Summary
Der findes mange forskellige metoder til måling af ekstracellulære vesikler (EVS) under anvendelse af flowcytometri (FCM). Flere aspekter bør overvejes, når fastlæggelsen af den mest hensigtsmæssige metode til at bruge. To protokoller for måling elbiler præsenteres, enten ved hjælp af individuelle afsløring eller en perle tilgang.
Abstract
Ekstracellulær vesikler (EVS) er små, vesikler membran afledt findes i legemsvæsker, der er meget involveret i celle-celle kommunikation og hjælper med at regulere en lang række biologiske processer. Analyse af elbiler ved anvendelse af flowcytometri (FCM) har været notorisk vanskeligt på grund af deres lille størrelse og mangel på diskrete populationer positive for markører af interesse. Metoder til EV analyse mens væsentligt forbedret i det seneste årti, er stadig et arbejde i gang. Desværre er der ingen one-size-fits-all protokol, og flere aspekter skal tages i betragtning ved fastlæggelsen af den mest hensigtsmæssige metode til at bruge. Præsenteret her er flere forskellige teknikker til behandling elbiler og to protokoller til analyse elbiler ved hjælp af enten individuel afsløring eller en perle tilgang. De beskrevne her, vil hjælpe med at fjerne antistof aggregater almindeligvis findes i kommercielle præparater metoder, øget signal-støj-forhold og indstilling porte i en rationel fashion der minimerer detektering af baggrundsfluorescens. Den første protokol benytter en individuel påvisning metode, der er specielt velegnet til at analysere en stor mængde af kliniske prøver, mens den anden protokol bruger en perle tilgang til at indfange og detektere mindre elbiler og exosomer.
Introduction
Ekstracellulær vesikler (EVS) er små, vesikler membran afledt findes i legemsvæsker, der er meget involveret i celle-celle kommunikation og hjælper med at regulere en lang række biologiske processer. Analyse af elbiler ved anvendelse af flowcytometri (FCM) har været notorisk vanskeligt på grund af deres lille størrelse og mangel på diskrete populationer positive for markører af interesse. Metoder til EV analyse mens væsentligt forbedret i det seneste årti, er stadig et arbejde i gang. Desværre er der ingen one-size-fits-all protokol, og flere aspekter skal tages i betragtning ved fastlæggelsen af den mest hensigtsmæssige metode til at bruge. Præsenteret her er flere forskellige teknikker til behandling elbiler og to protokoller til analyse elbiler ved hjælp af enten individuel afsløring eller en perle tilgang. De beskrevne her, vil hjælpe med at fjerne antistof aggregater almindeligvis findes i kommercielle præparater metoder, øget signal-støj-forhold og indstilling porte i en rationel fashion der minimerer detektering af baggrundsfluorescens. Den første protokol benytter en individuel påvisning metode, der er specielt velegnet til at analysere en stor mængde af kliniske prøver, mens den anden protokol bruger en perle tilgang til at indfange og detektere mindre elbiler og exosomer.
Elbiler, også kendt som mikropartikler, er små, blærer membran-afledte findes i kropsvæsker, der er involveret i celle-celle kommunikation og hjælper med at regulere en bred vifte af biologiske processer 1. Gennem ekspression af forskellige overflademarkører og / eller direkte overførsel af biologisk materiale, elbiler er i stand til at ændre funktionen af recipientceller at spille enten aktivering eller undertrykke roller i intercellulære kommunikation 2 - 4. Klinisk blodpladeafledte EVs er kendt for at have en stærk antikoagulerende aktivitet 5, mens andre har vist sig at bidrage til en lang række betingelser, fra at fremme tumor metastasis 6 til at beskytte mod sygdom 7. Elbiler kan inddeles i mindre grupper af celleafledte vesikler såsom exosomer og mikrovesikler (MVS), afhængig af deres størrelse og mekanisme generation 8. Nomenklaturen af celle-afledt vesikel subpopulationer fortsat et emne af løbende debat 8,9 dog exosomer er generelt beskrevet som små 40 til 100 nm partikler fra endosomal fusion med plasmamembranen, mens MV'er er større 100 til 1.000 nm partikler dannet ved at kaste af plasmamembranen 10. Her vil det generelle udtryk "elbiler" bruges til at henvise til alle typer af ekstracellulære biologiske vesikler frigivet af celler.
Isolering af elbiler fra fuldblod er en multi-trins procedure og mange forskellige behandlinger variabler har vist sig at påvirke EV indhold, herunder opbevaringstemperatur og varighed 11,12, antikoagulant / konserveringsmiddel bruges 13 ogcentrifugering anvendte 14. Et behov for standardisering af disse variabler har ført til anbefalinger fra International Society for Trombose og Hæmostase Videnskabelige og Standardiseringsorganisation (ISTH SSC) for korrekt blod forarbejdning og EV isoleringsfremgangsmåder 15,16, men der eksisterer ingen konsensus blandt forskere om den optimale protokol at bruge 12. De fleste er enige om, dog, at stramt kontrollerede pre-analytiske variabler er afgørende for nøjagtige og reproducerbare data.
For at analysere elbiler, har forskere udnyttet forskellige metoder, herunder transmission elektronmikroskopi 17, scanning elektronmikroskopi 18,19, atomic force mikroskopi, dynamisk lysspredning 20,21 og western blotting 22,23. Mens FCM er den foretrukne metode for mange forskere 9,24 - 26 på grund af dens høje kapacitet kapaciteter, har en analyse af elbiler ved hjælp af FCM væretnotorisk vanskeligt på grund af deres størrelse og mangel på diskrete positive populationer 27-32. Sammenlignet med analyse af celler, at den lille størrelse af EVS resulterer i 1) mindre fluorescens udsendt på grund af det færre antal antigener pr partikel og 2) begrænset mulighederne for post-plet vask, hvilket er nødvendigt reducere baggrundsfluorescens. Fælles udfordringer blandt forskere omfatter signaler skyldes immunglobulinforbindelser 27,28 og selvaggregering af antistoffer 29. Desuden de lange behandlingstider og lange vask / isolation, der benyttes af mange af de nuværende protokoller 33,34 må flere dages tid forpligtelser til at analysere et lille antal prøver, hvilket gør dem mindre end ideelt til høje gennemløb applikationer. Nogle forskere afkald på en vask skridt helt, hvilket gør traditionelt anvendes FCM negative kontroller såsom fluorescens minus én (FMO) og antistofisotyper ubrugelig for præcist at vurdere background fluorescens 30.
Vores protokoller løse tre almindelige problemer, der kan hindre en ordentlig FCM analyse af elbiler: Signaler, der følger af antistof aggregater og andre ikke-vesikler, svært ved at fjerne ubundet antistof, og mangel på mærkbar positive befolkninger. De her beskrevne teknikker vil hjælpe med at fjerne antistof aggregater almindeligvis findes i kommercielle præparater, øget signal-til-støjforhold, og sætte porte på en rationel måde, der minimerer detektering af baggrundsfluorescens. To forskellige detektionsmetoder præsenteres her: den første protokol anvender en individuel påvisning metode, der er specielt velegnet til at analysere en stor mængde af kliniske prøver, mens den anden protokol anvender en perler tilgang til at indfange og detektere mindre elbiler og exosomer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Følgende protokoller er blevet udført i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskelig velfærd. Alle underlagt prøver humane blev testet under en Institutional Review Board (IRB) -godkendt protokol og med informeret samtykke fra forsøgspersonerne.
1. Metode A: Individuel Detektionsmetode
1.1) Behandling af blodprøve / Isolering af elbiler
- Trække blod fra donor / patient i to 10 ml glasrør indeholdende 1,5 ml ACD-Solution A eller anden egnet antikoagulant og med det samme (inden for 30 min max) ved følgende 2-trins differentiel centrifugering protokol.
BEMÆRK: Denne protokol vil give ca. 10 ml blodpladefattigt plasma (PPP) fra de kombinerede ~ 17 ml blod trukket. Hvis der er mere eller mindre PPP er nødvendig, kan antallet af rør af blod opsamlet justeres i overensstemmelse hermed. - Centrifuger prøverne ved 1500 xg i 10 min ved stuetemperaturat adskille plasmaet fra fibrinlag og røde blodlegemer. Overfør 1,2 ml portioner af plasma supernatanten til 1,5 ml centrifugerør, sørg for ikke at forstyrre de nederste lag indeholdende buffy coat og røde blodlegemer.
- Spin ved 13.000 xg i 10 minutter ved stuetemperatur for at fjerne blodplader og store cellefragmenter. Overføre forsigtigt PPP, efterlod 200 pi at undgå at forstyrre bundfaldet og tilføje PPP til et nyt rør.
- På dette tidspunkt, skal du bruge PPP straks til analyse eller overførsel i 1,0 ml portioner til nye 1,5 ml centrifugerør og opbevares ved -80 ° C i op til to år for senere analyse (se figur 1A til oversigt).
- Hvis der er behov oprensede elbiler funktionelle forsøg, transfer 6 ml PPP til en ultracentrifuge rør og tilsæt 28 ml 0,2 um-filtreret phosphatbufret saltvand (PBS). Spin i 60 minutter ved 100.000 xg ved stuetemperatur under anvendelse af en ultracentrifuge udstyret med en svingende spand rotor. Aspirer supernatanten og resuspender EV pelLad i 1,5 ml medier.
BEMÆRK: højeste reproducerbarhed, bør blodprøver behandles så ensartet som muligt fra donor til donor. Enhver variation i EV isolation metode kan få alvorlige konsekvenser for antallet og typen af elbiler opdaget.
1.2) Forberedelse af prøver til analyse
BEMÆRK: Fra dette punkt, de trin forklarer en high throughput protokol for analyse af 12 prøver i 14 markører i 3 paneler. Imidlertid kan andre kombinationer af antistoffer bruges her; protokollen kan tilpasses til at studere andre EV befolkninger ved at erstatte de foreslåede markører for dem af interesse.
- Fjern 12 prøver fra fryseren (hvis de opbevares ved -80 ° C) og optøning ved 37 ° C.
- Pipette indhold op og ned flere gange for at blande. Fjern 320 pi fra hver prøve og tilføje til den øverste række af en plade med 96 brønde.
BEMÆRK: En bredde-justerbar multi-godt pipette er yderst nyttigt for dette og mange andre skridt i hele røvja, især når man analyserer flere prøver på én gang.
1.3) Farvning EV Prøver
- Før farvning filtrere alle antistoffer (Abs) for at fjerne aggregater, hvilket kan forårsage positive signaler.
- Kombiner antistoffer, der skal anvendes i hver af de 3 paneler i separate 0,22 um centrifugalfilter rør og centrifuge med en fast vinkel enkelt hastighed centrifuge (~ 750 xg) ved stuetemperatur i 2 minutter, eller indtil al Ab blandingen har passeret gennem filteret og intet antistof væske forbliver på overfladen af filtret. Store Ab cocktails i køleskabet i op til to uger, men re-filter hver gang før brug.
- Tilsæt en passende mængde filtreret Ab blanding til hver brønd i række 2 (f.eks prøver i Panel I farves med 2 pi af hver Ab, så tilsættes i alt 12 pi af den filtrerede Ab cocktail per brønd til række 2). Se Figur 1B for en oversigt over den foreslåede plade kort. Gentag disse tilføjelses til rækkerne under hvis flere paneler køres (her tilføje 8 pl / brønd af Panel II cocktail til række 3 og 11 pl / brønd af panelets III cocktail til række 4, se Materialer List for specifik panel information).
- Brug af multikanal pipette, bland PPP prøver i række 1 op og ned og overføre 100 pi fra brøndene i række 1 til brøndene i række 2. Bland op og ned. Skift tips og gentag, overføre 100 pi fra række 1 til række 3 og 4. Der inkuberes ved 4 ° C i 30 min.
1.4) vask MV Prøver
- Fjern plade med 96 brønde fra 4 ° C og overførsel til biologisk sikkerhedsskab. Ved hjælp af en multikanalpipette, tilsættes 220 pi PBS / brønd til rækkerne 6-8 (anvendes til skylning / vask brøndene indeholdende farvede PPP).
- Overfør indholdet af hver brønd for at præ-mærket centrifugal filterrør hjælp bredde justerbare multikanal pipette (for 12 prøver med 3 paneler af antistoffer, 12 x 3 = 36 filterrør vilnødvendig). Ved hjælp af de samme tips, fjerne 200 pi PBS fra vask rækker og føje til de tilsvarende brønde, hvorfra PPP var bare fjernet.
- Bland op og ned for at skylle brøndene og overføre skylleopløsningen til de samme filtre, som PPP tidligere tilføjet. Luk toppe af centrifugal filtre. Skift tips.
- Gentag denne proces med de resterende farvede prøver, indtil alle farvede OPP prøver er blevet overført sammen med deres Skyl løsninger på centrifugal filtre.
- Overfør centrifugalfiltre til en fast rotor centrifuge og centrifugering ved 850 xg i 3 min ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Sørg for, at ingen væske forbliver på filteret toppe. Efter centrifugering bør filter synes at være "tør" uden nogen synlig flydende lag forbliver på toppen. Mens usandsynligt kan visse OPP prøver kræver længere centrifugering tid til effektivt at bevæge sig gennem filteret. - Fjern de centrifugale filterrør og vende tilbage til biologisk sikkerhedsskab.Brug af multikanal pipette opblande toppen af filtrene i 300 pi PBS. Overfør resuspenderede indhold til pre-mærkede rør til øjeblikkelig FCM analyse.
BEMÆRK: Det er meget vigtigt at holde den kraft og antallet af pipette stemplet depressioner konsistente blandt prøver at undgå prøve-til-prøve variation. Dette bør ideelt gøres ved hjælp af en elektronisk pipette, der er blevet programmeret til at pipetteres op og ned et specifikt volumen (fx 280 pi) et helt antal gange (fx 8 gange) for hver prøve.
1.5) Cytometer Setup
- Åbn FCM software. Før eksperimentere setup, udføre daglige instrument kalibrering og opsætning ved hjælp instrument setup perler (efter producentens anvisninger).
- Hvis EV prøver er blevet farvet med mere end ét antistof og skal måles flere fluorochromer på en gang, beregnes korrekturværdier som følger:
- Tilsæt 2 dråber kompensation perler til at pre-mærkede rør (1 tube for hver fluorokromkonjugerede antistof) og tilsæt den anbefalede mængde antistof. Tilsæt 2 dråber negativ korrektion perler til et andet rør til brug som ufarvede kompensation kontrol.
- Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter, vaskes med PBS og resuspenderes i 400 pi PBS.
- Brug flowcytometeret software, der følger med instrumentet, køre hver kompensation rør og justere fluorescerende spændinger til at placere hver top ved ca. 10 4 på en 5-årti logaritmisk skala. Sørg for, at fluorescens top er højeste (lysest) i sin egen fluorescerende kanal i forhold til alle andre kanaler, og justere spændinger i fluorescerende parametre igen, hvis det er nødvendigt. Kør hver individuelt farvede comp rør og opsamle mindst 5.000 hændelser pr rør.
- Vælg fanebladet "Experiment" og derefter vælge "Kompensation" og derefter vælge "Beregn kompensation" at anvende korrekturværdier for alle prøver.
- Mens kører en slange på 0,22 um-filtreret PBS, justere FSC & SSC spændinger til de højeste værdier, som udelukker størstedelen af baggrundsstøj (dvs. lige under spænding grænse, hvor event rate overgår 5 hændelser / s).
- Dernæst kører et rør indeholdende 0,2 um - 1,0 um perler, fortyndet i PBS, hvis nødvendigt. I en FCS versus SSC plot, tegne en gate omkring perlepopulationen at fange begivenheder mellem 0,2 um og 1,0 um. Alternativt i en SSC-H histogram, tegne en port til at omfatte alle hændelser mindre end 1,0 um perler.
- Indstil cytometret flow rate til "Lo" (ca. 8-12 ul / min). Brug af perler rør (eller et andet rør, der indeholder en kendt koncentration af perler) justere flowhastigheden skiven på cytometeret indtil tærsklennt sats er ca. 200 events / sek. Læs alle prøveglas ved samme strømningshastighed og bruge den samme perle koncentrationen i fremtidige forsøg at sikre, at strømningshastigheder være konsekvent mellem kørsler.
- Kør en tube rainbow fluorescerende partikler fortyndet i PBS. Erhverve 5.000 arrangementer. Middeldiameteren intensitetsværdier for FSC, SSC, og hver farvekanal. Brug disse værdier til at justere spændinger i fremtidige forsøg at sikre, at fluorescensintensiteterne være konsekvent mellem forsøgene.
1.6) Prøve Reading
- Indstil cytometret flow rate til "Lo" (ca. 8-12 ul / min) og køre hver prøve for præcis 1 eller 2 min.
- Efter førstebehandlingen, tilsættes 20 pi 10% NP-40 til hver prøve, pipette op og ned, og genlæste for den samme mængde tid (enten 1 eller 2 min) for at gøre det muligt at fratrækning af positive begivenheder påvist i den lyserede prøve over en lige tidsramme.
BEMÆRK: Det er yderst important at prøverne blandes ved hjælp af en pipette snarere end en vortex. Det er vores erfaring, kan vortex forårsage selvaggregering nogle antistoffer, hvilket fører til EV-efterligner positive begivenheder. - Når alle prøver er blevet læst, eksport alle .fcs filer i en separat fil, der skal bruges til yderligere analyse ved hjælp af FCM analysesoftware.
1.7) Dataanalyse
- Åbn FCM analyse software. Importer alle .fcs filer i et nyt eksperiment fil.
- Åbn perler kun rør. I FSC-A versus SSC-A plot, tegne en port omkring alle perler dimensioneret mellem 0,2 um og 1,0 um. Dette er EV gate. Træk for at tilføje til alle prøver.
- Brug af lyserede prøver som negative kontroller, tegne porte på kanten af baggrunden fluorescens i hver fluorescens kanal anvendes. Træk fluorescerende porte i EV porten af den tilsvarende ikke-lyserede prøve.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det også nyttigt at undersøge dobbelt fluorescerende bi-parameter plots. Rocket figurer idobbelt-positive kvadrant (se figur 8), især hvis man ved, at markører til at opholde sig på uafhængige celletyper, kan være tegn på artefakt fra sammenlægning eller andre blæredannende efterligne begivenheder. - For hver fluorescerende markør, trække antallet af hændelser i lyserede prøve fra antallet af hændelser i den ikke-lyserede prøve. Eventuelt, dividere dette tal med det samlede antal af elbiler inden for den ikke-lyserede EV porten til få% positive værdier.
2. Metode B: Perler Method
2.1) Behandling af blodprøve / Isolering af elbiler
- Se beskrevet i fremgangsmåde A (afsnit 1.1) blod forarbejdningsmetode.
2.2) Forberedelse af prøver til analyse
- Hvis det ønskes, fraktionere PPP eller ultracentrifugeret elbiler i exosomer og mikrovesikler. Tilføj 250 pi PPP eller ultracentrifugeret elbiler til 0,22 um centrifugale filtre og overføre til en fast rotor centrifuge og centrifugering ved 750 xg i 2 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Sørg for, at ingen væske forbliver på filteret toppe. Efter centrifugering bør filter synes at være "tør" uden nogen synlig flydende lag forbliver på toppen. Mens usandsynligt, kan visse prøver kræver en lidt længere centrifugering tid for væsken til effektivt at bevæge sig gennem filteret. - Vask ikke-coatede 6 um polystyrenkugler (fx negative Abc perler) 2x med RPMI medier og resuspender i 2 ml. Tilføj 6.000 perler til hvert FACS rør. Til den negative kontrol røret, tilsættes 400 pi RPMI medier alene til perlerne. Til alle andre rør, tilsættes 200 pi PPP eller ultracentrifugeret elbiler (eller fraktioner) og 200 pi RPMI medier.
- Det endelige rumfang justeres til alle rør til 400 pi med medier og inkuberes natten over ved 4 ° C på et rysteapparat.
- Den næste morgen vaskes perler med 2 ml medier. Aspirer supernatanten.
- Blok med 5% bovint serumalbumin (BSA) i medier (400 pi) i 3 timer ved 4 &# 176; C på en ryster.
- Vask perler med 2 ml medier. Aspirer og resuspender pellet i 100 pi medium.
2.3) Farvning EV Prøver
- Filtrere alle antistoffer. Brug det samme antistof paneler anvendes i fremgangsmåde A, eller hvis det ønskes, oprette en anden kombination af antistoffer, så længe deres fluorochromer er forenelige med hinanden.
- Bland alle antistoffer, der skal anvendes i et enkelt panel i en 0,22 um centrifugal filter rør. Centrifuge med en fast vinkel enkelt hastighed centrifuge for 2 min, eller indtil alle Ab blandingen er passeret gennem filteret, og intet antistof væske forbliver på overfladen af filtret.
- Tilføj passende volumen af filtreret antistofcocktail til alle rør og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask perler med 2 ml medier, resuspender i 400 pi medier og køre med det samme (eller inden for samme dag) på flowcytometer.
2.4) Cytometer Setup og Sample Reading
- Åbn FCM software. Før eksperimentere setup, udføre daglige instrument kalibrering og opsætning ved hjælp instrument setup perler (efter producentens anvisninger).
- Hvis EV prøver er blevet farvet med mere end ét antistof og skal måles flere fluorochromer på en gang, beregnes korrekturværdier som følger:
- Tilsæt 2 dråber kompensation perler til at pre-mærkede rør (1 rør for hver fluorokromkonjugerede antistof) og tilsæt den anbefalede mængde antistof. Tilsæt 2 dråber negativ korrektion perler til et andet rør til brug som ufarvede kompensation kontrol. Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter, vaskes med PBS og resuspenderes i 400 pi PBS.
- Ved hjælp af FCM-softwaren, skal du køre hver kompensation rør og justere fluorescerende spændinger til at placere hver top ved ca. 10 4 på en 5-årti logaritmisk skala. Sørg for, at fluorescens top er højeste (lysest) i sin egen fluorescerende kanal i forhold til alle andre kanaler, ogjustere spændinger fluorescerende parametre igen, hvis det er nødvendigt. Kør hver individuelt farvede comp rør og opsamle mindst 5.000 hændelser pr rør.
- Vælg fanebladet "Experiment" og derefter "Kompensation" og derefter "Beregn kompensation" at anvende korrekturværdier for alle prøver.
- Skift FSC og SSC spænding parametre at logge skala og vælg de laveste tærskler tilladt af cytometeret (FSC = 200 og SSC = 200) for hver.
- Kør prøver, gate på singlet perler befolkning og erhverve 2.000 begivenheder i denne port. Export .fcs filer.
- Brug FCM analyse software til at analysere .fcs filer. Gate på singlet perler. Beregn den geometriske gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) for hver fluorokrom og sammenligne med MFI af den negative kontrol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 skitserer den generelle behandling ordningen til isolering og afsløring af elbiler ved hjælp af enten perle-baserede metode eller individuel påvisningsmetode. Individuel påvisning af elbiler hjælp FCM fungerer godt til at analysere større elbiler men de fleste cytometre er ikke i stand til individuelt at detektere partikler så små som exosomer. En perle tilgang tillader små elbiler skal påvises, men der er ulemper forbundet med anvendelse af denne fremgangsmåde, som er skitseret i tabel 1. Generelt isolering af elbiler hjælp ultracentrifugering (med eller uden tilsætning af en saccharosegradientfraktionering procedure) er anbefales, når der er behov for elbiler for funktionelle assays. Ultracentrifugering fjerner urenheder inklusive serumproteiner og andre opløselige urenheder fra plasma, som kan påvirke funktionelle eksperimentelle resultater. Imidlertid ultracentrifugering er tidskrævende og kan ændre EV mængde og kvalitet 12.
"> Forventede resultater for de to påvisningsassays er afbildet i figurerne 2-3. For den enkelte detektionsassayet, den lyserede kontrol (nederste række, figur 2) bruges til at indstille porte for den tilsvarende ikke-lyserede prøve (øverste række, figur 2). bør De fleste hændelser henhører under EV gate. Quadrant porte skal ikke afsløre dobbelt positive begivenheder, når de to markører i forhold normalt ikke findes på den samme celle. De rigtige biparameter parceller i figur 2 viser markørerne CD108a og CD235a , som er to røde blodlegemer markører, der vides at eksistere på celler. Her på EVT over halvdelen af de positive begivenheder er positive for begge markører, som forventet. På samme måde, at celleoverflademarkører kendte opholde sig på den samme celle bør viser lignende mønstre af dobbelt positivitet på elbiler. De center biparameter plots viser EV udtryk for to markører, der er kendt for ikke at sameksistere på celler. I denne analyse af CD235a (en rød Blood celle markør) og CD41a (en blodplade markør), EVS viser distinkte, særskilte, positive populationer, hvilket forventes, da de kommer fra forskellige celletyper. Når lyseret bør positive begivenheder forsvinde. Generelt eventuelle positive begivenheder tilbage efter lysis indikere tilstedeværelsen af signal, der kommer fra ikke-vesikelpartikler, aggregater, og / eller vaskemidler-resistente elbiler. Figur 3 viser forventede resultater ved hjælp af perle-baserede påvisningsmetode. I modsætning til den individuelle påvisningsmetode disse data ikke kan / skal ikke ses i bi-parameter plots. I den øverste dot plots, ingen adskillelse mellem de positive og negative populationer findes, og hændelser vises i dobbelt positive kvadranter selvom de normalt ikke findes på samme celletyper på grund af det faktum, at begge typer af elbiler vil binde til en enkelt perle. For perle-baseret detektion metode, data bedst analyseres ved hjælp histogram overlejringer med den negative kontrol (afbildet under dot plots). Positivitet Is, målt ved hjælp af en markør MFI (gennemsnitlig fluorescensintensitet) og sammenlignet direkte med den negative kontrol. Hvis en prøve er positiv for markøren pågældende, vil dens MFI være højere end den negative kontrol. Den negative kontrol for perlen metode er simpelthen perler blokeret med BSA (ingen elbiler tilsat), som er blevet farvet med de samme antistoffer og vasket sammen EV-belagte kugler. En sammenligning af de forventede resultater ved hjælp af de to metoder kan ses i figur 4.Evnen af den individuelle påvisningsassay til at vurdere EV fænotyper er stærkt afhængig korrekt gating at adskille Ab-positive begivenheder fra baggrundsfluorescens. Derfor er det vigtigt at vælge en negativ kontrol, som mest hensigtsmæssigt efterligner / forudsiger baggrundsfluorescens for en given prøve. Når farvede elbiler ikke vaskes før læsning, der almindeligvis anvendes negative kontroller (f.eks isotyper) undlader at præcist at forudsige baggrund fluorescence for alle markører (figur 5A). I disse tilfælde, hvis vask ikke er en mulighed, lyserede prøver tendens til at fungere bedre til at forudsige baggrundsfluorescens. Men når farvede elbiler vaskes før læsning (ved hjælp af centrifugal filtrering, i dette tilfælde), begge negative kontroller (isotyper og lyserede prøver) fungerer godt til at forudsige baggrundsfluorescens af en prøve (figur 5A). Det skal dog bemærkes, at mens alle negative kontroller "arbejde," lyserede kontroller foretrækkes, fordi de giver yderligere oplysninger om en prøve (fx tilstedeværelsen af detergent-resistente, ikke-vesikel hændelser og / eller aggregater), som kan resultere i ikke-EV positive signaler og forkert puste Ab tæller. Endvidere kan isotypekontroller undertiden være upålidelige, selv i vaskede prøver, som vist i figur 5B, hvor den farvede prøve har færre positive begivenheder end den samme prøve plettet med matchede isotypekontrol antistoffer. Uden grundig fjernelse af ubundet antistof, er næsten umuligt at fortolke FCM dot plots af nogle EV markører, der optræder som skyer af svagt fluorescerende partikler ikke kan skelnes fra deres højt fluorescerende baggrunde (figur 6, øverste plot). Vask farvede prøver under anvendelse centrifugal filtre forbedrer adskillelsen mellem baggrunden og positive markør signaler (figur 6, bund plot); Imidlertid kan små elbiler og exosomer tabt gennem porerne i filteret.
Anvendelsen af et detergent lysis trin afslører positive, blæredannende efterligne begivenheder fra immunkomplekser og protein aggregater 21. Når PPP analyseres ved hjælp af individuel påvisning, støder positive begivenheder, som ikke forsvinder med lyse er en temmelig ofte forekomst. Disse detergent-resistente hændelser forekommer ofte som mistænkelige, meget fluorescerende diagonale signaler i både enkelt parameter og biparameter plots (figur7). Klinisk disse protein-komplekser og / eller uopløselige immunkomplekser er mere fremherskende i patienter ramt af forskellige sygdomme 21, såsom rheumatoid arthritis 28, nefrotisk syndrom 19 og systemisk lupus erythematosus 29. Derfor, afhængigt af formålet med den forskning, kan man ønsker at inkludere eller fjerne dem fra analysis.Another måde diagonal signaler kan fremkomme, er ved vortex prøverne, især efter tilsætning af lysis reagens (figur 8). Prøver der altid skal blandes op og ned med pipette for at forhindre dannelsen af aggregater.
Figur 1: behandling ordningen Samlet til isolering og afsløring af elbiler ved hjælp af enten perle-baserede metode eller individuel påvisningsmetode. (A) Fuldblod først forarbejdes til PPP. Frare, PPP kan enten behandles yderligere hjælp ultracentrifugering at give isolerede elbiler eller anvendes som den er i det enkelte afsløring eller perle assays. (B) Oversigt over foreslåede pladediagram til high throughput prøve analyse ved hjælp af den enkelte påvisningsmetode. Klik her for et større version af dette tal.
Figur 2:. Forventede resultater for Individual Detection flowcytometri dot plots viser repræsentative farvning af lyserede og lyserede EV prøver. Værdier viser procentdele af positive begivenheder. Hovedparten af hændelser falder EV gate. Begivenheder, der er vist i den rigtige biparameter plots er inden FSC / SSC EV porte til venstre. Den lyserede prøve (nederste række) bruges til at indstille fluorescerende-baserede porte for each tilsvarende (ikke-lyserede) prøve. Quad porte bør ikke afsløre dobbelt positive begivenheder, når de to markører i forhold normalt ikke findes på den samme celle. Her biparameter CD235a og CD41a plot viser en tydelig adskillelse mellem elbiler udtrykker røde blodlegemer markører og de udtrykker blodplade cellemarkører. Ligeledes bør celleoverflademarkører kendt for at opholde sig på den samme celle viser lignende mønstre af dobbelt positivitet på elbiler. Den rigtige biparameter plot viser, at over halvdelen af CD235a-positive elbiler er også positive for den sekundære røde blodlegemer (RBC) markør, CD108a. Når lyseret bør positive begivenheder forsvinde. Positive begivenheder tilbage efter lysis indikere tilstedeværelsen af signal, der kommer fra ikke-vesikel eller vaskemiddel resistente partikler og / eller aggregater.
Figur 3: Forventede resultater ved hjælp af perle-detektionmetode. Flowcytometri dot plots viser repræsentative farvning af elbiler koblet til perlerne i forhold til kugler blokeret med BSA, der tjener som negativ kontrol. Værdier viser procentdele af positive begivenheder. Begivenheder, der er vist i den rigtige biparameter plots er inden FSC / SSC perler porte til venstre. For perlerne-baseret detektion metode, data bedst analyseres ved hjælp histogram overlejringer med den negative kontrol (afbildet under dot plots). Positivitet måles ved anvendelse af en markør MFI (gennemsnitlig fluorescensintensitet) og sammenlignet direkte med den negative kontrol.
Flow Sammenligning af de forventede resultater ved hjælp af perler vs. individuel påvisning cytometri dot plots viser repræsentative farvning af elbiler koblet til kugler (øverste række), i forhold til elbiler analysere ved hjælp af individuel detektion (nederste række): Figur 4.. Begivenhedervist i højre biparameter plots er inden FSC / SSC perler porte til venstre.
Figur 5:. Sammenligning af forskellige negative kontroller i de enkelte afsløring analyse Værdier viser procentdele af positive begivenheder. Begivenheder viste er inden for FSC / SSC EV gate. (A) Sammenligning af negative kontroller i uvasket vs. vaskede prøver. Isotype eller lyserede kontroller blev evalueret for deres evne til at tilvejebringe passende indikationer af baggrundsfluorescens på tværs af to forskellige markører i en fuldt farvede prøve (nederste række). Gates for hver markør blev foretaget ved hjælp af den lyserede prøve (øverste række) og derefter kopieret til rækkerne nedenunder. Vaskede prøver blev vasket under anvendelse af post-plet filtrering. (B) Eksempel på en prøve farvet med isotypekontrol har flere positive begivenheder end prøven farves with faktiske antistof.
Figur 6:. Virkning af post-plet vask i individuel afsløring værdier viser procenter og antal positive begivenheder. Begivenheder viste er inden for FSC / SSC EV gate. Gates for hver prøve blev foretaget ved hjælp hver prøves lyseret modpart (ikke vist, se tidligere tal for gate-indstilling i uvaskede vs vaskede prøver). Høj baggrundsfluorescens gør skelne positive fra negative begivenheder vanskeligt (top plot). Når vasket imidlertid den positive population afsløret som ubundne fluorescerende antistoffer fjernes og baggrundsfluorescens reduceres (nederste afbildning).
Figur 7: Vaskemiddel lyse bekræfter tilstedeværelsen af ikke-EV signals. Begivenheder viste er inden for FSC / SCC EV gate. Værdier viser procentdele af positive begivenheder. Farvede EV prøver blev læst før (venstre kolonne), og efter tilsætning af rengøringsmiddel (højre kolonne) for at identificere positive signaler forårsaget af immunkomplekser og andre ikke-EV-relaterede begivenheder.
Figur 8: vortex forårsager forekomsten af ikke-EV signaler Events viste er inden for FSC / SCC EV gate.. Værdier viser procentdele af positive begivenheder. Farvede EV prøver blev læst før (venstre kolonne) og efter tilsætning af detergent (højre kolonne). Ved hjælp af en vortex at blande prøver kan forårsage EV-efterligner, diagonale populationer til dannelse (øverste række). Når blandet forsigtigt op og ned ved hjælp af en pipette, men dannelsen af disse befolkningsgrupper kan undgås (nederste række). Vortex anbefales ikke til blanding, da det kan forårsage aggregering i nogle prøver, leading til diagonal-vises, positive befolkninger. Generelt bør begivenhed nummer indenfor en positiv gate ikke stige efter lysere.
| Bead-baseret detektion | Individuel Detection | |
| EV Størrelser | anbefales kun <100 nm | anbefales til> 100 nm kun |
| Tid | kræver inkubation natten | kan gennemføre i <1 døgn |
| Følsomhed | klynge afsløring | enkelt afsløring partikel |
| Resultater | kvalitative | kvantitativ |
| Vask | enkel, standard centrifugering | kræver centrifugalfiltre |
| Negativ kontrol | BSA-overtrukne perler | lyserede prøver |
Tabel 1: Fordele og ulemper ved begge metoder til påvisning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To forskellige protokoller til isolering, behandling og analyse af elbiler blev præsenteret, under anvendelse af enten en enkelt detektering eller perle tilgang. Valg den mest hensigtsmæssige metode at bruge, er ikke altid ligetil og kræver en forståelse af den prøve, der testes, samt de individuelle subpopulationer af interesse. Desuden skal følsomheden af cytometeret anvendes til erhvervelse overvejes, når du vælger den mest hensigtsmæssige metode. Ofte er der ingen enkelt bedste protokol til at bruge, snarere en kombination af metoder giver mere information om en prøve end nogen metode alene. Ideelt bør flere forskellige isolerings- og detektionsteknikker først evalueres med henblik på at udvikle en skræddersyet protokol, der tager hensyn til individuelle cytometeret ydeevne med hensyn til den specifikke EV population blev undersøgt. Alternative isoleringsteknikker omfatter ultracentrifugering, sucrose densitet fraktionering, immunomagnetisk BEAD separation, kromatografi og affinitetsoprensning 12, mens alternative påvisningsmetoder omfatter scanning elektronmikroskopi, transmissionselektronmikroskopi, atomic force mikroskopi, dynamisk lysspredning, og Western blotting 8. Ved at kombinere forskellige teknikker, kan de metoder, der præsenteres her, tilpasses for at skabe protokoller bedst egnet til at studere forskellige EV populationer af interesse.
Generelt individuel påvisning af elbiler ved hjælp af FCM fungerer godt for at analysere større elbiler, men mister følsomhed som elbiler bliver mindre. Mens enkelte opdagelse er mere konsekvent i forbindelse med afsløring af større elbiler, perle-baseret detektion er mindre følsom i forbindelse med afsløring af større elbiler og mere følsomme for exosomer. Større elbiler kan vaskes nemt via post-plet filtrering og påvist enkeltvis via FCM. Mindre elbiler og exosomer, på den anden side er ikke påvist godt individuelt ved hjælp af FCM og er meget mere vanskeligt at vaske post-farvning. Perlen-captureprotokol løser begge disse spørgsmål, så elbiler til at være let vaskes og flere elbiler, der skal måles sammen for at skabe større positive signaler påvises ved FCM. Der er imidlertid ulemper forbundet med anvendelse af denne fremgangsmåde, som er skitseret i tabel 1.
Når man arbejder med en mindre følsom cytometer, evnen til individuel registrering er begrænset. Før EV analyse bør følsomheden af cytometret bestemmes ved anvendelse af en blanding af perlestørrelser spænder fra 0,1 til 1,0 um. Svigt af cytometeret til at detektere et flertal af partikler under 1,0 um vil nødvendiggøre brugen af perle-baseret protokol. Overudtrykt markører let detekteres ved anvendelse af enten protokol. Sjældnere populationer er undertiden lettere at detektere ved hjælp af enkelt detektion partikel protokol snarere end perlen capture protokol, men dette kan variere afhængig af sådanne variabler som: lysstyrke fluorokrom, prøvens EV: perle rtio, og størrelsen af EV bærer sjældne celleoverflademarkør. Påvisning af flere markører på en enkelt partikel nødvendiggør anvendelsen af den individuelle påvisningsmetode. Perlen-baserede metode er ikke i stand til individuelt EV detektion. Derfor vil det perle-baseret protokol gav data, der er mere kvalitative, mens den individuelle påvisningsmetode vil give mere kvantitative data.
Yderligere isoleringsteknikker skal udnyttes, når der er behov for elbiler for efterfølgende anvendelser. Elbiler anvendes i funktionelle assays bør ultracentrifugeres ved hjælp af 3-trins differentiel centrifugering protokol, eftersom de opløselige serumproteiner i plasma kan påvirke funktionelle eksperimentelle resultater. Til karakterisering af elbiler, men ultracentrifugering ikke anbefales, da denne ekstra trin kan påvirke EV kvalitet og mængde på grund af de store kræfter bibringes på partiklerne 12.
Den enkelte afsløring Protokollen indeholder several vigtige skridt, der er optimeret til high-throughput test, herunder: 1) gennemførelse af centrifugal filtre til hurtig og effektiv fjernelse af positive hændelser forårsaget af Ab aggregater, 2) anvendelse af filtre som en mere praktisk alternativ til ultracentrifugering eller saccharosegradientfraktionering til vask ubundet Ab fra EV prøver efter farvning, og 3) udnyttelse af vaskemiddel lyse som en negativ kontrol, som ikke kun afslører positive hændelser forårsaget af ikke-elbiler, men giver en god tilnærmelse til baggrundsfluorescens at skelne positive fra negative befolkninger for tegning gates. Anbefales enkelte detektering protokol, når et stort antal prøver behov prøvning som den kan udføres på en enkelt dag, mens vulsten-baserede metode kræver en inkubation natten over.
De negative kontroller for hver protokol har forskellige fordele og ulemper, afhængigt af hvilken detektionsmetode anvendes. En fordel ved anvendelse af perle-baserede enssay er, at de samme monoklonale antistoffer kan anvendes til negative og positive rør og samme negative kontrol kan anvendes for alle prøver. Den individuelle påvisningsmetode, på den anden side, kræver separate kontroller, der skal læses for hver undersøgt prøve. Den negative kontrol anvendes af de enkelte påvisning protokollen bruger lyserede prøver, som ikke kræver anvendelse / forbrug af yderligere antistoffer, men kræver, at hvert rør læses en gang efter tilsætning af det lyserende middel. De lyserede kontroller har den ekstra fordel af at være i stand til at identificere den del af positivt signal, der kan henføres til ikke-vesikel-relaterede begivenheder som immunkomplekser 21. Perlen assay ikke har denne evne todistinguish mellem positive signaler skyldes sande elbiler og dem, der skyldes ikke-vesikler.
Begrænsninger af teknikken
Mens der ikke er nogen standardiseret metode til isolering af elbiler, differentialcentrifugering er en meget anvendt teknik blandt EV forskere. Den her beskrevne differentialcentrifugering metode er baseret på fælles protokoller til isolering af PPP, som typisk kræver en indledende centrifugering mellem 1200-1500 xg i 10-20 min for at fjerne celler, efterfulgt af en anden centrifugering mellem 10,000-13,000 x g i 10-30 min for at fjerne blodplader 35. Den heri beskrevne protokol anvender en centrifugering ved 1.500 xg i 10 minutter efterfulgt af en centrifugering ved 13.000 xg i 10 min. Mens højere kræfter 25,000-100,000 xg typisk kræves til pelletering elbiler, kan nogle af de større elbiler fjernes med differentialcentrifugering protokol, vi har fremlagt.
Op til 90% af elbiler detekteret af FCM er tabt med en timer ultracentrifugering ved 100.000 xg (data ikke vist). Bør overvejes Længere centrifugeringstider, omend forsigtigt, da dette kan have en negativ indvirkning på prøvens sammensætning. Hvis yderligere behandling er nødvendig feller karakterisering undersøgelser, kan filtrering udføres efter 2-trins centrifugering (før farvning) for yderligere at fraktionere prøver baseret på partikelstørrelse. Svarende til ultra-centrifugering, kan filtrering resultere i et tab på op til 50% af positive markør begivenheder og op til 90% af de samlede partikler detekteres af FCM (data ikke vist). Mens stigningen i signal-til-støj-forholdet er af indlysende fordel, tab af mindre elbiler udgør en væsentlig begrænsning ved enhver vask eller isolation metode.
Endelig anvendte antikoagulant (f.eks, heparin, ACD, ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), etc.) under indsamlingen af blod kan påvirke kvaliteten og mængden af EV indhold. Mens ACD har vist sig at være en god og pålidelig antikoagulans for vores studier, anbefales at teste flere løsninger for at sikre, at den bedst egnede antikoagulant for anvendelsen vælges. Dette er især vigtigt, når elbiler vil blive brugt i downstream analyserhvor det antikoagulerende anvendes, kan påvirke resultatet. For eksempel er nogle antikoagulanter (f.eks EDTA og heparin) vides at interferere med PCR-reaktioner, mens andre (fx theophyllin, adenosin og dipyridamol) er blevet vist at inhibere EV frigivelse fra blodplader 12.
Metoder til EV analyse mens væsentligt forbedret i det seneste årti, er stadig et arbejde i gang. I sidste ende, idet de bedste metoder til at analysere elbiler vil afhænge af forskning og redskaber til rådighed for forskeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dale Hirschkorn fra Blood Systems Research Institute for hans hjælp med flowcytometer instrumentindstillinger. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud HL095470 og U01 HL072268 og DoD kontrakter W81XWH-10-1-0023 og W81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
