embriyo dokunarak minutia iğne ile kaudal ven delmek.
- Şırınga iğnesi kullanarak, kap içinde küçük bir gözyaşı oluşturmak için uzak minutia pin embriyo çekin.
NOT: Başarılı bir yaralanma damarından derhal kanama neden olur.
Hemostazın 4. Analizi
- Gözle görülür bu işlem için kan hücreleri dolaşımdaki sadece embriyolar seçin.
- En kısa sürede minutia pimi kabından çekilir gibi zamanlayıcı başlamak için hazırlayın.
- En kısa sürede kan kaybı yaradan görüntülenmiştir edilebilir Sayacı başlatmak. Yaradan kan kaybı kesildiğinde, Sayacı durdurmak ve Zaman Kanama gibi toplam süreyi kaydetmek. Pıhtılaşma engellenir ise, artık gözle görülür dolaşan kan hücreleri varken zaman kaydedin.
Yara Şifa 5. Analizi
- Aktarım posmikroskopi için cam alt görüntüleme yemekleri üzerine t-yaralanma hayvanlar.
- Yumurta suyun çoğunluğu çıkarın.
- ºC 42 ila 45 kadar ısıtılır ve% 0.02 Tricaine ile takviye agaroz yumurta suda çözünmüş 0,3-1,2% düşük erime embriyolar, örtün.
- Forseps kullanarak kendi yüzüne Pozisyon embriyolar.
- Agaroz soğuduktan sonra, yumurta, su içinde% 0,02 Tricaine ile çanak doldurun.
- Aydınlık, Epifloresans veya konfokal mikroskopi kullanılarak görüntü elde.
- Forseps kullanarak agaroz embriyo çıkarın ve yumurta suya geri aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mekanik damar hasarı embriyolar (- C Şekil 2A) dpf, 2 gerçekleştirilmiştir. Hızlı ve güvenilir bir pıhtılaşma yanıt olarak yaralanma sonucu (Şekil 2D) kanamanın durdurulması zaman ile ölçülmüştür. Pıhtılaşma karşılık olarak fark ölçülebilir olup olmadığını belirlemek için, pıhtılaşma önleyici Hirudin (için hemen önce (5-10 nl su içinde çözülmüş hirudin ul başına 1 ünite) yaralama ile Cuvier'in gösterilen kanal içine enjekte embriyolar uygulanmıştır Cuvier ve Duct içine enjeksiyonu gösteri, önceki vallahi makale 23) 24 bkz. yaralanma öncesinde sonuçlanan hirudin uygulanması önemli ölçüde araç kontrolü (Şekil 2B) karşı kanama süreleri arttı.
(: EGFP kdrl) ve kırmızı kan hücresi (gata1a: damar hasarı ve pıhtılaşma kanıtı endotelyal için transgenik hatları kullanarak hemen sonrası yaralanma görülebilir DsRed 25,26 işaretler. Fotoğraflar bir sekans Epifloresans kullanarak 12 saatlik bir süre boyunca her 5 dakikada elde edilmiştir. Temsilcisi hareketsiz görüntüleri yara onarım (Şekil 3) farklı aşamalarında gösterilir. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) ve floresan mikroskobu bir arada kullanılarak, yara iyileşmesi farklı parametrelerini ölçmek mümkündür. Yara iyileşmesi deney boyunca tekrarlanabilir bir seyir takip olup olmadığını belirlemek için, kan akışını yeniden tesis etmek zaman balık 4 grup ölçülmüştür. Damar hasarı yaralı damar içinden kan akışının yeniden kurulması için 253 ± 16 dakika boyunca güvenilir bir basmakalıp tepkisiyle sonuçlanmıştır (n = deney başına 4-5 balık, ortalama ± SEM).
Şekil 1: 2 dpf'e embriyo şeması perf için minutia pin yerleşimini gösteren kaudal ven (CV) mekanik yaralanma oluşturmayan. Vasküler bölme gri gölgeli.
Şekil 2: Kanama süreleri görsel, mekanik yaralanma sonrası ölçülebilir Stills embriyolar dpf'e on 2 Zebra balığı damar yaralanması gerçek zamanlı video.. Çıkan yaralanma (A) 'nın zamanda gösterilen, yarada (B) aktif kan kaybı sırasında ve kan kaybı (C)' nin sona ermesinden sonra. Belirtilen bütün zamanlar saniye içindedir. Embriyolar sola bakan üst ve ventral yüzeyinde anterior yanal odaklı. Ölçek çubuğu 100 um. Antikoagülan hirudin Yönetim vehikül kontrol (D), (p <0.0001, Student t-testi) karşı kanama süreleri artan yol açtı.pg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Embriyolar dpf'e 2'de (: EGFP kdrl) ve kırmızı kan hücrelerinin (DsRed gata1a): Şekil 3. Damar yaralanması vasküler endotel için belirteçleri kullandıktan sonra timelapse DIC gelen transgenik işaretlerini kullanarak mekanik yaralanma ve onarım görselleştirme Stills ve floresan mikroskopi. Görüntüler gemiler ve yeniden kurulan kan akımı (t = 210), ve normal damar yapısına (t = 615) görünüşte tam restorasyonu ile yerel kırmızı kan hücresi birikimi (t = 25), kısmi onarım bir boşluğu gösterdi. Zaman dakika olarak gösterilir. Embriyolar sola bakan üst ve ventral yüzeyinde anterior yanal odaklı. * Dorsal aorta konumunu gösterir. yaralanma (ok başı) kaudal ven ve kaudal pleksus parçası bozulur. Ölçek25 mikron bar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Balığı 10 yaralama lazer yaralanması 13-15, lazer kaynaklı tromboz 16 ve epiteliyal da dahil olmak üzere yaraların farklı türleri için bir model olarak başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu çalıştırmak için basit ve gerçek zamanlı mikroskopi için son derece müsait olan bir in vivo modeli olarak kontrollü bir yaralanma üreten mekanik yaralama için bir yöntem sunulmaktadır. Hızlı ve ölçülebilir hemostatik tepki ve görüntü ve timelapse mikroskopi kullanılarak izlenebilir tekrarlanabilir bir yara onarım programında Sakatlık sonuçlanır.
Bunların basit ve basmakalıp vasküler tanımlanmış ve mikroskop altında erişilebilir yerinde tekrarlanabilir yaralanma izin anatomi, ve en çok vasküler ve hematopoietik hücre tipleri, yaralanmaya yanıtları incelemek için zebra balığı embriyolar özellikle elverişli hale getirir. Ancak, Zebra balığı embriyolar bu sistemi en ap yapma, kalkınma 5,6 ilk haftasında işlevsel lenfositleri yokinflamasyon ve onarım sırasında bağışıklık katkısını incelemek için propriate. Şu anda, transgenik zebrabalıkları geniş bir yelpazede trombositleri, fibrinojen, eritrositler, lökositler ve vasküler endotel etiket hatları dahil olmak üzere trombus oluşumu, pıhtılaşma, enflamasyon, yara onarımı, katılma hücreleri ve proteinleri işaretleri ile ana kadar 17,21,25- 31. Bu ve diğer araçları mümkün önemli detay hemostazda ve onarım ile ilgili süreçleri takip yapmak gerekir.
Mekanik yaralanma zebrafish hemostaz çalışma için lazer hasarını tamamlar. Lazer kaynaklı yaralanma zebra balığı embriyolar ve fare modelleri, lazerle yaralanma pıhtılaşma ve trombosit / trombosit aktivasyonu tam 16,32 bilinmemektedir tetiklediği mekanizmaları trombüs oluşumunu tetiklemek için yıl kullanılmış olsa da. Mekanik yaralanma, muhtemelen, vasküler ihlal pıhtılaşmayı uyarılması için bir fizyolojik ilgili bir yöntem sağlar vedoku faktör bağımlı pıhtılaşma kademeli dizisinin başlatılması. Hirudin tedavi ölçüde yaralanma sonrası kanama kat arttığı bulgusu bu model trombin-bağımlı olduğunu göstermektedir. Mekanik yaralanma ayrıca damar onarımı takip için bir fırsat sağlamak için bir kan damarının yeterli bozulması sağlayarak lazer hasarını tamamlar. Önceki çalışmalarda başarılı farmakolojik ve genetik manipülasyon 19,33 koşullarında kez kanama farklılıklarını göstermek için neşter insizyon ve İğne mekanik yaralanma kullandık. Mevcut modelde kullanılan minutia pimi yaralanması nedeniyle ürettiği yara küçük ve belirlenen boyutu ve daha iyi damar rekanalizasyonun ve onarım incelemek için bir fırsat sağlayarak daha tekrarlanabilir yaralanma sağlayarak diğer yaralanma modelleri tamamlayabilir.
Zebra balığı yaralama Epitelyal inflamasyon ve yara onarımı 10 eğitim için güçlü bir model olarak kanıtlanmıştır. yeteneğivasküler yaralanma, fibrin geçici matris, trombüs ve enkaz temizlenir sağlar ayarlarında daha karmaşık yaraların onarımını değerlendirmek için bir fırsat sağlar tanıtmak, ve damarları yeniden. Bu işlemler, normal doku tamirinde, akut ve kronik inflamasyon ve damar patoloji katılmak gibi, bu yöntem, hücre davranışlar bir bütün hayvan modeli gerçek zamanlı olarak takip edilebilir bir sistemde insan hastalığının yönlerini modellemek için yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minutia Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Tip diameter 0.0125 mm, rod diameter 0.1 mm |
| Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass Depression Slide | Aquatic Eco-Systems | M30 | |
| Low Melting Agarose | Lonza | 50081 | Preheated to 42 º C |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| 3-aminobenzoic acid (Tricaine) | Sigma Aldrich | E10521 | |
| Hirudin | Sigma Aldrich | H7016 | |
| Glass bottom imaging dishes | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZH10 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Observer | |
| Aquarium salts | Instant Ocean | ||
| Insulin syringe with 28.5 G needle | Becton Dickinson | 329461 |
References
- Gore, A. V., Monzo, K., Cha, Y. R., Pan, W., Weinstein, B. Vascular development in the zebrafish. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006684 (2012).
- Boatman, S., et al.
- Ellett, F., Lieschke, G. J. Zebrafish as a model for vertebrate hematopoiesis. Curr Opin Pharmacol. 10 (5), 563-570 (2010).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circ Res. 110 (6), 870-874 (2012).
- Traver, D., et al. The zebrafish as a model organism to study development of the immune system. Adv Immunol. 81, 253-330 (2003).
- Lieschke, G. J., Trede, N. S.
- Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Curr Opin Microbiol. 11 (3), 277-283 (2008).
- Oehlers, S. H., et al. A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents. Dev Dyn. 240 (1), 288-298 (2011).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
- LeBert, D. C., Huttenlocher, A.
- Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. J Leukoc Biol. 94 (4), 633-642 (2013).
- Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Laser-inflicted injury of zebrafish embryonic skeletal muscle. J Vis Exp. (71), e4351 (2013).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Carrillo, M., Radhakrishnan, U. P., Rajpurohit, S. K., Kim, S.
- Vo, A. H., Swaroop, A., Liu, Y., Norris, Z. G., Shavit, J. A. Loss of fibrinogen in zebrafish results in symptoms consistent with human hypofibrinogenemia. PLoS One. 8 (9), e74682 (2013).
- Liu, Y., et al. Targeted mutagenesis of zebrafish antithrombin III triggers disseminated intravascular coagulation and thrombosis, revealing insight into function. Blood. , (2014).
- Jagadeeswaran, P., Liu, Y. C. A hemophilia model in zebrafish: analysis of hemostasis. Blood Cells Mol Dis. 23 (1), 52-57 (1997).
- Jagadeeswaran, P., Gregory, M., Day, K., Cykowski, M., Thattaliyath, B. Zebrafish: a genetic model for hemostasis and thrombosis. J Thromb Haemost. 3 (1), 46-53 (2005).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. J Vis Exp. (61), (2012).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Renshaw, S. A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 7, 48 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
- Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb Haemost. 105 (5), 811-819 (2011).
- Bellido-Martin, L., Chen, V., Jasuja, R., Furie, B., Furie, B. C. Imaging fibrin formation and platelet and endothelial cell activation in vivo. Thromb Haemost. 105 (5), 776-782 (2011).
- Bielczyk-Maczynska, E., et al. A loss of function screen of identified genome-wide association study Loci reveals new genes controlling hematopoiesis. PLoS Genet. 10 (7), e1004450 (2014).
