Summary
使用流式细胞仪（FCM）外囊泡（电动车）的测量许多不同的方法存在。确定最合适的方法时使用的几个方面应予以考虑。两个协议用于测量电动车使用的是单独的检测或珠为基础的方法介绍。
Abstract
胞外囊泡（电动汽车）的体液中是高度地参与细胞 - 细胞通讯而有助于调节生物过程的一个不同的范围中找到的小，膜衍生的囊泡。使用流式细胞仪（FCM）电动车的分析已经非常困难，由于其体积小，缺乏积极的兴趣标记离散人口。方法EV分析，而在过去十年显着改善，仍处于进展中的工作。不幸的是，没有任何一个尺寸适合所有的协议，并确定最适当的方法使用时的几个方面必须加以考虑。这里介绍几种不同的技术来处理电动车和两个协议使用两种独立检测或珠为基础的方法分析了电动车。在一个合理的˚F这里描述将协助消除抗体聚集体在商业制剂中常见的方法中，增加信噪比，以及设置门ashion最小化检测的背景荧光。第一协议使用一个单独的检测方法，该方法是特别适合用于分析大量的临床样品中，而第二协议使用基于珠子的方式来捕获和检测小电动汽车和外来体。
Introduction
胞外囊泡（电动汽车）的体液中是高度地参与细胞 - 细胞通讯而有助于调节生物过程的一个不同的范围中找到的小，膜衍生的囊泡。使用流式细胞仪（FCM）电动车的分析已经非常困难，由于其体积小，缺乏积极的兴趣标记离散人口。方法EV分析，而在过去十年显着改善，仍处于进展中的工作。不幸的是，没有任何一个尺寸适合所有的协议，并确定最适当的方法使用时的几个方面必须加以考虑。这里介绍几种不同的技术来处理电动车和两个协议使用两种独立检测或珠为基础的方法分析了电动车。在一个合理的˚F这里描述将协助消除抗体聚集体在商业制剂中常见的方法中，增加信噪比，以及设置门ashion最小化检测的背景荧光。第一协议使用一个单独的检测方法，该方法是特别适合用于分析大量的临床样品中，而第二协议使用基于珠子的方式来捕获和检测小电动汽车和外来体。
电动汽车，也被称为微粒，是在参与细胞-细胞通讯而这有助于调节生物过程1的各种各样的体液发现小，膜衍生的囊泡。通过各种表面标记物和/或生物材料直接转移表达，电动汽车能够改变受体细胞的功能发挥要么激活或抑制细胞间通讯2角色- 4。在临床上，血小板衍生的电动汽车已知具有强抗凝血活性5，而另一些已被证明有助于广泛的条件下，从促进肿瘤metasta矽统6〜防止疾病7。电动车可分为较小类别的细胞衍生囊泡诸如外来体和微泡（MVS），这取决于它们的尺寸和产生8的机制。细胞衍生的小泡的亚群的命名法继续进行的辩论8,9的话题，但是，外来体通常被描述为小，来自内体的融合与质膜派生40至100纳米的颗粒，而MV的是大100〜1,000纳米粒子脱落质膜10的形成。这里，一般的术语“电动汽车”将被用来指所有类型的细胞外生物囊泡由细胞释放。
从全血中电动车辆的隔离是一个多步骤的过程和许多不同的处理的变量已被证明影响的EV内容，包括贮存温度和持续时间11,12，抗凝血剂/防腐剂使用13和离心法使用14。有必要对这些变量的标准化，导致血栓与止血科学和标准化委员会（SSC ISTH）进行正常的血液处理和EV隔离程序15,16由国际协会的建议，但存在着研究人员之间的最优协议没有达成共识使用12。然而，大多数人认为，这严格控制分析前变量是准确的和可重复的数据是至关重要的。
为了分析电动汽车中，研究人员已利用各种方法，包括透射电子显微镜17，扫描电镜18,19，原子力显微镜，动态光散射20,21和蛋白质印迹22,23。而FCM是选择用于许多研究者9,24的方法- 26由于其高吞吐量能力，使用流式细胞仪电动车辆的分析已经32 -由于其规模和缺乏独立阳性群体27个老大难问题。相比细胞的分析，对电动汽车的结果1）较少的荧光由于每个颗粒抗原的数量越少发射的小尺寸和后染色洗涤2）有限的可行性，这是必要的，以减少背景荧光。研究人员共同面临的挑战包括免疫球蛋白聚集27,28和抗体29的自聚集所产生的信号。此外，较长的处理时间和冗长的洗涤/分离过程中使用的许多当前的协议33,34需要多天时间承诺来分析少量的样品，使它们小于适用于高通量应用。一些研究人员干脆放弃洗涤步骤，使传统上使用的FCM阴性对照，如荧光减一（FMO）及抗体亚型无用的准确评估BACkground荧光30。
我们的协议处理，可以阻碍电动车的正常的FCM分析三个共同的问题：从抗体的聚集体和其它非囊泡，难以除去未结合的抗体，并且缺乏明显的阳性群体所产生的信号。此处所描述的技术将帮助消除抗体聚集体在商业制剂中常见的，增加信噪比，并以合理的方式，最大限度地减少检测的背景荧光设置栅极。两种不同的检测方法是在这里提出：在第一协议使用的各检测方法，该方法是特别适合用于分析大量的临床样品中，而第二协议使用珠为基础的方法来捕获和检测小电动汽车和外来体。
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Protocol
注：以下协议已符合已执行与人类福祉所有机构，国家和国际准则。所有的人的主体样本下机构审查委员会（IRB）批准的协议，并与主体的知情同意测试。
1.方法A：个别检测方法
电动汽车的血液采样/隔离1.1）处理
- 抽取血液从供血者/病人到使用以下2步差速离心协议含1.5毫升ACD-A液等立即适合抗凝和过程（在30分钟内最多）两个10毫升玻璃试管。
注意：此协议将从合并〜17毫升的抽血收率约贫血小板血浆（PPP）的10毫升如果有更多的或更少的PPP是需要的，血液收集管的数量可以相应地调整。 - 离心样品在1500×g离心在室温10分钟到等离子体从血沉棕黄层和红细胞中分离出来。转让1.2毫升等分血浆上清至1.5 ml离心管，小心不要打扰含棕黄色外套和红细胞的底层。
- 旋转以13,000×g离心10分钟，在室温以除去血小板和大细胞碎片。小心转移PPP，留下200微升，以避免干扰颗粒，并添加在PPP到一个新的试管中。
- 在这一点上，立即使用PPP用于分析或于1.0ml等份转移至新的1.5毫升离心管中并储存在-80℃下长达两年以后的分析（参见图1A，用于总览）。
- 如果需要纯化的电动车进行功能试验，转印6毫升PPP协议到超速离心管中，并添加28的0.2微米过滤的磷酸盐缓冲盐水液（PBS）中。自旋用于使用配备吊桶式转子超速离心机以100,000×g离心60分钟，在RT。吸上清，重悬EV像素让在1.5ml培养基。
注：为获得最高的重现性，血液样品应尽可能一致处理来自捐助者捐助。任何变化的EV隔离方法能显著影响检测电动车辆的数量和类型。
1.2），准备样品进行分析
注意：从这个角度上，该步骤说明高通量协议分析12个样品14标记的3板。然而，在这里可以使用的抗体的其它组合;该协议可以适于通过为那些感兴趣代建议的标记物来研究其它的EV种群。
- 从冰箱中取出12个样品（如果储存在-80℃）和解冻，在37℃。
- 吸取内容上下几次混合。从每个样品中取出320微升，并加入到96孔板的顶行。
注：宽度可调多井吸管是这和整个屁股许多其他步骤非常有帮助唉，分析多个样品尤其是当一次。
1.3）染色EV样品
- 染色前，将过滤所有抗体（ABS）以除去聚集物，这可能会导致阳性信号。
- 要使用在各3片的结合的抗体成使用固定角度单速离心机（〜750×g离心）在RT 2分钟分开0.22μm的离心过滤管和离心机，或直到所有的抗体混合物通过过滤器已通过和无抗体的液体保留在过滤器的表面上。每次使用前店抗体鸡尾酒在冰箱里长达两个星期，但再次过滤器。
- 加过滤抗体混合物的合适量，以每孔在第2行（ 例如 ，在面板样品I的染色的2微升每Ab的，所以共有12微升过滤抗体鸡尾酒的是，每孔加入到行2）。请参考图1B为建议的板图的轮廓。重复这些除s至下方，如果更多的面板上运行的行（在此，加入8微升/孔的第二小组鸡尾酒到行3和11微升/孔的组III鸡尾酒至4行的是指材料清单用于特定面板信息）。
- 使用多通道移液管，混合在PPP样品中第1行上下和从孔中第1行中的行转移100μl到井2.混合上下。变化的提示和重复，转移100μl的从第1行至行3和4孵育在4℃下进行30分钟。
1.4）洗涤MV样本
- 除去96孔板在4℃，并转移至生物安全柜中。使用多通道移液管，添加220微升PBS /孔的行6-8（用于冲洗/清洗含有染色PPP协议的孔）。
- 传输的每一个的内容以及使用宽度可调多管移液器（对于12个样本的预标记的离心过滤管，用3片的抗体，12×3 = 36过滤管将需要）。利用同样的技巧，从洗行取出200微升PBS，并添加到从PPP只是删除了相应的井。
- 混合上下冲洗孔和冲洗液转移至向其中PPP的先前溶液中加入相同的过滤器。关闭顶部离心式过滤器。变化的提示。
- 重复此过程，与剩余的染色样品，直到所有的染色样品的PPP已经转移连同它们漂洗溶液至离心过滤器。
- 转移离心过滤器以一个固定的转子离心机和旋转，在850×g离心3分钟，在RT。
注：确保没有液体留在过滤器顶部。离心后，将过滤器应显示为“干”的，顶部没有可见的流体层残留。而不太可能的，一定的PPP样品可能需要更长的离心时间，以有效地移动穿过所述过滤器。 - 取下离心过滤管，并返回到生物安全柜中。使用多通道移液管，重悬过滤器的顶部在300微升PBS中。转移悬浮内容预先贴标签的试管立即FCM分析。
注意：要保持吸液管柱塞凹陷样品间一致的力和数量，以避免样品到样品的变化是非常重要的。这最好应使用电子移液器已编程到吸管上下一个特定体积进行（ 例如 ，280微升）的每个采样时间（ 例如 ，8倍）的具体数量。
1.5），流式细胞仪设置
- 打开FCM软件。在此之前实验设置，使用的仪器设置珠（以下制造商的说明）进行日常仪器校准和设置。
- 如果EV样本已染色与多于一个的抗体和多个荧光染料都可以一次进行测量，计算出的补偿值如下：
- 加入2滴赔偿珠预标记的管（1管为每个荧光染料缀合的抗体）以及添加抗体的推荐量。添加2滴负补偿珠到另一个管作为未染色补偿控制来使用。
- 孵育在4℃下进行30分钟，用PBS重悬洗于400μlPBS中。
- 使用流式细胞仪的软件流程包括与仪器，运行每个补偿管荧光灯调整电压，将每个峰值约10 4 5数十年来规模。确保该荧光峰是最高（最亮）在其自己的信道的荧光相比，所有其它信道，并在必要时再调整的荧光参数的电压。运行每个单独染色补偿管，捕捉每管至少有5,000个事件。
- 选择标签“实验”，然后选择“补偿”，然后选择“计算赔偿”申请补偿值的所有样本。
- 在运行的0.22微米过滤的PBS中的管，调整FSC和SSC电压到该排除多数的背景噪声（ 即 ，恰好低于该事件的发生率超过5个事件/秒的电压阈值）的最高值。
- 接下来，运行含有0.2微米的管 - 1.0微米的珠子稀释在PBS中，如果必要的。在一个FCS与SSC的情节，画周围的珠子群门之间0.2微米和1.0微米捕获事件。可替代地，在一个SSC-H的直方图，画出一个门，以包括所有的事件比1.0微米小球要小。
- 流式细胞仪的流速为“Lo”（约8-12微升/分钟）。使用珠管（或含有珠已知浓度等管）调整流式细胞仪流速盘，直到前夕NT率达到约200次/秒。读取所有样品管在相同的流速，并使用在以后的实验中相同的珠浓度，以确保流速保持运行之间是一致的。
- 运行在PBS中稀释彩虹荧光发色粒子的管。获得5000事件。记录对FSC，SSC和每个颜色通道的平均强度值。使用这些值来调整在以后的实验中的电压，以确保荧光强度保持实验之间保持一致。
1.6）样品阅读
- 流式细胞仪的流动速率设定为“Lo”的（约8-12微升/分钟）和运行每个样品完全1或2分钟。
- 第一读取后，10％的加20微升NP-40的每个样品，移液器上下，并重新读取为相同量的时间（1或2分钟），以允许在检测到的阳性事件的减法在相同的时间内裂解样本。
注：这是非常小鬼ortant该样品用吸管，而不是涡流混合。根据我们的经验，涡旋可能会导致一些抗体的自聚集，导致EV-模仿阳性事件。 - 一旦所有样品已阅读，出口用于使用FCM分析软件进一步分析所有.fcs文件到一个单独的文件。
1.7）数据分析
- 打开FCM分析软件。导入所有的.fcs文件到一个新的实验文件。
- 打开珠只管。在FSC-A对SSC-A地块，周围画一个栅极之间0.2微米和1.0微米大小的所有珠子。这是EV栅极。拖动来添加到所有样品。
- 使用裂解的样品作为阴性对照，绘制在门的背景荧光中使用的各荧光通道的边缘。拖动荧光门到每个相应的未裂解的样品的EV栅极。
注：在这一点上也很有研究双荧光双参数图。火箭形状双阳性象限（ 见图8），特别是如果标记物是已知的，以驻留在无关的细胞类型，可指示由聚集或其它囊泡-模拟事件的假象。 - 对于每一个荧光标记物，减去从非裂解样品中的事件数的裂解样品中的事件数。任选地，由电动车辆的总数除以该号码非裂解的EV栅内以获得％正值。
2.方法B：磁珠法
电动汽车的血液采样/隔离2.1）处理
- 请参阅方法A（1.1节）中描述的血液处理方法。
2.2），准备样品进行分析
- 如果需要的话，分馏PPP或超速离心电动车到外来体和微泡。加入250微升PPP或超离心电动车到0.22微米的离心过滤器，并转移到一个固定的转子离心和旋转750 Xg下在室温下2分钟。
注：确保没有液体留在过滤器顶部。离心后，将过滤器应显示为“干”的，顶部没有可见的流体层残留。而不太可能，某些样品，可能需要稍长的离心时间为流体有效地移动穿过所述过滤器。 - 在2ml洗未涂覆6微米的聚苯乙烯小珠（ 例如 ，负ABC珠）用2X RPMI培养基，重悬。加入6000珠子每个FACS管。阴性对照管中，单独添加400微升RPMI培养基到珠。所有其他管，加入200μlPPP或电动车超速离心（或其部分）和200微升RPMI媒体。
- 调整所有管的终体积为400微升用培养基孵育过夜，在4℃在振荡器上。
- 第二天早上，洗珠用2ml培养基。吸脱上清。
- 用5％的牛血清白蛋白（BSA）的培养基（400微升）处理3小时，在4方框＃176; C对振动筛。
- 用2ml培养基洗涤珠。吸并重新悬浮颗粒在100微升介质。
2.3）染色EV样品
- 过滤所有的抗体。使用方法A中使用的相同的抗体的面板，或者如果需要的话，只要它们的荧光染料是彼此相容创建抗体的不同组合。
- 要使用在单个面板结合的所有抗体为0.22μm的离心过滤管。离心机利用固定角单速离心2分钟，或直至所有的抗体混合物的已通过过滤器和无抗体的液体保留在过滤器的表面上。
- 添加过滤抗体混合物适当的音量，以所有管和孵育30分钟，在4℃。
- 用2ml的培养基，重悬在400微升的媒体上流式细胞仪洗珠并立即运行（或在同一天之内）。
2.4），流式细胞仪设置和样品阅读
- 打开FCM软件。在此之前实验设置，使用的仪器设置珠（以下制造商的说明）进行日常仪器校准和设置。
- 如果EV样本已染色与多于一个的抗体和多个荧光染料都可以一次进行测量，计算出的补偿值如下：
- 加入2滴赔偿珠预先标记的管（1管各荧光标记的抗体），并添加抗体的推荐量。添加2滴负补偿珠到另一个管作为未染色补偿控制来使用。孵育在4℃下进行30分钟，用PBS重悬洗于400μlPBS中。
- 用FCM软件，运行每个补偿管荧光灯调整电压将每个峰值约10 4 5数十年来规模。确保该荧光峰是最高（最亮）在其自己的信道的荧光相比，所有其它信道，并如果需要再次调整荧光参数电压。运行每个单独染色补偿管，捕捉每管至少有5,000个事件。
- 选择标签“实验”，然后“补偿”，然后“计算赔偿”申请补偿值的所有样本。
- 更改FSC和SSC电压参数，登录规模和选择每个通过流式细胞仪（FSC = 200和SSC = 200）所允许的最低门槛。
- 运行样品，门上的单珠人口和收购这个门2000的事件。出口.fcs文件。
- 用FCM分析软件分析.fcs文件。门上的单珠。计算几何平均荧光强度（MFI）针对每个荧光染料和与阴性对照的MFI进行比较。
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Representative Results
图1概述了用于分离和检测用任一胎圈基法或个体的检测方法电动车辆的整体的处理方案。个别检测用流式细胞仪可以很好地用于分析较大的电动车，但大多数流式细胞仪不能够单独检测颗粒小到外来体电动车。甲珠为基础的方法，能够检测小电动汽车，但是，也有使用这种方法相关联的缺点，如表1所述。通常，使用超速离心（有或没有加入蔗糖梯度分级分离过程的）电动汽车的隔离建议在需要对功能测定电动汽车。超速离心去除杂质，包括血清蛋白，并从等离子，其可以影响功能的实验结果的其他可溶性污染物。然而，超离心是耗时的并且可能改变的EV数量和质量12。
“>预期结果为两个检测测定法描述于图2-3。对于各个检测测定中，所述裂解控制（底行， 图2）用于设置门，用于相应的非裂解的样品（顶行， 图2）。大多数事件应属于EV栅内。象限门不应揭示双阳性事件时在比较的两个标记物通常不会在同一细胞中发现的合适的双参数曲线在图2中示出了标记物CD108a和CD235a ，这是已知的共存于细胞2红血细胞标记物。在这里，电动汽车，半数以上的阳性事件是阳性的两个标记，如预期的，在以相同的方式，公知的细胞表面标记，以驻留在同一细胞应显示出类似的双阳性的模式对电动汽车的中心双参数图显示的是已知不共存于细胞两个标记的EV表达。在该分析CD235a的（一个红色布卢Ð细胞标记物）和CD41a（血小板标记物），所述电动车辆显示鲜明，独立的，积极的群体，这是意料之中的，因为它们来自不同的细胞类型。当溶解的，积极的事件应该消失。在一般情况下，裂解后剩余的任何阳性事件指示信号从非囊泡粒子，聚集体，和/或耐洗涤剂电动车未来的存在。 图3示出了使用基于珠子的检测方法预期的结果。不像个体的检测方法，这些数据不能/不应该在双参数图观看。在上部散点图中，正和负群之间没有分离存在，并且事件出现在即使它们通常不会在相同的细胞类型中，由于这样的事实，这两种类型的电动车辆将结合到一对双阳性象限单珠。对于基于珠的检测方法中，数据被分析最好使用直方图叠加与阴性对照（中描绘的点图的下方）。我积极性s，使用的标记物的MFI（平均荧光强度）测定，并直接与该阴性对照的比较。如果样品为阳性，有问题的标记，其MFI将高于阴性对照。阴性对照为珠的方法是简单地珠用BSA封闭（没有电动车加），其已被染色以相同的抗体并洗涤沿着EV-包被的珠子。使用这两种方法预期的结果的比较可以看出，在图4中 。个别检测试验的正确评估EV表型的能力，在很大程度上依赖于正确的门控分离的背景荧光抗体阳性事件。因此，关键是要选择的阴性对照，大多数适当模仿/预测的背景荧光对于给定的样本。当彩色阅读电动车前未洗，常用阴性对照（ 例如 ，同型）不能准确预测的背景fluorescencE代表所有标记（ 图5A）。在这些情况下，如果洗涤不是一个选项，裂解样品趋向于更好地工作，用于预测的背景荧光。然而，当染色电动汽车读取之前被洗涤（用离心过滤，在这种情况下），这两个阴性对照（同种型和裂解样本）用于预测样品（ 图5A）的背景荧光很好地工作。应当指出的是，虽然所有的阴性对照的“工作”，裂解控制是优选的，因为它们提供关于样本的其他信息（ 例如 ，耐洗涤剂，非囊泡相关的事件和/或聚集体的存在下），该可能会导致非EV积极的信号和不当膨胀抗体计数。此外，同种型对照，有时是不可靠的，即使在洗涤后的样品， 如图5B所示 ，其中的染色样品具有比沾上匹配的同种型对照抗体相同的样品更少的阳性事件。 未经彻底除去未结合的抗体的，流式细胞点图的一些EV标记是几乎不可能的解释，显示为朦胧的荧光粒子的云层从其高度荧光的背景难以区别（ 图6，顶图）。洗涤使用离心过滤器的彩色样品增强了背景和正标记信号之间的间隔（ 图6，底部曲线）;然而，小型电动汽车和外来体可以通过过滤器的孔隙会丢失。
使用去污剂裂解步骤的揭示阳性，囊泡-模仿从免疫复合物的事件和蛋白质聚集21。当PPP被使用单独的检测，遇到不与裂解消失阳性事件分析是相当经常发生。这些耐洗涤剂的事件经常出现在单参数和双参数地块为可疑，高荧光对角线信号（ 图7）。在临床上，这些蛋白质复合物和/或不溶性免疫复合物在治疗患有各种疾病的21，更普遍的如类风湿性关节炎28，肾病综合征19，和系统性红斑狼疮29。因此，根据不同的研究的目的，可能希望包括或从analysis.Another方式对角线信号可以形成是通过涡旋样品，特别是后加入裂解试剂（ 图8）将其删除。样品始终被混合上下通过吸管，以防止聚集体的形成。
图1：用于分离和检测用任一胎圈基法或个体的检测方法电动车辆的整体处理方案。 （A）全血先加工成PPP。从再，PPP既可以使用超速离心，得到分离的电动汽车进一步处理或用作-是在各个检测或基于珠的测定法。建议板的地图为使用单独的检测方法的高通量样品的分析（B）的概要。 请这里查看这个数字的放大版本。
图2：预期结果为各个检测流式细胞点图显示裂解和未裂解的EV样品的代表性染色。值显示阳性事件的百分比。大多数事件属于EV栅内。在右双参数图所示的事件是在左侧的FSC / SSC门EV内。所述裂解的样品（底行）用于设置荧光基闸门的EA通道对应的（非溶胞）的样品。四门不应揭示双阳性事件时在比较的两个标记物通常不会在同一细胞中发现。在这里，双参数CD235a和CD41a图显示表达的红血细胞标志的电动车和那些表达血小板细胞标记之间有明显的分离。同样地，已知对驻留在同一细胞的细胞表面标记物应该显示双阳性的电动汽车上相似的模式。右双参数曲线图显示，有超过一半的CD235a阳性电动汽车也正为二次红血细胞（RBC）的标记，CD108a。当溶解的，积极的事件应该消失。裂解后剩余的阳性事件指示信号从非囊泡或耐洗涤剂颗粒和/或聚集体来的存在。
图3：使用基于珠子的检测的预期结果方法。流式细胞点图显示电动车耦合到珠，有代表性的染色相比，珠用BSA封闭，其作为阴性对照。值显示阳性事件的百分比。在右双参数图所示的事件是在左侧的FSC / SSC门珠粒内。珠子基于检测方法中，数据被分析最好使用直方图叠加与阴性对照（中描绘的点图的下方）。阳性是使用标记物的MFI（平均荧光强度）测定，并直接与该阴性对照的比较。
图4：使用珠与各个检测预期的结果的比较流式细胞点图显示电动车联接到珠（顶行）的代表性染色相比，电动汽车用单个检测（底行）的分析。事件在右图所示双参数图上左边的FSC / SSC珠门之内。
图5：在各个检测分析不同的阴性对照的比较值显示阳性事件的百分比。显示事件是FSC / SSC EV门之内。在没洗过与阴性对照（A）比较冲样本。同种型或裂解对照评价其在两个不同的标记物提供的背景荧光适当指示处于完全染色样品（底行）的能力。闸门的每个标记分别使用裂解的样品（顶行），然后复制到下面的行进行。染色与具有比样品染色无线更积极的事件的同种型对照的样品的洗涤样品使用后的污点过滤洗涤。（B）的实施例个实际的抗体。
图6：在各个检测后染色洗涤的影响值表示百分比和阳性事件的数量。显示事件是FSC / SSC EV门之内。 盖茨对每个样品分别使用各样品的裂解对方（是指前面的图对栅极设置在未洗涤VS洗涤样品未示出）制成。高背景荧光使得区分负面事件难（上图）阳性。当洗涤，然而，正人口显露作为未结合的荧光抗体的去除和背景荧光减少（底部曲线）。
图7：洗涤剂的裂解证实了非EV S中存在ignals，显示事件是FSC / SCC EV门之内。值显示阳性事件的百分比。染色的EV样品之前（左栏）中读取和加成洗涤剂（右列）的后，以确定所造成的免疫复合物和其他非EV相关事件阳性信号。
图8：涡旋引起的非电动的信号的出现表明事件是在FSC / SCC EV栅内。值显示阳性事件的百分比。染色EV样品前（左列）和另外洗涤剂（右列）后阅读。使用涡旋混合样本可引起的EV-模仿，对角线种群以形成（上排）。当轻轻混合上下用移液管，然而，形成这些人群，可避免（底行）。涡旋，不推荐用于混合，因为它可能会导致聚集的一些样品中，LEA鼎为对角线出现，积极的群体。在一般情况下，一个正栅极内的事件数量应溶解后没有增加。
| 珠基于检测 | 个别检测 | |
| EV尺寸 | 建议仅<100纳米 | 推荐> 100nm的唯一 |
| 时间 | 需要过夜培养 | 可以完成<1天 |
| 灵敏度 | 集群检测 | 单粒子探测 |
| 结果 | 定性 | 量 |
| 洗涤 | 简单，标准离心 | 需要离心过滤器 |
| 阴性对照 | 的BSA包被的珠 | 裂解样品 |
表1：正反两检测方法的利弊。
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Discussion
为隔离，治疗和电动汽车的分析两种不同的协议采用两种单独的检测或珠为基础的方式呈现。选择最适当的方法来使用并不总是直截了当，需要样品的理解被测试以及感兴趣的个体的亚群。而且，用于获取细胞仪的灵敏度，必须在选择最合适的方法可以考虑。通常情况下有使用的，而是相结合的方法提供了比单独使用任何一种方法的示例的详细信息没有一个最佳的方案。理想情况下，几种不同的隔离和检测技术，应首先为了开发一个定制的协议，它考虑到了个体细胞仪的性能相对于所研究的特定的EV人口评价。另一种隔离技术，包括超速，蔗糖密度分馏，免疫BEAD分离，色谱法，和亲和纯化12，而替代的检测方法包括扫描电子显微镜，透射电子显微镜，原子力显微镜，动态光散射，和免疫印迹8。通过组合不同的技术，在这里提出的方法可以适于以创建协议最适合用于研究各种感兴趣的EV种群。
在一般情况下，使用流式细胞仪可以很好地用于分析较大的电动车，但失去敏感性电动汽车变得越来越小电动车的各个检测。而各个检测在检测大电动汽车更一致，基于珠的检测是检测较大电动汽车和外来体更敏感较不敏感。较大的电动车可以很容易通过后期染色过滤清洗，并通过流式细胞仪检测单。较小的电动汽车和外来体，另一方面，没有检测到井单独使用流式细胞仪，并且更难以洗净后染色。珠捕获协议解决了这两个问题，让电动车可以很容易地清洗和多个电动车一起被测量打造检测用流式细胞大积极信号。然而，存在与使用该方法，如表1中概述的相关缺点。
当与较不敏感的细胞仪工作时，对于各个检测的能力是有限的。前的EV分析，流式细胞仪的灵敏度应使用珠大小从0.1-1.0微米的混合物来确定。流式细胞仪故障检测绝大多数低于1.0微米的颗粒会需要使用珠为基础的协议。高表达的标记正在使用的协议很容易检测。罕见群体有时容易使用单个粒子检测协议，而不是珠捕获协议来检测，但是，这可以取决于这样的变量而变化为：荧光染料的亮度，该样品的EV：珠řATIO，和EV轴承稀有细胞表面标记物的大小。在单个粒子检测的多个标记必须使用单独的检测方法。在基于小球的方法不能够个别的EV检测。因此，基于珠的协议将产生的数据在本质上更多的定性，而个体的检测方法将给予更多的量化数据。
一旦需要对下游应用电动汽车的其他分离技术必须被利用。在功能测定法中使用电动车辆应用3步差速离心协议中，由于血浆中的可溶性血清蛋白可以影响功能的实验结果进行超速离心。用于电动汽车的特性，但是，超离心，不推荐的，因为这增加的步骤可能会影响电动的质量和数量，由于高力施加在颗粒12。
各个检测协议其S用于高通量试验的优化everal关键步骤，包括：离心过滤器1）用于快速和有效地除去引起抗体聚集体阳性事件的执行，2）使用过滤器作为一个更实际的选择超速离心或蔗糖梯度分级分离用于从EV样品后染色，和3）利用去污剂裂解的作为阴性对照，它不仅揭示造成非电动汽车阳性事件，但提供了背景荧光的良好近似来区分正从绘图阴性群洗涤未结合的抗体大门。各个检测协议建议每当大量样品需要测试，因为它可以在一天中进行的，而基于珠的方法需要保温过夜。
每个协议中的阴性对照具有不同的优点，并根据该检测方法中使用的缺点。使用基于珠子的一个的一个好处SSAY的是，同样的单克隆抗体，可用于阴性和阳性管和相同的阴性对照可用于所有样品。个体的检测方法，而另一方面，需要单独的控制，以被读取所测试各样品。所使用的各检测协议阴性对照使用裂解的样品，这不需要额外的抗体的使用/消费，但不要求每个管被读取另外的裂解剂之后的第二时间。裂解对照具有能够识别可以归因于非囊泡相关事件阳性信号的比例的附加 的好处，如免疫复合物21。珠为基础的检测并没有从真正的电动汽车所产生的积极的信号，并从非囊泡所产生的那些之间的这种能力todistinguish。
该技术的局限性
虽然没有标准化的方法对电动汽车的隔离，差离心是EV研究者中广泛使用的技术。这里所描述的差速离心的方法是基于公共协议用于分离的PPP，通常需要10-20分钟以除去细胞1,200-1,500 XG之间的初始离心，随后10,000-13,000 XG之间的第二离心10-30分钟去除血小板35。本文所描述的协议使用离心1500 xg离心10分钟，随后离心以13,000×g离心10分钟。而通常需要的25,000-100,000 XG更大的力以沉淀电动汽车，一些较大的电动车可以与我们提出的差速离心协议除去。
高达90％的FCM检测以100,000×g离心丢失一小时超速离心电动汽车的（数据未示出）。离心较长时间应考虑，尽管小心翼翼，因为样品的成分，这可能产生不利影响。如果附加的处理是必要的˚F或表征研究中，过滤可以在两步离心后进行，以进一步分馏基于粒径样品（染色前）。类似于超离心，过滤可能导致的阳性标记事件高达50％的损失，高达90％的FCM检测总颗粒（数据未显示）。而增加的信噪比是明显的好处，更小的电动汽车的损失表示显著限制考虑任何洗涤或分离方法时。
最后，所用的抗凝血剂（ 例如 ，肝素，ACD，乙二胺四乙酸（EDTA）， 等等 ）的血液采集过程中可能会影响到的EV内容的质量和数量。而ACD已被证明是良好和可靠的抗凝血剂为我们的研究中，测试多个解决方案建议，以确保最合适的抗凝血剂的应用被选择。这是特别重要的，当电动汽车将在下游测定法中使用其中所使用可影响结果的抗凝剂。例如，一些抗凝血剂（ 例如 ，EDTA和肝素）是已知的干扰PCR反应，而其他（ 例如 ，茶碱，腺苷和潘生丁），已被证明能够抑制从片体12的EV释放。
方法EV分析，而在过去十年显着改善，仍处于进展中的工作。最终，用于分析电动汽车将取决于研究的最好的方法被进行，并提供给研究者的工具。
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Disclosures
作者有没有利益冲突披露。
Acknowledgments
笔者想感谢戴尔Hirschkorn从血液系统研究所对他的帮助与流式细胞仪的仪器设置。这项工作是由美国国立卫生研究院支持授予HL095470和U01 HL072268和国防部合同W81XWH-10-1-0023和W81XWH-2-0028。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
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