We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.
The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed “enteroids” when derived from small intestine and “colonoids” when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.
Fodret epitelet i mag-tarmkanalen är i ständig förnyelse. Denna process utlöses av proliferation av tarm stamceller (ISCs) som kontinuerligt producerar avkomma att snabbt byta tarmepitelet som det visar över. Den proliferativa avdelning som innefattar de ISCs begränsas till botten av kryptor. De ISCs ger upphov till avkomma som så småningom differentiera till absorberande eller sekretoriska härstamningar. Utflyttning av kryptan och på villus eller ytepitelet, celler differentierar progressivt när de vandrar uppåt innan exfoliering in i lumen 1. ISCs ger upphov till alla intestinala epiteliala celltyper inklusive enterocyter, microfold celler, enteroendocrine celler, bägarceller, tuftade celler och Paneth celler. Kolon präglas av långsträckta kryptor består mestadels av kolonocyter och gobletceller, med spridda enteroendocrine och tuftade celler 2.
Ex vivo cultida system utgör lovande verktyg för att studera ISC underhåll och tarmvävnad homeostas. Det är dock svårt att förlita sig på vävnadsteknik odlings som fysiologiska förhållanden inte är fullt reproduceras och epiteliala mikromiljö ofta förändras 3,4. En stort framsteg i ISC fältet var inrättandet av vävnadsodlingstekniker för att bibehålla och utöka individuella murina ISCs använder definierade tillväxtfaktorerna för att ersätta den normala tarmnischsignaler. Långsiktiga odlingsbetingelser beskrevs av Sato et al., Där enstaka kryptor eller isolerade stamceller från tarmepitelet växa för att bilda 3-dimension epiteliala strukturer inklusive flera crypt-liknande domäner 5-7. Dessa tredimensionella strukturer genomgår klyvningshändelser att kontinuerligt expandera. Intressant är alla tarmcelltyper som är specifika för vävnaden ursprungs produceras och som är väl strängsprutas till en lumen 8. Använda modifieringar av detta system, epitelialorganoids kan genereras från magsäcken, tunntarmen och tjocktarmen. Mer specifikt, epiteliala organoids från tunntarmen är enteroids 9, och de från kolon är colonoids 9,10. Dessa epiteliala organoid kultursystem har använts för att testa förmågan hos isolerade enstaka celler för att fungera som stamceller in vitro, sålunda testa "stemness" av isolerade celler 5,6,10-15. Andra forskare har använt både enteroids och colonoids att studera funktionen hos individuella epitelceller 16-21. Sålunda kan enteroid och colonoid kulturer användas för att utvärdera både stam- och icke-stamcell funktioner och ge nya insikter i grundläggande cellulära interaktioner inom tarmarna.
Under 2011, Sato och kollegor genererade långtidsodling av epiteliala organoids härrör från människans tunntarm och tjocktarm 22,23. Förutom skillnader i mediesammansättning, mänskliga epitelceller enteroidsoch colonoids uppvisar samma funktioner som sin murina motsvarighet. Vidare kan de genereras från sjuka vävnader såsom Barretts esofagus, adenom eller adenokarcinom, och cystisk fibros 22,24. Mänskliga enteroids utgör ett värdefullt system för att studera tarmstamcells och epitelial mucosal biologi och fungera som ett nytt experimentellt system för att studera både normal och onormal Gastrointestinalfysiologi 3.
Här beskriver vi metoder för att etablera enteroids och colonoids från human tunntarm och kolon kryptor (Figur 1). I detta metod översyn, betonar vi kryptan samling från hela vävnad och biopsier. Vi sammanfatta kulturformer som är väsentliga för framgångsrik tillväxt och underhåll av mänskliga enteroids och colonoids och möjliga experimentella strategier som genomförs av den här modellen.
Denna metod ger ett komplett system återger intestinala epiteliala härstamningar och epiteliala dynamik som utgör ett användbart verktyg för att studera tarm epitelial biologi. Den metod som presenteras här var anpassad från den ursprungliga murina studie av Sato och Clevers 22 som effektivt leder mänskliga enteroids och colonoids. Här, plockade vi manuellt upp kryptor med microdissection att undvika cellulära föroreningar. Denna metod tillåter en direkt visualisering av kryptor och leder till konsekvens övertid jämfört med den ursprungliga kryptan samlingen av "skaka". Andra grupper utvecklat liknande tekniker använder något olika metoder speciellt ersätter kelering med EDTA med kollagenas 25. Förutom skillnaderna i kryptan samling, dessa tekniker använder en definierad media som krävs för att odla mänskliga enteroids i kultur 22. För att öka tillväxteffektivitet vid krypta sådd, vi lägger en GSK3 hämmare (CHIR99021)för de två första dagarna 12.
Hanteringen av vävnaden eller biopsier är viktigt och kryptan isoleringen bör utföras så snart som vävnaden anländer i labbet. Emellertid kunde försenad crypt isolering och odling utföras upp till 24 h efter vävnadsuppsamlings (data visas ej) som tidigare beskrivits för murin vävnad 26. Den tarmvävnad bör placeras i ett koniskt rör helt fylld med DPBS för att undvika störningar vävnad och bör hållas vid 4 ° C. Den fördröjda preparatet möjliggör vävnads sjöfarten men temperaturvariationer bör undvikas under transport. Den totala tid som krävs för den initiala kryptan pläteringen är ca 2 h med 15 till 30 min för att bearbeta vävnaden och 1-2 h för att isolera och plattan kryptan. Den microdissection av vävnaden är en kritisk faktor och predikat i en ren krypta beredning. Dock är det möjligt kryptan frisättningen hand skakar som beskrivs i olika protokoll 22,23.
Trots likheterna med den murina enteroid (enteroids) systemet, de mänskliga enteroids kräver specifika molekyler för att stärka och behålla sin tillväxt över tiden. Tillväxtfaktorerna är EGF, Noggin, R-spondin används på samma sätt som de murina epiteliala organoids. Dock är kritisk användning av Wnt-3A. Vi noterade att bildandet liksom tillväxteffektiviteten är större med användning av en Wnt-3A konditionerat medium än det humana rekombinanta proteinet. Åtföljande vi visat förbättrade odlingsbetingelser med användning av en inhibitor av glykogensyntaskinas 3 (CHIR99021) 12. Rekombinanta tillväxtfaktorer skulle kunna ersättas med Wnt-3A, R-spondin och Noggin rade-media. En Wnt-3A-uttryckande L-cellinje är kommersiellt tillgängliga (ATCC). Andra grupper har utvecklat R-spondin 1- 23,27, Noggin- 19, och Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 uttrycker cellinjer. Två småmolekylära hämmare används i kulturen migdia och är nödvändiga för att upprätthålla kulturen 29. A-83-01 är en selektiv hämmare av transformerande tillväxtfaktor β och Aktivin / Nodal receptorer (aktivin-liknande kinas 4, 5, 7) och SB202190 är en p38 mitogenaktiverat proteinkinas-inhibitor (MAPK). Båda hämmare har använts respektive att upprätthålla mänskliga inducerade pluripotenta stamceller självförnyelse och upprätta mänskliga naiva pluripotenta stamceller 30-32. Också nikotinamid, en föregångare till nikotinamidadenindinukleotid, krävs för att bibehålla enteroids och colonoids expansion i ett långsiktigt sätt 22,29.
Den EDTA kelering är ett viktigt steg eftersom det avgör avkastningen från kryptan preparatet. Vi har varit framgångsrika med 2 mM EDTA-behandling. Däremot kan EDTA koncentrationen ändras från 2 mM till 15 mM angående vilken typ av vävnad. I det fallet har tid för inkubation att bestämmas empiriskt. Efter den inledande plätering, kommer kryptan runda-up och så småningom bildar enteroids. Men de enteroids eller colonoids visar ofta en "stam" fenotyp genom att bilda sfärer med liten eller ingen differentierade celler. I så fall kan differentiering initieras genom att dra tillbaka Wnt-3A, nikotinamid och p38 MAPK hämmare. Användningen av Notch-hämmare såsom DAPT eller DBZ hjälper förbättra differentiering inom enteroids 22.
Denna modell rekapitulerar tarmfysiologi med ständiga crypt-spirande händelser som härrör från en stamcells samt villus-liknande epiteliala domäner som innehåller både absorberande och sekretoriska differentierade härstamningar. Intressant, fungerar detta system innehåller inga mesenkymala celler och använder specifika medier villkor att uppfylla nisch signalkrav.
Liksom den murina modellen kan humana enteroids genereras från isolerade tarmepitelceller för att testa förmågan för dessa celler att fungera som en stamcell. SeveRAL studier har använt kluster av differentieringsmarkörer (CD44, CD24 eller CD166) och EPHB2 positiva celler att anrika celler med stamceller egenskaper 12,23,33. Tillsammans utgör dessa studier visar nyttan av mänskliga enteroids kulturer för att testa stemness. Andra forskare använder denna modell för att undersöka tarmsjukdomar såsom smittdiarrésjukdomar, cystisk fibros eller kolorektal cancer 22,34-37. Dessa studier visar att mänskliga enteroids utgör en tillförlitlig modell mänsklig sjukdom med en möjlighet att gå mot en personlig screening. Mänskliga enteroids kan genetiskt modifierade med hjälp av DNA-transfektion eller infektion med viruspartiklar 38. Detta ger ett kraftfullt verktyg för att studera genspecifika funktioner inom de mänskliga epitelceller organoids eller korrigera genetiska mutationer. Nyligen Schwank och kollegor visade möjligheten att redigera genomet med CRISPR / Cas9 systemet och korrigera mutationen på CFTR genen orsakar acystic fibros 24. Mänskliga enteroids utgör ett värdefullt system för att studera tarmstamcells och epitelial mucosal biologi och fungera som ett nytt experimentellt system för att studera både normal och onormal gastrointestinal fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).
Name of Reagent | Company | Catalog Number |
Dulbecco’s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS) | Life technologies; Gibco | 14190-144 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 |
Sorbitol | Fischer Scientific | BP439-500 |
Sucrose | Fischer Scientific | BP220-1 |
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V | Fischer Scientific | BP1600-100 |
Gzntamycin/Amphotericin B solution | Life technologies; Gibco | R-015-10 |
Wnt-3A conditionned medium | in house | – |
Advanced DMEM/F12 | Life technologies; Gibco | 12634-028 |
HEPES 1M | Life technologies; Gibco | 15630-080 |
GlutaMAX (glutamine) | Life technologies; Gibco | 35050-061 |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies; Gibco | 15140-148 |
N2 Supplement | Life technologies; Gibco | 17502-048 |
B27 Supplement | Life technologies; Gibco | 17504-044 |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G |
Nicotidamide | Sigma-Aldrich | N0636 |
Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix) | Corning | 356231 |
human recombinant Noggin | R&D | 6057-NG/CF |
human recombinant R-Spondin | Preprotech | 120-38 |
human recombinant EGF | Sigma-Aldrich | E9644-.2MG |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
A-83-01 | Tocris | 2939 |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-5MG |
human [Leu]15-Gastrin 1 | Sigma-Aldrich | G9145-.1MG |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 |
Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 |
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme) | Life technologies; Gibco | 12605-010 |
Fetal Bovine Serum | Life technologies; Gibco | 10082-147 |
CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium) | Life technologies; Gibco | A13713-01 |
L Wnt-3A cell line | ATCC | CRL-2647 |
Renilla luciferase assay | Promega | E2710 |
human recombinant Wnt-3A | R&D | 5036-WN/CF |
HEK293 TOPflash cell line | – | – |