Summary
Le but de ce document sur les méthodes est de décrire l'utilisation d'un système microfluidique pour le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent généralement des espèces identifiées dans la plaque dentaire supra-gingival humain. Méthodes pour décrire l'architecture du biofilm, biofilm viabilité, et une approche de la récolte biofilm pour les analyses de culture-dépendante ou indépendante de la culture sont mis en évidence.
Abstract
Il ya peu à haut débit dans des systèmes in vitro qui facilitent le développement de biofilms multi-espèces qui contiennent de nombreuses espèces souvent détectés dans les biofilms buccaux in vivo. En outre, un système qui utilise la salive humaine naturelle comme source nutritif, au lieu d'un milieu artificiel, est particulièrement souhaitable afin de soutenir l'expression des propriétés cellulaires et spécifiques à biofilm qui imitent les communautés in vivo. Nous décrivons une méthode pour le développement de multiples espèces de biofilms oraux qui sont comparables, par rapport à la composition spécifique, de la plaque dentaire supragingival, dans des conditions semblables à la cavité buccale humaine. Plus précisément, cet article de méthodes décrira comment un système microfluidique disponible dans le commerce peut être adaptée pour faciliter le développement de multi-espèces provenant de biofilms buccaux et cultivé au sein de la salive commun. En outre, une description de la façon dont le système peut être utilisé en conjonction avec un confocal laser microscope à balayage pour générer 3-D reconstructions du biofilm pour analyses architecturales et de viabilité sera présenté. Compte tenu de la grande diversité des micro-organismes qui se développent au sein des biofilms dans le système microfluidique (y compris Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella et Porphyromonas), un protocole sera également présenté décrivant comment récolter les cellules du biofilm pour plus sous-culture ou l'extraction d'ADN et d'analyse. Les limites à la fois le système de biofilm microfluidique et les analyses de données actuelles sur l'état de l'art seront abordés. En fin de compte, il est prévu que cet article va fournir une technique de référence qui permettra d'améliorer l'étude des biofilms buccaux et d'aider dans le développement de technologies supplémentaires qui peuvent être intégrés à la plate-forme microfluidique.
Introduction
Les biofilms sont architecturalement communautés complexes de bactéries qui sont regroupés sur des surfaces 1. Ces communautés contiennent typiquement de nombreuses espèces qui interagissent avec une autre à l'intérieur du biofilm 2. Biofilms buccaux, le plus remarquable à la vue étant la plaque dentaire, sont un problème persistant chez les humains et les résultats de leur développement incontrôlé dans la génération de taxonomique diverses communautés multi-espèces 3. Les bactéries composant de ces diverses communautés peuvent être jusqu'à 1000 fois plus résistants aux antimicrobiens que leurs homologues (planctoniques) flottant librement 4-6. Défaut de traiter ces communautés des biofilms oraux, qui peuvent causer la carie dentaire et les maladies parodontales, a donné lieu à un fardeau de santé publique important: plus de 500 millions de visites au bureau de dentiste par an aux États-Unis et un d'environ 108 milliards de dollars pour traiter ou prévenir parodontale les maladies et les caries dentaires 7.
contenu ">" Alors que de nombreux microbiologistes préconisent d'étudier le comportement microbien dans les conditions naturelles, peu d'entre eux le font. Ce est parce que leur moral pour surmonter les difficultés est constamment sapé par la facilité attractif de travailler avec des cultures de laboratoire. "-Smith 8.À l'heure actuelle, la recherche de biofilm orale est effectuée en utilisant une variété de in vivo et in vitro des approches, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients 9,10. Approches in vitro utilisent souvent modèle systèmes de biofilm qui sont relativement faciles à mettre en place, mais peuvent manquer clinique / monde réel pertinence 10,11. In vivo approches reposent généralement sur des systèmes de modèles animaux qui peuvent reproduire certains aspects de l'environnement buccal humain, mais encore une fois souffrir de limitations dues à des différences dans l'anatomie, la physiologie, de la microbiologie et de l'immunologie entre animaux et humains 12, 13. Il convient de noter que les biofilms orauxpeuvent également être développés sur des surfaces d'émail détenus dans un stent dans la bouche des volontaires humains, mais cette approche est actuellement relativement coûteux et main-d'œuvre 14,15. En fin de compte, de nouveaux agents ou des technologies pour améliorer la santé bucco-dentaire sont testés chez l'homme dans des conditions d'essais cliniques contrôlés 11. À l'heure actuelle, un modus operandi souvent utilisée pour identifier et évaluer de nouveaux agents de santé bucco-dentaire est d'abord de réaliser des études de laboratoire pour discerner efficacité potentielle, puis de réaliser des études sur les animaux et les «essais sur le terrain» qui emploient des cliniciens pour évaluer le succès de la technologie 9, 16,17. Malheureusement, les études de laboratoire ont tendance à se appuyer sur des systèmes modèles qui occupent une grande empreinte, sont technologiquement difficile à utiliser, et contiennent souvent simplifiées communautés de l'un ou tout au plus quelques espèces de tirer le potentiel signifiant 10,18 monde réel. Étant donné que les biofilms de la plaque dentaire contiennent plusieurs espèces et la forme dans un complex coule milieu salivaire, le développement de biofilms qui contiennent une ou quelques espèces dans les médias artificielle est peu probable pour générer communautés qui se comportent d'une manière similaire à celles d'un scénario réel 10,19. Pour faire face à l'époque, le coût, les besoins de formation, et de la nature représentant pauvres de systèmes de biofilm modèle de laboratoire par rapport à l'environnement dans le monde réel, nous avons récemment développé un débit élevé et germane environnement système de biofilm 20 (Figure 1). Le système bénéficie de l'utilisation de la salive acellulaire groupée humaine (SCF) en commun la salive contenant des cellules bactérienne humaine à moyen et non traitée (CCS) comme inoculum. Unique, le système combine également la technologie microfluidique, un confocal à balayage laser microscope, et indépendante de la culture bactérienne diversité technologie d'analyse. Ainsi, le système de modèle de l'environnement est germane (salive en utilisant comme inoculum pour la croissance des biofilms multi-espèces à 37 ° C dans le filtre stérilisé coulesalive) et les biofilms buccaux contiennent des espèces (y compris Streptococcus, Neisseria, Veillonella et Porphyromonas espèces) dans l'abondance représentant de ceux trouvés au début de la plaque dentaire supra 20.
Lorsque l'on considère que ce travail décrit l'utilisation du système de modèle nouvellement développé, une attention particulière doit être accordée à la fusion d'une confocal microscope à balayage laser (CLSM) microfluidique, et les technologies d'analyse de la diversité de la culture indépendante. L'union de ces technologies par notre groupe de recherche était intentionnelle et non seulement ajoute une capacité à haut débit pour le système modèle nouvellement développé, mais permet aussi des questions à poser qui ne pouvaient pas être facilement résolus avant avec d'autres systèmes. Tout d'abord, CLSM a des avantages distincts sur la microscopie classique car elle permet l'analyse tridimensionnelle de biofilms. Souvent incompris, ce est extrêmement important que les biofilms sont esprit hétérogèneh qui concerne la composition des espèces et la position spatiale ainsi que les conditions physiologiques imposées à différents emplacements spatiaux dans le biofilm 6,21. De concert avec le logiciel de rendu en trois dimensions et le logiciel d'analyse d'image, l'architecture du biofilm, les relations spatiales entre les espèces qui le composent, et l'étendue de l'abattage antimicrobien peut être analysée 22-24. Ces capacités ne sont pas possibles en utilisant la norme lumière transmise ou microscopie à épifluorescence. Ensuite, la microfluidique a attiré l'attention notamment dans le domaine de la microbiologie car elle permet l'étude des biofilms dans des conditions soigneusement contrôlées (débit, température, pH, etc.) et ne nécessite faibles volumes de liquide 25-27. Comme point de comparaison, la croissance d'une biofilm orale dans la salive humaine dans un système de modèle de cellule d'écoulement (un système qui est sans doute considéré comme le modèle de base pour de nombreuses études de biofilm orale) pendant 20 heures à un débit et de cisaillement similaire à celui atteintdans un système microfluidique nécessite au moins 200 ml, au lieu de 800 ul dans le dispositif microfluidique 28-31. Ainsi, un système modèle de biofilm microfluidique permet l'étude de la matière de quantité limitée dans des conditions définies. Enfin, la technologie de pyroséquençage a été optimisée dans la dernière décennie d'exiger que de petites quantités de matière pour effectuer une analyse de la communauté et est suffisamment polyvalent pour contrôler la profondeur de séquençage pour obtenir l'identité des espèces de biofilm même rares. L'utilisation de cette technologie, comme bactérienne tag codé FLX amplicon pyroséquençage (bTEFAP), a permis de questions pertinentes concernant l'écologie des biofilms à aborder 32,33. Ces questions imprégnés des difficultés dans le passé, lorsque pyroséquençage ne était pas disponible en raison du temps et des coûts nécessaires pour créer des bibliothèques de plasmides et les étapes technologiques et analytiques complexes nécessaires pour obtenir des données 33,34. Bien sûr, un grand avantage avec la culture indépendante apapproches, telles que pyroséquençage, ce est que les espèces de bactéries qui ne peuvent pas être cultivés en isolement au sein des milieux de laboratoire conventionnel (espèces à-dire viables mais non cultivables) peuvent être cultivées et identifiés dans le système de modèle et leur abondance relative dans la communauté quantifiés 35, 36 . Pour ajouter perspective, dès 1963, la fin de Sigmund Socransky estime qu'environ 50% des bactéries isolées à partir de matériel de la crevasse gingivale humain par voie orale n'a pas pu être mis en culture en utilisant des conditions de croissance de 37 laboratoire.
L'objectif de ce document sur les méthodes est de décrire l'approche de développer biofilms multi-espèces orales dans un système microfluidique disponible dans le commerce (Bioflux) en vertu: (i) des conditions représentatives de la cavité buccale humaine et (ii) avec une composition des espèces et l'abondance que est comparable à la plaque dentaire supra. En outre, en utilisant les logiciels freeware et commerciale, nous soulignons biofilm faire de basemesures d'architecture peuvent être tirées des données CLSM, avec un accent sur les approches pour quantifier la biomasse biofilm, la rugosité et la viabilité (basés sur direct coloration / Dead). Enfin, les mesures nécessaires pour récolter la matière biofilm pour l'analyse de la diversité en bTEFAP sont décrits.
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Protocol
Le protocole de collecte de salive décrit ici a été examiné par l'Université de l'Institutional Review Board du Michigan pour la recherche sur des sujets humains.
NOTE: En ce qui concerne les examens institutionnels pour le travail sur des sujets humains de ce type, des arrangements préalables et autorisations doivent être glanés au cours de l'établissement d'accueil. En particulier, selon l'établissement, la CISR ou d'approbation d'éthique pourraient avoir besoin d'être recherché et approuvé avant la collecte de salive de volontaires humains peut continuer. Comme une aide à la préparation d'une demande, d'un algorithme utile NIH / graphique peut être trouvée ici: http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf
1. Préparation du Pooled salive pour une utilisation en tant que milieu de croissance écologiquement Germane
- Recruter> 5 personnes pour la salive don. Ne prenez pas de renseignements permettant d'identifier, de se assurer qu'aucun individuals fera un don de la salive se ils sont malades ou ont pris des antibiotiques par voie orale dans les 3 derniers mois, ou ont consommé des aliments ou liquides, à l'exception de l'eau, dans la 2 h précédente avant le don.
- Recueillir salive dans 50 ml tubes en plastique. Mutualiser la salive recueillie dans un bécher en plastique, le garder sur la glace. Ne pas utiliser le verre comme polymères dans la salive se adhérer aux surfaces de verre internes.
- Ajouter dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 2,5 mM d'un stock 100x. (Stock est gelé dans usage unique aliquotes à -20 ° C). Agiter pendant 10 min dans un bêcher en plastique de la glace.
- Afin d'éliminer les particules, la centrifugeuse de salive commun pendant 30 min à 17 500 x g.
- Diluer la salive avec 3 volumes de dH 2 O pour donner un quart de salive concentré.
- Filtre stériliser la salive aide de 0,22 um polyéthersulfone (PES), filtre à faible liaison protéique. Utiliser un filtre avec une grande surface, ou utiliser plusieurs filtres pour petits domaines. Gardez la salive dans unrécipient en plastique sur la glace tout en filtrant.
- Geler la salive commun à -80 ° C dans des tubes en plastique de 50 ml jusqu'à ce que nécessaire pour développer les bactéries. Chaque tube en plastique est à usage unique et ne doit pas contenir plus de 35 ml que chaque puits microfluidique est titulaire d'un maximum de 1,2 ml (1,2 ml x 24 puits = 28,8 ml) et de l'espace est nécessaire dans chaque tube que la salive se dilate lors de la congélation.
- Pour l'utilisation, la salive commun décongeler à température ambiante. Une fois décongelé, filtre stériliser une fois de plus (0,22 um polyéthersulfone, filtre à faible liaison protéique pour enlever les précipités).
2. Préparation du Pooled salive pour une utilisation comme inoculum
- Recruter> 5 personnes pour la salive don. Ne prenez pas de renseignements permettant d'identifier, assurer qu'aucun individu fera un don de la salive se ils sont malades, ont pris des antibiotiques par voie orale dans les 3 derniers mois, ou ont consommé des aliments ou liquides, à l'exception de l'eau, dans la 2 h précédente avant le don. Recueillir SAmples plus de 30 min.
- Recueillir la salive dans des tubes en plastique de 50 ml à la température ambiante et mettre en commun la salive recueillie dans un bêcher en matière plastique à la température ambiante.
- Diluer la salive groupé avec autoclave glycérol de qualité générale de réactif pour obtenir un stock avec un rapport final de 25% de glycérol, de la salive contenant des cellules de 75% [CSC].
- Congeler la salive à -80 ° C dans 3 ml à usage unique aliquotes jusqu'à utilisation.
- Lorsque cela est nécessaire pour inoculer le système microfluidique, des aliquotes sont décongelées à température ambiante et agité doucement sur un agitateur vortex pendant 5 secondes, avant d'être introduit à la pipette dans le système microfluidique, comme décrit dans l'étape 3 de ce protocole, ci-dessous.
3. Croissance du orales biofilms multi-espèces
- Prétraitement SCF
- Première enrober les canaux microfluidiques Bioflux avec SCF. Ajouter 100 pi de SCF à chaque sortie ainsi. Utilisation du logiciel de contrôle Bioflux, sélectionnez flux "manuel" et définir des canaux tha "B1-B24"t doivent être utilisés.
- Ensuite, définissez cisaillement à 1,0 dyne / cm² et commencer flux pendant 2 min à température ambiante pour assurer une répartition homogène du CSA à travers le canal. Assurez-vous qu'il est fluide dans chaque canal d'entrée afin de vérifier que le SCF a coulé à travers tous les canaux uniformément.
- Incuber la plaque à température ambiante pendant 20 min.
- Retirer la solution / détachant SCF qui reste dans les puits de sortie et transférer dans les puits d'entrée. Ce volume total de 100 ul servira à équilibrer la contre pression appliquée à l'inoculum de la prise ainsi.
- Inoculation
- Pour chaque sortie ainsi, ajouter 100 pi de CCS inoculum. Placer la plaque microfluidique sur la plaque de chaleur (température réglée à 37 ° C), sélectionnez manuelle dans le logiciel de contrôle, et de régler le débit des puits de sortie dans les puits d'entrée (c.-à-arrière) à 1,0 dyne / cm² pour exactement 6 sec.
- Incuber la plaque microfluidique à 37 ° C pendant 40 min pour permettrepour l'adhésion initiale et la croissance des bactéries dans l'inoculum.
- Croissance nuit
- Pour les canaux inoculés utilisés, l'inoculum aspirer des déchets de chacun des puits de sortie. Ajoutez jusqu'à 1 ml de volume total de SCF dans chacun des puits d'entrée (qui peut être fait sur le dessus du SCF existant).
- Incuber la plaque microfluidique à 37 ° C, sélectionnez manuel et régler le programme à exécuter à 0,2 dyne / cm² pendant 20 heures.
- Stain prélavage
- Aspirer tout liquide des puits d'entrée et de sortie et ajouter 100 ul de PBS (pH 7,4) à chacun des puits d'entrée. Écoulement pendant 20 min à 0,2 dynes / cm².
- Outre mélange Stain
- Pour la viabilité cellulaire coloration faire 100 ul de mélange de teinture pour chaque canal à teindre. Plus précisément, ajouter 3 ul de SYTO 9 et 3 ul d'iodure de propidium par ml de PBS en utilisant le kit de coloration de viabilité cellulaire commercial tels que, LIVE / DEAD. Ceci génèreun mélange de coloration contenant 10 uM SYTO 9 et 60 uM de l'iodure de propidium.
- Aspirer le PBS restant dans les puits d'entrée, puis ajouter 100 ul du mélange de colorant de viabilité cellulaire à chaque puits d'entrée. Situé à écouler à 0,2 dyne / cm 2 et exécuter la solution de l'entrée à la sortie pendant 45 min à température ambiante.
- Lavage post-coloration
- Aspirer le colorant restant dans chacun des puits d'entrée et ajouter 100 ul de PBS dans chaque puits d'entrée. Situé à écouler à 0,2 dyne / cm² et exécuter la solution PBS de l'entrée à la sortie pendant 20 min à température ambiante pour éliminer tout excès de colorant.
4. Collection Image, rendu 3D, et l'analyse d'image
- Utiliser un confocal à balayage laser microscope inversé (CLSM) pour collecter des données d'image de biofilm à partir du système microfluidique. Assurez-vous que le CLSM est capable de supporter le poids de la plaque Bioflux, qui peut atteindre 150 g.
NOTE: Compte tenu de la dimensions des canaux microfluidiques, la nécessité pour la sensibilité de discerner la structure du biofilm, et les exigences pour détecter le signal de fluorescence d'intensité variable, se adapter à la CLSM avec un NA objectif ou l'un avec une qualité similaire optique, grossissement, et l'ouverture numérique 40X 1,25. - Normaliser les portes de capture des émissions avec gain et offset mesures étant maintenues constantes. Assurez-vous que la puissance du laser ne dépasse pas 25%, car cela peut entraîner des photo-blanchiment.
- Convertir des fichiers CLSM de la L EICA je Mage F type ile (FRV) pour OME (O stylo M icroscopy E nvironnement) type de fichier. Cela permet une plus grande facilité d'accès et la compatibilité entre les logiciels. Utilisez un logiciel disponible dans le commerce tels que, Imaris pour convertir les fichiers de ce type.
Rendu 3D pour Images / Figures
- Une fois converti au format OME, utiliser un logiciel disponible dans le commerce tels que Imaris pour rendre les imagesen 3D. Effectuez cette utilisant une combinaison de "Easy3D» et les options «surpasser».
NOTE: Attention au signal de fond et d'un seuil doit être faite. La fonction de l'histogramme dans Imaris peut être utilisé pour obtenir l'intervalle de collecte, ce qui devrait être maintenue constante entre les images en cours d'analyse. - Enregistrer des images en utilisant la fonction "snapshot" et de faire un examen attentif de la résolution d'image avant d'enregistrer les types de fichiers.
- Assemblez les images en chiffres en utilisant un logiciel de retouche d'image telles que CorelDraw ou Adobe Illustrator.
Analyse d'image 3D pour les graphiques et tableaux
- Utiliser librement disponibles imagej 23 et COMSTAT / COMSTAT2 38 pour l'analyse d'image. Télécharger les paquets du http://rsb.info.nih.gov/ij/ et http://comstat.dk/, respectivement. Demandez à la plus récente mise à jour de Java installé.
NOTE: La plate-forme de logiciels JAVA devra être installé prior à l'utilisation du logiciel d'analyse d'image.- Utilisez le logiciel ImageJ avec COMSTAT2 plug-in pour importer les fichiers OME pour chaque image de biofilm en mode "HyperStack" et vue avec des «canaux split".
- Analyser individuellement les deux canaux (rouge / propidium-iodure / morts être le canal 0, vert / SYTO-9 / être vivant canal 1) en utilisant la fonction «histogramme» de ImageJ. Cette fonction indique le nombre total de pixels de fichiers OME 8-bit (indiqué que "count") à chaque intensité de la couleur 0 à 255 (présentée comme «valeur»), avec 0 étant pixels avec aucun signal (arrière-plan) et 255 être pixels avec complète saturation du signal.
- Exporter les données dans un tableur et de normaliser toutes les valeurs de signal en pondérant chaque pixel par l'intensité du signal correspondant. Ceci est réalisé en multipliant le nombre total à une intensité de signal donnée par la valeur numérique de 8 bits (0 à 255), de ladite intensité de signal.
- La somme de toutes les valeurs pondérées, 0-255, pour les deux canaux pour chaque image capturée biofilm. Prendre la somme des valeurs pondérées pour les deux canaux pour déterminer le signal total pour cent par deux canaux. Pour ce faire, pour déterminer le rapport parent ou pour cent rouge et signal vert pour cent (ce est à dire le pour cent "DEAD" et pour cent "LIVE" pour chaque traitement).
- Effectuer des analyses statistiques, par exemple en utilisant bilatéral test t de Student modifié pour variance inégale. Les valeurs de p <0,05 sont considérées comme significatives et les valeurs de p <0,01 sont considérées comme très importante.
5. Les cellules récolte biofilms pour l'analyse indépendante de la culture
- Retirez tous passé la salive et inutilisé entrée et de sortie du puits. Laver les puits avec 1 ml d'eau distillée stérile trois fois.
- Ajouter 100 ul d'eau distillée stérile aux puits d'entrée et, en utilisant l'interface de commande du logiciel, passer lede l'eau distillée stérile avant à travers les canaux à> 8,0 dyne / cm 2 (débit> 745 ul / h, de cisaillement de 800 sec -1) pendant au moins 5 min. Répétez dans le sens inverse pendant au moins cinq minutes, puis répéter l'avant et processus d'étape de lavage inverser.
- Vérifier par la lumière ou par microscopie à épifluorescence (si les cellules ont été colorées / étiqueté) pour l'élimination de biofilm complète (figure 2). Recueillir le 100 pi suspension cellulaire et conserver à -80 ° C pour la culture indépendante analyse. Une analyse coût-efficacité de la composition de la communauté peut être atteint grâce à l'utilisation bactérienne FLX amplicon pyroséquençage d'étiquette codée (bTEFAP) en utilisant l'approche décrite dans Nance et al. 20
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Representative Results
Rendu 3D des biofilms
Les résultats représentatifs sont présentés dans la figure 3. Un outil utile dans les logiciels de Imaris est l'option à examiner chaque tranche de la pile de biofilm recueillies et de les combiner pour créer des reconstructions tridimensionnelles. En outre, les effets d'ombrage artificiels peuvent être ajoutés pour aider à interpréter visuellement des structures tridimensionnelles. Les biofilms rendus peuvent être orientés dans ne importe quelle direction avec différents grossissements à explorer la structure du biofilm ou micro-colonie. Les images présentées dans la figure. 3 montrent le résultat du traitement d'un biofilm multi-espèces orale. On notera en particulier que le traitement avec 70% d'éthanol a entraîné un changement de couleur significatif pour la plupart du biofilm (de vert à rouge), ce qui suggère la mort cellulaire significative des cellules ou des dommages. Les grandes micro-colonies semblaient contenir plus de cellules mortes que les cellules micro-colonie sous-jacents (et maintenant exposées). Such est un résultat du fait concevable de dé-adhérence des cellules de biofilm car l'éthanol est un antimicrobien à la membrane active. Par la conversion des fichiers de format et OME analysant les piles rendus dans ImageJ, il peut être vu par l'application de fonctions d'histogramme que la quantité de signal rouge vert et est inversement proportionnelle entre les biofilms non traités et ceux traités avec de l'éthanol.
Quantification du biofilm Propriétés
Le tableau 1 montre les moyennes et les écarts-types des paramètres structurels clés. Un avantage clé de l'utilisation Imaris, ImageJ et COMSTAT, ce est que si Imaris est utilisé en premier, les fichiers OME peuvent être générés pour permettre fichiers à travers imagej en pipeline et COMSTAT. Les données des échantillons présentés dans le tableau 1 montre que le traitement des biofilms orales avec 70% d'éthanol a entraîné une baisse très significative de la viabilité de 80,8% à 28,3%. L'éthanol peut causer des dommages aux cellules et c structurellehangements dans les biofilms mais ce est souvent fois pas mesurable significativement différente. Ici, pas de différences dans les mesures de biovolume moyenne, épaisseur moyenne et la rugosité moyenne ont été détectés (Tableau 1).
Figure 1. Le système de biofilm orale Bioflux microfluidique. (A) Un diagramme montrant une vue en coupe verticale du système Bioflux tout en étant monté sur un CLSM SPE inversé. (B) Un annoté (lignes noires) photographie soulignant deux canaux microfluidiques et les entrée et de sortie des puits. (C) Un exemple d'un biofilm rendu en deux dimensions en direct / Dead teinté orale qui a été traitée avec une solution de CPC de 0,01% résultant de l'abattage hétérogène, en partie en raison de la limitation de la diffusion de réaction. La couleur verte indique cellules vivantes, coloréesavec Syto 9; cellules de couleur rouge sont morts ou endommagés et colorées avec l'iodure de propidium. Fig 1A et 1B de Nance et al. 20 avec la permission. Bar sur la Fig. 1C représente 30 um.
Figure 2. Utilisation de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) pour générer deux dimensions et une vue en trois dimensions de biofilms rendus 20 hr. Ces biofilms ont été développés dans la salive acellulaire groupé (SCF) à partir d'un inoculum de mise en commun de la salive contenant des cellules (CCS). Une communauté de biofilm non traité (colonne de gauche d'images) est comparée à une communauté de 70% d'éthanol traité de biofilm et un biofilm représentatif est montré dans différents plans de vue (XY, XZ et Zyz). Histogrammes montrant les différences en rouge (cellules mortes / endommagées) et vert (cellules vivantes) unre indiquée pour chaque pile d'images (connecté données présentées dans les données en noir et non-connecté indiquées en gris). Toutes les données sont dérivées d'images 8 bits et donc sur une échelle de 0 à 255 (256 incréments). Barres d'échelle représentent 30 um.
Figure 3. Diagramme montrant le résultat de l'extraction / la récolte de 20 h orale biofilm multi-espèces (développé à partir d'un inoculum de CSC dans le CFS qui coule) du dispositif microfluidique Bioflux en utilisant la technique de cisaillement / d'écoulement élevée. Les lignes en pointillé ont été appliqués aux images afin d'aider à déterminer l'emplacement des parois de canal. La composition de la communauté du biofilm récolté peut être analysé par 454 technologies de pyroséquençage tels que bactérienne tag codé FLX amplicon pyroséquençage (bTEFAP) et a exprimé à de multiples niveaux taxonomiques (phylum travers espèces) selon requirements. Montré est un exemple de la composition de la communauté, au niveau de l'embranchement, des biofilms récoltées à partir de trois canaux microfluidiques. Les barres représentent échelle dans micromètres.
| Paramètre / Traitement | Non traitée | EtOH à 70% |
| La viabilité moyenne (%) | 80,8 (0,9) | 28,3 (5,8) ** |
| Biovolume moyenne (um 3 / um 2) | 17,7 (8,4) | 16,1 (3,0) |
| Epaisseur moyenne (pm 2) | 23,3 (11,3) | 15,6 (6,4) |
| Rugosité moyenne | 0,4 (0,3) | 0,50 (0.2) |
Tableau 1. Quantification des propriétés des biofilms de l'éthanol non traitée et 70% traités 20 h biofilms développés dans la salive acellulaire groupé (SCF) d'une salive contenant des cellules inoculum (CCS). Les valeurs en gras sont les moyennes et les valeurs non-gras dans parenthèses sont les écarts-types. Les données proviennent de cinq au-moins trois images de canaux microfluidiques. Des différences significatives au témoin non traité sont mis en évidence par un astérisque (** P <0,01%).
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Discussion
Ce document met en évidence les méthodes les étapes de base nécessaires pour configurer et exécuter un système microfluidique de manière à permettre le développement de biofilms multi-espèces orales provenant de la salive humaine regroupées et cultivés dans stérilisée par filtration 25% mis en commun la salive humaine. Approches pour caractériser le biofilm sont donnés, mais il faut se rappeler que ces approches décrites sont modifiables et technologies supplémentaires telles que, par exemple, des taches ou des étiquettes peuvent être introduits. En exemple, on pourrait imaginer utiliser des anticorps marqués ou introduire une souche fluorescente de visualiser et d'examiner la position spatiale de certaines espèces au sein du biofilm multi-espèces orale. En outre, selon le modèle du système microfluidique est utilisé, il est possible de développer des biofilms dans des conditions anaérobies (dans le cas du système Bioflux, une note technique est disponible au Fluxion.com à ce sujet).
Un aspect clé de la microfluidique Biofluxic système est sa compatibilité avec de multiples technologies, ce qui est mis en évidence ici par la capacité d'effectuer la culture indépendante de diversité d'analyses (Figure 3). Bien que les surfaces internes du système microfluidique sont pas facilement accessibles, vigoureuse avant et arrière écoulement ne permet biomasse biofilm substantiel d'être enlevé. Alors que tout le biofilm ne peut être facilement retiré et cela pourrait être considéré comme une faiblesse dans le système, il est pertinent de noter que de nombreux systèmes modèle de biofilm ont aussi un problème similaire et les revendications de ces données collectées doivent être tempérée par cette connaissance . Par exemple, il est possible que l'abondance des streptocoques peut être plus élevée que dans le biofilm en fait déterminée expérimentalement car de nombreuses espèces Streptococcus ont exceptionnellement bonnes aptitudes à se lier à des surfaces revêtues de salive 39.
Comme avec tous les systèmes modèle de biofilm, il faut être conscient des questions posées. Faou par exemple, ce système ne serait pas approprié pour des études longitudinales à long terme. Un système modèle tel qu'un réacteur constante de film de profondeur, un système SORBAROD, ou un réacteur de perfusion pourrait être plus approprié 40-42. Bien que, le problème de quantités limitées de la salive pour un système de modèle devient un problème car ce ne sont pas des conceptions à base de microfluidique. Dans une lumière semblable si, le système Bioflux décrit ici peut également être adapté pour les études de biofilms dans d'autres environnements où les fluides biologiques ne sont disponibles qu'en petites quantités. Par exemple, cela pourrait comprendre urine et exsudat de la plaie.
En conclusion, comme avec ne importe quel système de modèle in vitro, il faut être conscient des forces et des faiblesses du système microfluidique pour la croissance des biofilms buccaux. Bien que le système microfluidique est sans doute germane de l'environnement et permet le développement de biofilms qui sont de composition similaire à la situation in vivo, il ne est pas the même que la situation in vivo et ne sera probablement jamais l'être. Un système de modèle de laboratoire est seulement aussi bon que ses hypothèses et alors que le système microfluidique a de nombreux chevauchements avec conditions à l'intérieur de la cavité buccale humaine, des facteurs tels que les effets basés sur l'hôte et biotique externe et les défis abiotiques (par exemple par boire et manger) ne peuvent pas être facilement répliqué. Il est clair, cependant, que la nature à haut débit ainsi que la qualité microbiologique de l'environnement et des chevauchements avec la situation orale dans le monde réel en font un système microfluidique séduisante pour faire des prédictions avant de se engager dans des études cliniques défis logistiques.
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Acknowledgments
Les auteurs remercient William Nance (Université du Michigan) pour l'aide à la formulation des protocoles de croissance du biofilm et John Battista (Fluxion, San Francisco, CA) pour obtenir des conseils concernant les questions technologiques relatives au système Bioflux. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH: R21DE018820 à la procréation assistée) et de l'Université du Michigan fonds de démarrage à la procréation assistée
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Dithiothreitol (White Crystals or Powder/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Sorval ultracentrifuge (SS-34 compatible) | Thermoscientific | Unit-dependent | |
| Thermo Scientific SS-34 Rotor | Thermoscientific | 28-020 | |
| Thermo Scientific Type 1 Reagent Grade Deionized Water | Thermo Scientific Inc | 23-290-065 | |
| Nalgene Rapid-Flow Filter Units and Bottle Top Filters, PES Membrane, Sterile. | VWR | 73520-986 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific Inc | NC0542269 | |
| BioFlux microfluidic system | Fluxion | Bioflux 200 system | |
| Bioflux 24-channel plate | Fluxion | 910-0004 | |
| PBS (Gibco) | Thermo Fisher Scientific Inc | 10010023 | |
| LIVE/DEAD stain (Invitrogen) | Invitrogen | L7012 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Lecia | SPE or eqivalent system | |
| Epifluorescence Microscope | Multiple choices | Multiple choices | |
| Pyrosequencing facilities | Multiple choices | Multiple choices | |
| Decon SaniHol 70 Ethanol Solution | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
| Ultra Low Temperature Freezer -80 °C | Multiple choices | Multiple choices | |
| Tips (20, 200, and 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Single Channel Variable Volume Pipettors (20, 200, 1,000 μl) | Multiple choices | Multiple choices | |
| Software | |||
| Bioflux dedicated software | Bioflux | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| Leica SPE | Leica | ||
| ImageJ | Freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) | ||
| COMSTAT/COMSTAT 2 | Freeware (http://www.comstat.dk/) | ||
References
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