Summary
Existen muchos métodos diferentes para la medición de las vesículas extracelulares (SVE) utilizando citometría de flujo (FCM). Varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Se presentan dos protocolos para vehículos eléctricos de medición, usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas.
Abstract
Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Aquí se presentan son varias técnicas diferentes para vehículos eléctricos de procesamiento y dos protocolos para el análisis de los vehículos eléctricos usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. Los métodos descritos aquí se ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, el aumento de la relación señal-ruido y la configuración de las puertas en una f racionalashion que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. El primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.
Introduction
Extracelular vesículas (EVs) son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que son altamente involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos. Análisis de los vehículos eléctricos utilizando citometría de flujo (FCM) ha sido notoriamente difícil debido a su pequeño tamaño y falta de poblaciones discretas positivos para los marcadores de interés. Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. Desafortunadamente, no hay una talla única para todos los protocolos, y varios aspectos deben ser considerados al determinar el método más apropiado para su uso. Aquí se presentan son varias técnicas diferentes para vehículos eléctricos de procesamiento y dos protocolos para el análisis de los vehículos eléctricos usando la detección de individuo o de un enfoque basado en perlas. Los métodos descritos aquí se ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, el aumento de la relación señal-ruido y la configuración de las puertas en una f racionalashion que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. El primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.
Vehículos eléctricos, también conocidas como micropartículas, son vesículas pequeñas, provenientes de las membranas que se encuentran en los fluidos corporales que están involucrados en la comunicación celular y ayudan a regular una amplia gama de procesos biológicos 1. A través de la expresión de diversos marcadores de superficie y / o transferencia directa de material biológico, los vehículos eléctricos son capaces de alterar la función de las células receptoras para jugar ya sea activar o suprimir funciones en la comunicación intercelular 2-4. EVs Clínicamente, los derivados de las plaquetas se sabe que tienen una fuerte actividad anticoagulante 5, mientras que otros han demostrado que contribuyen a una amplia gama de condiciones, desde la promoción metasta tumorsis 6 a proteger contra la enfermedad 7. EVs se pueden clasificar en categorías más pequeñas de las vesículas derivadas de células tales como los exosomas y microvesículas (MVs), dependiendo de su tamaño y el mecanismo de la generación de 8. La nomenclatura de las subpoblaciones de vesículas derivadas de células sigue siendo un tema de debate en curso 8,9, sin embargo, los exosomas se describen generalmente como pequeñas, de 40 a 100 nm partículas derivadas de la fusión endosomal con la membrana plasmática, mientras que MVs son más grandes de 100 a 1000 partículas nm formadas por el desprendimiento de la membrana plasmática 10. Aquí, el término general "vehículos eléctricos" se utiliza para referirse a todos los tipos de vesículas biológicos extracelulares liberados por las células.
Aislamiento de los vehículos eléctricos de la sangre entera es un procedimiento multi-etapa y se han mostrado muchos diferentes variables de proceso para afectar el contenido EV, incluyendo la temperatura de almacenamiento y la duración 11,12, anticoagulante / conservante utilizado 13 ymétodo de centrifugación utilizado 14. Una necesidad de estandarización de estas variables ha llevado a las recomendaciones de la Sociedad Internacional de Trombosis y procesamiento de la sangre y de aislamiento EV procedimientos Hemostasia Comité Científico y Normalización (ISTH SSC) para su correcto 15,16, todavía no existe un consenso entre los investigadores sobre el protocolo óptimo para utilizar 12. La mayoría coincide, sin embargo, que las variables pre-analíticos muy controladas son cruciales para los datos exactos y reproducibles.
Para el análisis de los vehículos eléctricos, los investigadores han utilizado diversos métodos, incluyendo la microscopía electrónica de transmisión 17, microscopía electrónica de barrido 18,19, microscopía de fuerza atómica, luz dinámica de dispersión 20,21 y occidental blot 22,23. Mientras FCM es el método de elección para muchos investigadores 9,24 - 26 debido a sus capacidades de alto rendimiento, el análisis de los vehículos eléctricos utilizando FCM ha sidonotoriamente difícil debido a su tamaño y falta de poblaciones positivas discretos 27-32. En comparación con el análisis de las células, el pequeño tamaño de los EVs resultados en 1) menos fluorescencia emitida debido al menor número de antígenos por partícula y 2) la viabilidad limitada de lavado post-mancha, que es necesaria para reducir la fluorescencia de fondo. Los desafíos comunes entre los investigadores incluyen señales que surgen de agregados de inmunoglobulinas 27,28 y auto-agregación de anticuerpos 29. Además, los tiempos de procesamiento largos y largos procedimientos de lavado / aislamiento utilizados por muchos de los protocolos actuales 33,34 requieren compromisos de tiempo de varios días para analizar un pequeño número de muestras, haciendo que sea menos que ideal para aplicaciones de alto rendimiento. Algunos investigadores renuncian a un paso de lavado completo, haciendo controles negativos FCM utilizados tradicionalmente como menos fluorescencia uno (FMO) y isotipos de anticuerpos inútil para evaluar con precisión bacfluorescencia kground 30.
Nuestros protocolos abordan tres problemas comunes que pueden impedir el análisis FCM adecuado de los vehículos eléctricos: Las señales derivadas de los agregados de anticuerpos y otros no-vesículas, dificultad para eliminar el anticuerpo no unido, y la falta de poblaciones positivos perceptibles. Las técnicas descritas aquí serán ayudar con la eliminación de los agregados de anticuerpos que se encuentran comúnmente en las preparaciones comerciales, relación señal a ruido creciente, y el establecimiento de puertas de una manera racional que minimiza la detección de la fluorescencia de fondo. Dos métodos de detección diferentes se presentan aquí: el primer protocolo utiliza un método de detección individual que es especialmente adecuado para el análisis de un gran volumen de muestras clínicas, mientras que el segundo protocolo utiliza un enfoque basado en perlas para capturar y detectar los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas.
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Protocol
NOTA: Los siguientes protocolos se han realizado en cumplimiento de todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Todas las muestras de sujetos humanos se pusieron a prueba en virtud de una junta de revisión institucional (IRB) protocolo -aprobado y con el consentimiento informado de los sujetos.
1. MÉTODO A: Individual Método de detección
1.1) Tratamiento de Muestra de sangre / Aislamiento de vehículos eléctricos
- Extraer la sangre del donante / paciente en dos tubos de 10 ml de vidrio que contenían 1,5 ml de ACD-Solución A u otro anticoagulante adecuado y proceso inmediatamente (dentro de 30 min max) utilizando el siguiente protocolo de centrifugación diferencial 2-paso.
NOTA: Este protocolo producirá aproximadamente 10 ml de plasma pobre en plaquetas (PPP) de los combinados ~ 17 ml de sangre extraídas. Si se necesita más o menos PPP, el número de tubos de sangre recogida se puede ajustar en consecuencia. - Centrifugar las muestras a 1500 xg durante 10 min a RTpara separar el plasma de la capa leucocitaria y glóbulos rojos. Transferir 1,2 ml alícuotas del sobrenadante de plasma a 1,5 ml tubos de centrífuga, teniendo cuidado de no molestar a las capas inferiores que contienen la capa leucocitaria y glóbulos rojos.
- Giran a 13.000 xg durante 10 min a TA para eliminar las plaquetas y fragmentos de células grandes. Transferir cuidadosamente el PPP, dejando atrás 200 l para evitar alterar el sedimento y añadir el PPP a un nuevo tubo.
- En este punto, utilice PPP inmediatamente para su análisis o transferencia en alícuotas de 1,0 ml a los nuevos tubos de centrífuga de 1,5 ml y se almacena a -80 ° C durante un máximo de dos años para su posterior análisis (consulte la Figura 1A para visión general).
- Si se necesitan EVs purificados para los experimentos funcionales, la transferencia de 6 ml de la PPP a un tubo de ultracentrífuga y añadir 28 ml de 0,2 micras filtrada-solución salina tamponada con fosfato (PBS). Centrifugado durante 60 minutos a 100.000 xg a temperatura ambiente utilizando una ultracentrífuga equipado con un rotor de cubeta oscilante. Aspirar el sobrenadante y resuspender EV peldejar en 1,5 ml de medio.
NOTA: Para mayor reproducibilidad, las muestras de sangre deben ser procesadas manera más coherente posible de un donante a. Cualquier variación en el método de aislamiento EV podría afectar significativamente el número y tipo de vehículos eléctricos detectados.
1.2) La preparación de muestras para el análisis
NOTA: A partir de ahora, los pasos a hablarlo con un protocolo de alto rendimiento para el análisis de 12 muestras de 14 marcadores en 3 paneles. Sin embargo, otras combinaciones de anticuerpos pueden utilizarse aquí; el protocolo puede ser adaptado para estudiar otras poblaciones EV mediante la sustitución de los marcadores sugeridas para aquellos de interés.
- Retire 12 muestras del congelador (si se almacena a -80 ° C) y descongelar a 37 ° C.
- Contenido de la pipeta arriba y abajo varias veces para mezclar. Quite 320 l de cada muestra y añadir a la fila superior de una placa de 96 pocillos.
NOTA: A multi-así pipeta de ancho ajustable es muy útil para esto y muchas otras medidas en todo el culoay, particularmente cuando el análisis de múltiples muestras a la vez.
1.3) Las muestras de tinción EV
- Antes de la tinción, filtrar todos los anticuerpos (Abs) para eliminar los agregados, lo que puede causar señales positivas.
- Combinar anticuerpos para ser utilizados en cada uno de los 3 paneles en 0,22 micras tubos de filtro centrífugas separadas y centrifugar utilizando una centrífuga de ángulo fijo de una sola velocidad (~ 750 xg) a TA durante 2 min o hasta que toda la mezcla de Ab ha pasado a través del filtro y no hay líquido anticuerpo permanece en la superficie del filtro. Tienda cócteles Ab en el refrigerador hasta por dos semanas, pero re-filtro cada vez antes de usar.
- Añadir la cantidad apropiada de mezcla Ab filtrada a cada pocillo en la fila 2 (por ejemplo, muestras en Panel I se tiñen con 2 l de cada Ab, por lo que se añadieron un total de 12 l de cóctel Ab filtrada por pozo a remar 2). Consulte la Figura 1B para un esquema del mapa placa sugerido. Repita estos adicións de las filas por debajo si se ejecutan más paneles (en este caso, añadir 8 l / pocillo de cóctel Grupo II a la fila 3 y 11 l / pocillo de cóctel Panel III a la fila 4, consulte Lista de Materiales para la información del panel específico).
- Usando la pipeta multicanal, mezclar las muestras de PPP en la fila 1 de arriba abajo y transferir 100 l de los pozos de la fila 1 a los pocillos de la fila 2. Mezcle arriba y hacia abajo. Cambie las puntas y la repetición, la transferencia de 100 l de la fila 1 a las filas 3 y 4. Incubar a 4 ° C durante 30 minutos.
1.4) MT Lavado Muestras
- Retire la placa de 96 pocillos de 4 ° C y traslado al gabinete de seguridad biológica. Usando una pipeta multicanal, añadir 220 l de PBS / pocillo a las filas 6-8 (para ser utilizado para el enjuague / lavado de los pocillos que contienen manchado PPP).
- Transferir el contenido de cada pocillo para tubos de filtro centrífugas pre-etiquetados utilizando la pipeta multicanal ajustables en anchura (Para 12 muestras, con 3 paneles de anticuerpos, 12 x 3 = 36 tubos de filtroser necesario). Utilizando los mismos consejos, eliminar 200 l de PBS de las filas de lavado y añadir a los pocillos correspondientes de la que PPP se acaba de quitar.
- Mezclar arriba y hacia abajo para enjuagar los pozos y pasar la solución de enjuague para los mismos filtros a los que se añadió previamente el PPP. Cerrar las tapas de filtros de centrífuga. Cambie las puntas.
- Repita este proceso con las muestras teñidas restantes hasta que todas las muestras teñidas PPP se han transferido junto con sus soluciones de enjuague para filtros centrífugos.
- Transferir los filtros centrífugos a una centrífuga de rotor fijo y centrifugado a 850 xg durante 3 min a TA.
NOTA: Asegúrese de que el líquido no se mantiene en la parte superior del filtro. Después de la centrifugación, el filtro debe aparecer ser "seca", sin capa de fluido visible que queda en la parte superior. Aunque es poco probable, ciertas muestras de PPP pueden requerir un tiempo de centrifugación más tiempo para moverse con eficacia a través del filtro. - Retire los tubos de filtro centrífugas y volver a la cabina de seguridad biológica.Usando la pipeta multicanal, resuspender las partes superiores de los filtros en 300 l de PBS. Transferir el contenido resuspendidas a tubos pre-etiquetados para su análisis inmediato FCM.
NOTA: Es muy importante para mantener la fuerza y el número de depresiones émbolo pipeta consistentes entre muestras para evitar los cambios de muestra a muestra. Esta idealmente debería hacerse utilizando un pipeta electrónica que ha sido programado para pipetear arriba y abajo de un volumen específico (por ejemplo, 280 l) un número exacto de veces (por ejemplo, 8 veces) para cada muestra.
1.5) Configuración citómetro
- Abra el software FCM. Antes del experimento de configuración, realice la calibración del instrumento diariamente y configuración utilizando cuentas de configuración del instrumento (siguiendo las instrucciones del fabricante).
- Si las muestras EV se han teñido con más de un anticuerpo y múltiples fluorocromos se van a medir a la vez, calcular los valores de compensación como sigue:
- Añadir 2 gotas de cuentas de compensación de comprobar la valideztubos marcada con (1 tubo para cada anticuerpo conjugado a un fluorocromo) y añadir la cantidad recomendada de anticuerpo. Añadir 2 gotas de bolas de compensación negativos a otro tubo que se utiliza como control de compensación sin teñir.
- Incubar a 4 ° C durante 30 min, se lava con PBS y resuspender en 400 l de PBS.
- Utilizando el citómetro de flujo software incluido con el instrumento, ejecute cada tubo de compensación y ajustar los voltajes fluorescentes para colocar cada pico en aproximadamente 10 4 en una escala log-5 década. Asegúrese de que el pico de fluorescencia es más alta (más brillante) en su propio canal fluorescente en comparación con todos los demás canales, y ajustar los voltajes de los parámetros fluorescentes de nuevo si es necesario. Ejecutar cada tubo borrador manchado individualmente y capturar al menos 5000 eventos por tubo.
- Seleccione el "experimento", a continuación, seleccione la pestaña "Compensación", a continuación, seleccione "Calcular Compensación" para aplicar los valores de compensación para todas las muestras.
- Mientras se ejecuta un tubo de PBS 0,22 micras filtrada, ajustar los voltajes del FSC y SSC a los valores más altos que excluyen a la mayoría de ruido de fondo (es decir, justo por debajo del umbral de la tensión a la que la tasa de eventos supera 5 eventos / seg).
- A continuación, ejecute un tubo que contiene 0,2 m - 1,0 m perlas, diluidos en PBS si es necesario. En una FCS frente a SSC parcela, dibuja una puerta alrededor de la población de perlas para capturar eventos entre 0,2 micras y 1,0 micras. Por otra parte, en un histograma SSC-H, dibuja una puerta para incluir todos los eventos más pequeños que los 1,0 micras cuentas.
- Ajuste del caudal del citómetro de "Lo" (aproximadamente 8-12 l / min). Usando el tubo de perlas (u otro tubo que contiene una concentración conocida de perlas) ajustar el dial de velocidad de flujo en el citómetro hasta la vísperatasa nt alcanza aproximadamente 200 eventos / seg. Leer todos los tubos de la muestra a la misma velocidad de flujo y el uso de la misma concentración del grano en experimentos futuros para garantizar que los caudales se mantienen consistentes entre las corridas.
- Ejecutar un tubo de partículas fluorescentes arco iris diluidos en PBS. Adquirir 5000 eventos. Registre los valores medios de intensidad para FSC, SSC, y cada canal de color. Utilice estos valores para ajustar los voltajes en los experimentos futuros para asegurar que la intensidad de fluorescencia se mantienen consistentes entre los experimentos.
1.6) Ejemplo de Lectura
- Establecer velocidad de flujo del citómetro a "Lo" (aproximadamente 8-12 l / min) y ejecutar cada muestra durante exactamente 1 o 2 min.
- Después de la primera lectura, añadir 20 l de 10% de NP-40 a cada muestra, la pipeta arriba y abajo, y volver a leer por la misma cantidad de tiempo (ya sea 1 o 2 min) para permitir la sustracción de eventos positivos detectados en la muestra lisada sobre un marco de tiempo igual.
NOTA: Es muy importante que las muestras se mezclaron usando una pipeta en lugar de un vórtice. En nuestra experiencia, vórtice puede causar auto-agregación de algunos anticuerpos, lo que lleva a los acontecimientos positivos EV-imitando. - Una vez que todas las muestras han sido leídos, exportar todos los archivos .fcs en un archivo independiente que se utilizará para su posterior análisis utilizando el software de análisis FCM.
1.7) Análisis de Datos
- Abra el software de análisis de FCM. Importar todos los archivos .fcs en un archivo nuevo experimento.
- Abra la cuentas de sólo tubo. En la FSC-A vs SSC-Una parcela, dibuja una puerta alrededor de todas las cuentas de tamaño entre 0,2 micras y 1,0 micras. Esta es la puerta EV. Arrastre para añadir a todas las muestras.
- Utilizando las muestras lisadas como controles negativos, dibujar puertas en el borde de la fluorescencia de fondo en cada canal de fluorescencia utilizado. Arrastre puertas fluorescentes en la puerta EV de cada correspondiente muestra no lisadas.
NOTA: En este punto también es útil examinar parcelas de parámetros bi fluorescentes duales. Formas Rocket enel cuadrante de doble positivo (véase la Figura 8), en particular si se conocen los marcadores para residir en tipos de células no relacionadas, puede ser indicativo de artefacto de agregación o otros eventos de vesículas imitando. - Para cada marcador fluorescente, restar el número de eventos de la muestra zadas por el número de eventos de la muestra no lisadas. Opcionalmente, se divide este número por el número total de vehículos eléctricos dentro de la puerta no lisadas EV para obtener valores positivos%.
2. FORMA B: Método de Cuentas
2.1) Tratamiento de Muestra de sangre / Aislamiento de vehículos eléctricos
- Consulte el método de procesamiento de sangre descrita en el Método A (Sección 1.1).
2.2) Preparación de muestras para el análisis
- Si lo desea, fraccionar PPP o EVs ultracentrifugó en exosomas y microvesículas. Añadir 250 l de PPP o EVs ultracentrifugó a 0,22 micras filtros centrífugos y transferir a una centrífuga rotor fijo y giran a 750 xg durante 2 min a TA.
NOTA: Asegúrese de que el líquido no se mantiene en la parte superior del filtro. Después de la centrifugación, el filtro debe aparecer ser "seca", sin capa de fluido visible que queda en la parte superior. Aunque es poco probable, ciertas muestras pueden requerir un tiempo de centrifugación ligeramente más largo para que el fluido se mueva de manera efectiva a través del filtro. - Lavar sin recubrimiento 6 micras perlas de poliestireno (por ejemplo, cuentas negativas ABC) 2 veces con medio RPMI y volver a suspender en 2 ml. Añadir 6,000 perlas a cada tubo de FACS. Para el tubo de control negativo, añadir 400 l de medio RPMI solo a las perlas. Para el resto de los tubos, añadir 200 l de PPP o EVs ultracentrifugó (o sus fracciones) y 200 l de medio RPMI.
- Ajustar el volumen final de todos los tubos de 400 l con los medios de comunicación y se incuba durante la noche a 4 ° C en un agitador.
- A la mañana siguiente, lavar los granos con 2 ml de medios de comunicación. Aspirar el sobrenadante.
- Bloque con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en los medios (400 l) durante 3 horas a 4 y# 176; C en un agitador.
- Lavar perlas con 2 ml de medios de comunicación. Aspirar y volver a suspender el sedimento en 100 l de medio.
2.3) Las muestras de tinción EV
- Filtra todos los anticuerpos. Usa los mismos paneles de anticuerpos utilizados en el Método A, o si se desea, crear una combinación diferente de anticuerpos siempre y cuando sus fluorocromos son compatibles uno con el otro.
- Combinar todos los anticuerpos que se utilizarán en un único panel en un tubo de filtro de centrífuga 0,22 micras. Centrifugar el uso de un ángulo fijo de centrífuga de una sola velocidad durante 2 min o hasta que toda la mezcla de Ab ha pasado a través del filtro y el líquido no anticuerpo permanece en la superficie del filtro.
- Añadir volumen apropiado de cóctel de anticuerpos se filtró a todos los tubos y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
- Lavar perlas con 2 ml de medio, resuspender en 400 l de los medios de comunicación y ejecutar inmediatamente (o dentro del mismo día) en citómetro de flujo.
2.4) citómetro de configuración y la Muestra de Lectura
- Abra el software FCM. Antes del experimento de configuración, realice la calibración del instrumento diariamente y configuración utilizando cuentas de configuración del instrumento (siguiendo las instrucciones del fabricante).
- Si las muestras EV se han teñido con más de un anticuerpo y múltiples fluorocromos se van a medir a la vez, calcular los valores de compensación como sigue:
- Añadir 2 gotas de cuentas de compensación para tubos pre-etiquetados (1 tubo para cada anticuerpo conjugado a un fluorocromo) y agregue la cantidad recomendada de anticuerpo. Añadir 2 gotas de bolas de compensación negativos a otro tubo que se utiliza como control de compensación sin teñir. Incubar a 4 ° C durante 30 min, se lava con PBS y resuspender en 400 l de PBS.
- Usando el software FCM, ejecute cada tubo de compensación y ajustar los voltajes fluorescentes para colocar cada pico en aproximadamente 10 4 en una escala log-5 década. Asegúrese de que el pico de fluorescencia es más alto (el más brillante) en su propio canal fluorescente en comparación con todos los demás canales, yajustar las tensiones de los parámetros fluorescentes de nuevo si es necesario. Ejecutar cada tubo borrador manchado individualmente y capturar al menos 5000 eventos por tubo.
- Seleccione la pestaña "Experimento", luego "Compensación", luego "Calcular Compensación" para aplicar los valores de compensación para todas las muestras.
- Cambie el FSC y parámetros de tensión SSC a escala logarítmica y seleccione los umbrales más bajos permitidos por el citómetro (FSC = 200 y SSC = 200) para cada uno.
- Muestras Ejecutar, puerta sobre la población cuentas singlete y adquieren 2.000 eventos en esta puerta. Exportar archivos .fcs.
- Utilice el software de análisis FCM para analizar .fcs archivos. Puerta en cuentas singlete. Calcular la intensidad de fluorescencia media geométrica (MFI) para cada fluorocromo y comparar con el MFI del control negativo.
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Representative Results
La Figura 1 describe el esquema general de procesamiento para el aislamiento y la detección de los vehículos eléctricos utilizando el método basado en perlas o método de detección individual. Detección individual de los vehículos eléctricos utilizando FCM trabaja bien para el análisis de los vehículos eléctricos más grandes, pero la mayoría de citómetros no son capaces de detectar individualmente partículas tan pequeñas como exosomas. Un enfoque basado en perlas permite pequeños vehículos eléctricos a detectar, sin embargo, hay inconvenientes asociados con el uso de este método, como se indica en la Tabla 1. En general, el aislamiento de los vehículos eléctricos utilizando ultracentrifugación (con o sin la adición de un procedimiento de fraccionamiento en gradiente de sacarosa) es recomendada cuando se necesitan vehículos eléctricos para ensayos funcionales. Ultracentrifugación elimina las impurezas, incluyendo las proteínas del suero y otros contaminantes solubles del plasma, lo que puede afectar los resultados experimentales funcionales. Sin embargo, ultracentrifugación es mucho tiempo y puede alterar la cantidad y la calidad EV 12.
"> Resultados esperados para los dos ensayos de detección se representan en las Figuras 2-3. Para el ensayo de detección individual, el control se lisaron (fila inferior, la Figura 2) se utiliza para establecer puertas para la muestra no lisadas correspondiente (fila superior, la figura 2). La mayoría de los eventos debe caer dentro de la puerta EV. puertas Quadrant no deben revelar eventos dobles positivos cuando los dos marcadores en la comparación no se encuentran normalmente en la misma célula. Las parcelas biparameter derecha en la Figura 2 muestran los marcadores de CD108a y CD235a , que son dos marcadores de células rojas de la sangre conocidos para coexistir en células. Aquí, en los vehículos eléctricos, más de la mitad de los eventos positivos son positivos para ambos marcadores, como se esperaba. De la misma manera, marcadores de superficie celular que se sabe que residen en la misma célula debe mostrar patrones similares de doble positividad en los vehículos eléctricos. Las parcelas centro biparameter muestran expresión EV de dos marcadores que se sabe que no coexistir en células. En este análisis de CD235a (a Bloo rojad celular marcador) y CD41a (un marcador de plaquetas), los vehículos eléctricos, muestran, poblaciones positivas separadas distintas, que se espera ya que provienen de diferentes tipos de células. Cuando zadas, acontecimientos positivos deberían desaparecer. En general, cualesquiera eventos positivos restantes después de la lisis indican la presencia de señal procedente de partículas no de vesículas, agregados y / o EVs detergente resistentes. La Figura 3 muestra los resultados esperados usando el método de detección basado en perlas. A diferencia del método de detección individual, estos datos no pueden / no deben ser vistos en las parcelas de parámetros bi. En los gráficos de puntos superiores, no hay separación entre las poblaciones positivas y negativas existe, y eventos aparecen en los cuadrantes positivos dobles a pesar de que normalmente no se encuentran en los mismos tipos de células debido al hecho de que ambos tipos de vehículos eléctricos se unirán a una un solo cordón. Para el método de detección basado en perlas, los datos se analizan mejor utilizando superposiciones de histogramas con el control negativo (representado por debajo de los gráficos de puntos). La positividad is medida usando un marcador de MFI (intensidad media de fluorescencia) y se comparó directamente con la del control negativo. Si una muestra es positiva para el marcador en cuestión, su MFI será mayor que el control negativo. El control negativo para el método de talón es simplemente cuentas bloqueadas con BSA (no EVs añadidos), que han sido teñidas con los mismos anticuerpos y se lavaron las perlas junto con EV-revestido. Una comparación de los resultados esperados utilizando los dos métodos se puede ver en la Figura 4.La capacidad del ensayo de detección de individuo a evaluar adecuadamente fenotipos EV depende en gran medida gating correcta para separar eventos Ab-positivos de la fluorescencia de fondo. Por lo tanto, es crítico para elegir un control negativo que más apropiadamente imita / predice la fluorescencia de fondo para una muestra dada. Cuando los vehículos eléctricos manchados no se lavan antes de la lectura, que se utiliza comúnmente controles negativos (por ejemplo, isotipos) dejar de predecir con exactitud fondo fluorescence para todos los marcadores (Figura 5A). En estos casos, si el lavado no es una opción, las muestras lisadas tienden a funcionar mejor para predecir la fluorescencia de fondo. Sin embargo, cuando los vehículos eléctricos teñidos se lavan antes de leer (utilizando filtración centrífuga, en este caso), ambos controles negativos (isotipos y muestras lisadas) trabajar bien para la predicción de la fluorescencia de fondo de una muestra (Figura 5A). Cabe señalar, sin embargo, que si bien todos los controles negativos "trabajo", se prefieren los controles lisadas, ya que proporcionan información adicional sobre una muestra (por ejemplo, la presencia de eventos detergente resistentes, no vesículas relacionadas y / o agregados) que puede dar lugar a señales no EV positivos e impropiamente inflar recuentos Ab. Por otra parte, controles de isotipo a veces pueden ser poco fiables, incluso en muestras lavadas, como se muestra en la Figura 5B, donde la muestra manchada tiene menos eventos positivos que la misma muestra se tiñeron con anticuerpos de control de isotipo coincidentes. Sin la eliminación completa de anticuerpo no unido, parcelas FCM punto de algunos marcadores de EV son casi imposibles de interpretar, que aparecen como nubes de partículas débilmente fluorescentes indistinguibles de sus fondos altamente fluorescentes (Figura 6, arriba parcela). Lavarse las muestras teñidas utilizando filtros centrífugos realza la separación entre señales marcadores positivos y fondo (Figura 6, parcela inferior); sin embargo, pequeños vehículos eléctricos y los exosomas se pueden perder a través de los poros del filtro.
El uso de una etapa de lisis de detergente revela, eventos positivos de vesículas imitando de complejos inmunes y la proteína agrega 21. Cuando PPP se analizó usando la detección individual, encontrarse con eventos positivos que no desaparecen con la lisis es una ocurrencia bastante frecuencia. Estos eventos detergente resistentes a menudo aparecen señales diagonales como sospechosas, altamente fluorescentes en ambas parcelas de parámetros y biparameter individuales (Figura7). , Estos complejos de proteínas clínica y / o complejos inmunes insolubles son más frecuentes en pacientes aquejados de diversas enfermedades 21, tales como la artritis reumatoide 28, síndrome nefrótico 19, y el lupus eritematoso sistémico 29. Por lo tanto, en función del objetivo de la investigación, se puede desear para incluir o quitarlos del camino analysis.Another señales diagonales pueden formar es por agitación de las muestras, sobre todo después de la adición del reactivo de lisis (Figura 8). Las muestras siempre se deben mezclar arriba y hacia abajo mediante una pipeta para prevenir la formación de agregados.
Figura 1: Esquema general de procesamiento para el aislamiento y la detección de los vehículos eléctricos utilizando el método basado en perlas o método de detección individual. (A) Toda la sangre se procesa primero en PPP. Desdere, PPP puede o bien ser una nueva transformación mediante ultracentrifugación para producir vehículos eléctricos aislados o utiliza tal cual en la detección individuo o ensayos basados en perlas. (B) Esquema del mapa sugerido placa para el análisis de muestras de alto rendimiento utilizando el método de detección individual. Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Resultados esperados para la detección individual citometría de gráficos de puntos de Flujo de tinción de muestras representativo EV lisadas y no lisadas. Los valores muestran porcentajes de acontecimientos positivos. La mayoría de los eventos caen dentro de la puerta EV. Eventos que se muestran en las parcelas biparameter derecha están dentro de los FSC / SSC puertas EV de la izquierda. La muestra lisada (fila inferior) se usa para configurar puertas-basados fluorescentes para each correspondiente (no lisadas) muestra. Quad puertas no deben revelar eventos dobles positivos cuando los dos marcadores en la comparación no se encuentran normalmente en la misma célula. Aquí, el CD235a biparameter y CD41a gráfico muestra una clara separación entre los vehículos eléctricos que expresan marcadores de células rojas de la sangre y los que expresan marcadores de células de plaquetas. Del mismo modo, los marcadores de la superficie celular que se sabe que residir en la misma celda deben mostrar patrones similares de doble positividad en los vehículos eléctricos. El biparameter parcela derecha muestra que más de la mitad de los vehículos eléctricos CD235a positivas también son positivos para los glóbulos rojos (RBC) marcador secundaria, CD108a. Cuando zadas, acontecimientos positivos deberían desaparecer. Eventos positivos restantes después de la lisis indican la presencia de señal procedente de partículas y / o agregados resistentes no vesícula o detergentes.
Figura 3: Resultados esperados utilizando la detección basado en perlasmétodo. citometría de flujo gráficos de puntos muestran una tinción representativa de los vehículos eléctricos acoplados a perlas, en comparación a las perlas se bloquearon con BSA, que sirve como el control negativo. Los valores muestran porcentajes de acontecimientos positivos. Eventos que se muestran en las parcelas biparameter derecha están dentro de los FSC / SSC perlas puertas a la izquierda. Para el método de detección basado en perlas, los datos se analizan mejor utilizando superposiciones de histogramas con el control negativo (representado por debajo de los gráficos de puntos). La positividad se mide usando un marcador de MFI (intensidad media de fluorescencia) y se comparó directamente con la del control negativo.
Figura 4:. Comparación de los resultados esperados usando perlas vs. individual de detección citometría de flujo dot parcelas muestran una tinción representativa de los vehículos eléctricos acoplados a perlas (fila superior), en comparación con los vehículos eléctricos que analizan usando la detección individual (fila inferior). Eventosse muestra en la derecha biparameter parcelas están dentro de los FSC / SSC perlas puertas a la izquierda.
Figura 5: Valores. Comparación de los diferentes controles negativos en el análisis individual de detección muestran porcentajes de acontecimientos positivos. Eventos que se muestran están dentro de la puerta de FSC / SSC EV. (A) Comparación de los controles negativos en contra sin lavar lava muestras. Isotipo o controles lisadas fueron evaluados por su capacidad de proporcionar indicaciones apropiadas de la fluorescencia de fondo a través de dos marcadores diferentes en una muestra totalmente manchado (fila inferior). Puertas de cada marcador se hicieron utilizando la muestra lisada (fila superior) y luego se copia en las filas debajo. Muestras lavadas se lavaron usando filtración post-mancha. (B) Ejemplo de una muestra teñida con el control de isotipo tener eventos más positivos que la muestra teñida with anticuerpo real.
Figura 6:. Efecto de lavado post-manchas en la detección individuo valores muestran los porcentajes y números de eventos positivos. Eventos que se muestran están dentro de la puerta de FSC / SSC EV. Puertas de cada muestra se realizaron con la contraparte de cada muestra lisada (no se muestra; consulte la figura anterior para puerta de establecimiento en lavar vs muestras lavadas). Alta fluorescencia de fondo hace distinción positiva de los acontecimientos negativos difícil (gráfica superior). Con el lavado, sin embargo, la población positiva se revela como se eliminan los anticuerpos fluorescentes no consolidados y la fluorescencia de fondo se reduce (parcela inferior).
Figura 7: lisis con detergente confirma la presencia de no-EV signals. Eventos que se muestran están dentro de la puerta de FSC / SCC EV. Los valores muestran porcentajes de acontecimientos positivos. EV muestras teñidas se leen antes (columna izquierda) y después de la adición de detergente (columna derecha) para identificar señales positivas causadas por complejos inmunes y otros eventos no relacionados con-EV.
Figura 8: vórtex provoca la aparición de señales no-EV eventos mostrados son dentro de la puerta FSC / SCC EV.. Los valores muestran porcentajes de acontecimientos positivos. EV muestras teñidas se leen antes (columna izquierda) y después de adición de detergente (columna derecha). El uso de un vórtice de mezclar muestras puede causar EV-imitando, poblaciones diagonales para formar (fila superior). Cuando se mezcla suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta, sin embargo, la formación de estas poblaciones se puede evitar (fila inferior). Vórtex no se recomienda para la mezcla, ya que puede causar la agregación en algunas muestras, leading de Diagonal-aparecer, poblaciones positivas. En general, el número de eventos dentro de una puerta segura no debe aumentar después de lisis.
| Detección basada-Bead | Detección individual | |
| EV Tamaños | recomendado para <100 nm sólo | recomendado para> 100 nm sólo |
| Tiempo | requiere incubación durante la noche | puede completar en <1 día |
| Sensibilidad | el grupo de detección | detección de partículas único |
| Resultados | cualitativo | cuantitativo |
| Lavado | centrifugación simple, estándar | requiere filtros centrífugos |
| Control negativo | Perlas recubiertas con BSA | muestras lisadas |
Tabla 1: Pros y contras de ambos métodos de detección.
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Discussion
Se presentaron dos protocolos diferentes para el aislamiento, tratamiento y análisis de EVs, utilizando ya sea un individuo o de detección de enfoque basado en perlas. Al seleccionar el método más apropiado utilizar no siempre es sencillo y requiere una comprensión de la muestra a analizar, así como las subpoblaciones individuales de interés. Además, la sensibilidad de la citómetro utilizado para la adquisición se debe considerar al elegir el método más apropiado. A menudo no existe una única mejor protocolo de usar, más bien, una combinación de métodos ofrece más información sobre una muestra de que cualquier método solo. Lo ideal sería que varios diferentes técnicas de aislamiento y detección deben ser evaluados por primera vez en el fin de desarrollar un protocolo a medida que toma en consideración individual citómetro de rendimiento con respecto a la población EV específico en estudio. Técnicas de aislamiento alternativos incluyen la ultracentrifugación, el fraccionamiento de densidad de sacarosa, inmunomagnética bseparación ead, cromatografía y purificación por afinidad 12, mientras que los métodos de detección alternativos incluyen la microscopía electrónica de barrido, microscopía electrónica de transmisión, microscopía de fuerza atómica, dispersión de luz dinámica, y Western Blot 8. Mediante la combinación de diferentes técnicas, los métodos presentados aquí pueden adaptarse con el fin de crear protocolos más adecuados para el estudio de las diversas poblaciones EV de interés.
En general, la detección individual de los vehículos eléctricos utilizando FCM trabaja bien para el análisis de los vehículos eléctricos más grandes, pero pierde la sensibilidad como los vehículos eléctricos se hacen más pequeños. Si bien la detección individual es más consistente en la detección de los vehículos eléctricos de mayor tamaño, la detección basada en grano es menos sensible en la detección de los vehículos eléctricos más grandes y más sensible para exosomas. Los vehículos eléctricos más grandes se pueden lavar fácilmente a través de filtración post-mancha y detectan por separado a través de la FCM. Los vehículos eléctricos y los exosomas más pequeñas, por otro lado, no se detectan bien individualmente utilizando FCM y son mucho más difíciles de lavar post-tinción. La perla de capturaprotocolo resuelve ambos problemas, permitiendo que los vehículos eléctricos sean lavados fácilmente y varios vehículos eléctricos que se medirán entre sí para crear señales positivas mayores detectables por FCM. Sin embargo, hay inconvenientes asociados con el uso de este método, como se indica en la Tabla 1.
Cuando se trabaja con un citómetro de menos sensible, la capacidad para la detección individual es limitada. Antes del análisis EV, la sensibilidad de la citómetro debe ser determinado usando una mezcla de tamaños de grano que van desde 0,1 hasta 1,0 micras. El fracaso de la citómetro para detectar una mayoría de partículas por debajo de 1,0 micras, requiera el uso del protocolo basado en perlas. Marcadores altamente expresado se detectan fácilmente utilizando cualquiera de los protocolos. Poblaciones más raras son a veces más fáciles de detectar usando el protocolo sola detección de partículas en lugar de el protocolo de captura de grano, sin embargo, esto puede variar dependiendo de variables tales como: el brillo de la fluorocromo, de la muestra EV: grano ratio, y el tamaño de la EV que lleva el marcador de superficie de células raras. La detección de marcadores múltiples en una sola partícula requiere el uso del método de detección individual. El método basado en perlas no es capaz de detección EV individual. Por lo tanto, el protocolo basado en perlas producirá datos que son de naturaleza más cualitativa, mientras que el método de detección individuo dará más datos cuantitativos.
Otras técnicas de aislamiento deben ser utilizados siempre que se necesiten vehículos eléctricos para aplicaciones posteriores. Vehículos eléctricos utilizados en ensayos funcionales deben ultracentrifugar utilizando el protocolo centrifugación diferencial de 3 pasos, ya que las proteínas séricas solubles en el plasma pueden afectar los resultados experimentales funcionales. Para la caracterización de los vehículos eléctricos, sin embargo, no se recomienda la ultracentrifugación, ya que este paso adicional puede afectar a la calidad y cantidad EV debido a las altas fuerzas impartidas sobre las partículas 12.
El protocolo de detección individual contiene spasos clave arias optimizados para pruebas de alto rendimiento, incluyendo: 1) la implementación de filtros centrífugos para la eliminación rápida y eficaz de los acontecimientos positivos causados por agregados Ab, 2) el uso de filtros como una alternativa más práctica a ultracentrifugación o sacarosa fraccionamiento gradiente para el lavado de Ab no unido a partir de muestras post-EV de tinción, y 3) la utilización de lisis con detergente como un control negativo, que no sólo revela los eventos positivos debido a la no EVs pero proporciona una buena aproximación de la fluorescencia de fondo para distinguir positiva de poblaciones negativas para dibujo puertas. Se recomienda el protocolo de detección individuales siempre que un gran número de muestras necesita pruebas, ya que se puede realizar en un solo día, mientras que el método basado en perlas requiere una incubación durante la noche.
Los controles negativos en cada protocolo tienen diferentes ventajas y desventajas dependiendo del método de detección se utiliza. Uno de los beneficios de la utilización de la una a base de granossay es que los mismos anticuerpos monoclonales se pueden utilizar para los tubos negativos y positivos y el mismo control negativo se pueden utilizar para todas las muestras. El método de detección individual, por otro lado, requiere controles separados para ser leídos por cada muestra analizada. El control negativo utilizado por el protocolo de detección individuo utiliza muestras lisadas, que no requieren el uso / consumo de anticuerpos adicionales pero no requieren que cada tubo puede leer una segunda vez después de la adición del agente de lisis. Los controles lisadas tienen la ventaja añadida de ser capaz de identificar la proporción de señal positiva que se puede atribuir a los eventos no relacionados con vesículas tales como complejos inmunes 21. El ensayo basado en perlas no tiene esta capacidad todistinguish entre las señales positivas que surgen de verdaderos vehículos eléctricos y los derivados de los no vesículas.
Limitaciones de la técnica
Si bien no existe un método estandarizado para el aislamiento de los vehículos eléctricos, diferencialcentrifugación es una técnica ampliamente utilizada entre los investigadores EV. El método de centrifugación diferencial descrito aquí se basa en protocolos comunes para el aislamiento de PPP, que normalmente requiere de una centrifugación inicial entre 1.200-1.500 xg durante 10-20 min para eliminar las células, seguido de una segunda centrifugación entre 10,000-13,000 xg durante 10-30 min para eliminar las plaquetas 35. El protocolo descrito en el presente documento utiliza una centrifugación a 1500 xg durante 10 min seguido de una centrifugación a 13.000 xg durante 10 min. Mientras que las fuerzas superiores de 25.000-100.000 xg suelen ser necesarios para sedimentar los vehículos eléctricos, algunos de los vehículos eléctricos y mayores pueden ser removidos con el protocolo de centrifugación diferencial que hemos presentado.
Hasta el 90% de los vehículos eléctricos detectados por FCM se pierden con ultracentrifugación una hora a 100.000 xg (datos no mostrados). Tiempos de centrifugación más largas deben ser considerados, aunque con cautela, ya que esto puede afectar negativamente a la composición de la muestra. Si se necesita procesamiento adicional fo estudios de caracterización, la filtración se pueden realizar después de la centrifugación de 2 pasos (antes de la tinción) para fraccionar más muestras en función del tamaño de las partículas. Similar a ultra-centrifugación, filtración puede resultar en una pérdida de hasta el 50% de los eventos marcador positivo y hasta el 90% de las partículas totales detectados por FCM (datos no mostrados). Mientras que el aumento de la relación de señal a ruido es de beneficio obvio, la pérdida de los vehículos eléctricos más pequeños representa una limitación importante al considerar cualquier método de lavado o aislamiento.
Finalmente, el anticoagulante utilizado (por ejemplo, heparina, ACD, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), etc.) durante la recogida de la sangre puede afectar a la calidad y cantidad de contenido de EV. Mientras ACD ha demostrado ser un anticoagulante bueno y confiable para nuestros estudios, se recomienda probar múltiples soluciones para garantizar que se elige el anticoagulante más adecuado para la aplicación. Esto es especialmente importante cuando se utilizan vehículos eléctricos en ensayos posterioresdonde el anticoagulante utilizado puede afectar el resultado. Por ejemplo, algunos anticoagulantes (por ejemplo, EDTA y heparina) son conocidos por interferir con las reacciones de PCR, mientras que otros (por ejemplo, teofilina, adenosina y dipiridamol) han demostrado para inhibir la liberación de las plaquetas 12 EV.
Métodos para el análisis EV, mientras mejorado considerablemente en la última década, son todavía un trabajo en progreso. En última instancia, los mejores métodos para el análisis de los vehículos eléctricos dependerá de las investigaciones que se llevan a cabo y las herramientas disponibles para el investigador.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses a revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Dale Hirschkorn de Sistemas de Sangre del Instituto de Investigación por su ayuda con citómetro de flujo ajustes del instrumento. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones HL095470 y HL072268 U01 y contratos del Departamento de Defensa W81XWH-10-1-0023 y W81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
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