Summary
Viele verschiedene Methoden existieren für die Messung der extrazellulären Vesikeln (EVs) mittels Durchflusszytometrie (FCM). Mehrere Aspekte sollten bei der Bestimmung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Zwei Protokolle zur Messung EVs präsentiert werden, unter Verwendung von entweder einzelnen Detektions oder einen Wulst-basierten Ansatz.
Abstract
Extrazellulären Vesikeln (EVs) sind kleine, Membran-abgeleiteten Vesikeln in Körperflüssigkeiten, die in Zell-Zell-Kommunikation stark beteiligt sind und der Regulierung eines vielfältigen biologischen Prozesse gefunden. Analyse von Elektrofahrzeugen mit Durchflusszytometrie (FCM) ist notorisch schwierig, die aufgrund ihrer geringen Größe und der Mangel an diskreten Populationen positiv für Marker von Interesse. Methoden zur Analyse EV, während sich im Laufe der letzten zehn Jahre verbessert, sind immer noch ein work in progress. Leider gibt es keine one-size-fits-all-Protokoll, und mehrere Aspekte zu berücksichtigen bei der Festlegung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Vorgestellt werden verschiedene Techniken für die Verarbeitung von EVs und zwei Protokolle zur Analyse von EVs entweder Einzelerkennung oder einen Wulst-basierten Ansatz. Die hier beschriebenen mit Eliminierung der Antikörperaggregate üblicherweise in kommerziellen Präparaten unterstützen Methoden ansteigendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis, und Einstellen Gates in einer rationalen fashion das Detektieren von Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Das erste Protokoll verwendet einen einzelnen Erkennungsverfahren, das zum Analysieren eines hohen Volumens von klinischen Proben besonders gut geeignet ist, während das zweite Protokoll verwendet ein Wulst basierten Ansatz zu erfassen und zu erkennen kleineren EVs und Exosomen.
Introduction
Extrazellulären Vesikeln (EVs) sind kleine, Membran-abgeleiteten Vesikeln in Körperflüssigkeiten, die in Zell-Zell-Kommunikation stark beteiligt sind und der Regulierung eines vielfältigen biologischen Prozesse gefunden. Analyse von Elektrofahrzeugen mit Durchflusszytometrie (FCM) ist notorisch schwierig, die aufgrund ihrer geringen Größe und der Mangel an diskreten Populationen positiv für Marker von Interesse. Methoden zur Analyse EV, während sich im Laufe der letzten zehn Jahre verbessert, sind immer noch ein work in progress. Leider gibt es keine one-size-fits-all-Protokoll, und mehrere Aspekte zu berücksichtigen bei der Festlegung der am besten geeignete Methode, um zu verwenden. Vorgestellt werden verschiedene Techniken für die Verarbeitung von EVs und zwei Protokolle zur Analyse von EVs entweder Einzelerkennung oder einen Wulst-basierten Ansatz. Die hier beschriebenen mit Eliminierung der Antikörperaggregate üblicherweise in kommerziellen Präparaten unterstützen Methoden ansteigendes Signal-zu-Rausch-Verhältnis, und Einstellen Gates in einer rationalen fashion das Detektieren von Hintergrundfluoreszenz zu minimieren. Das erste Protokoll verwendet einen einzelnen Erkennungsverfahren, das zum Analysieren eines hohen Volumens von klinischen Proben besonders gut geeignet ist, während das zweite Protokoll verwendet ein Wulst basierten Ansatz zu erfassen und zu erkennen kleineren EVs und Exosomen.
EVs, die auch als Mikropartikel bekannt, sind kleine, Membran-abgeleiteten Vesikeln in Körperflüssigkeiten, die in Zell-Zell-Kommunikation beteiligt sind und der Regulierung eines vielfältigen biologischen Prozesse 1 gefunden. Durch Expression von verschiedenen Oberflächenmarkern und / oder die direkte Übertragung von biologischem Material sind EVs Lage, die Funktion der Empfängerzellen zu ändern, um zu spielen, entweder Aktivierung oder Unterdrückung von Rollen bei der interzellulären Kommunikation 2-4. Klinisch Blutplättchen stamm EVs sind dafür bekannt, starke Antikoagulansaktivität 5 müssen und andere haben gezeigt, dass für eine Vielzahl von Bedingungen beitragen, von der Förderung des Tumor metastasis 6 zum Schutz vor Krankheiten 7. EVs in kleinere Gruppen von Zellen abgeleiteten Vesikeln wie beispielsweise Exosomen und Mikrovesikel (MVs) klassifiziert werden, abhängig von ihrer Größe und dem Mechanismus der Erzeugung 8. Die Nomenklatur der Zellen stammenden Vesikel Subpopulationen weiterhin ein Thema der aktuellen Debatte 8,9 sein, jedoch Exosomen sind im Allgemeinen als klein beschrieben, 40 bis 100 nm Teilchen endosomalen Fusion mit der Plasmamembran abgeleitet, während MVs größer 100 bis 1.000 durch den Abbau der Plasmamembran 10 ausgebildet nm Teilchen. Hier wird der allgemeine Begriff "Elektrofahrzeuge" verwendet werden, um alle Arten von extrazellulären biologischen Vesikel von den Zellen freigesetzt zu verweisen.
Isolierung von EVs aus Vollblut ist ein mehrstufiges Verfahren und viele verschiedene Verarbeitungsvariablen gezeigt worden, EV Inhalt einschließlich Lagertemperatur und Dauer 11,12 Antikoagulans / Konservierungsmittel 13 und beeinflussenZentrifugationsverfahren verwendet 14. Eine Notwendigkeit der Standardisierung dieser Variablen hat den Empfehlungen der Internationalen Gesellschaft für Thrombose und Hämostase Wissenschaftliche und Standardization Committee (ISTH SSC) für die Blutverarbeitung und EV Isolierungsverfahren 15,16 geführt, doch gibt es keinen Konsens unter den Wissenschaftlern über die optimale Protokoll verwenden 12. Die meisten sind sich aber einig, dass streng kontrolliert präanalytische Variablen sind entscheidend für genaue und reproduzierbare Daten.
Um EVs analysieren, haben Forscher verschiedene Verfahren verwendet, einschließlich der Transmissionselektronenmikroskopie 17, Rasterelektronenmikroskopie 18,19, Atomkraftmikroskopie, der dynamischen Lichtstreuung 20,21 und Western Blotting 22,23. Während FCM ist die Methode der Wahl für viele Forscher 9,24 - 26 wegen seiner hohen Durchsatzkapazitäten, Analyse von Elektrofahrzeugen mit FCM istnotorisch schwierig aufgrund ihrer Größe und der Mangel an diskreten positive Bevölkerungs 27-32. Im Vergleich zur Analyse von Zellen, die geringe Größe der EVs ergibt 1) weniger Fluoreszenz aufgrund der geringeren Anzahl von Antigenen pro Teilchen emittiert wird, und 2) begrenzter Durchführbarkeit post-Fleck Waschen, die notwendig ist, die Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Gemeinsame Herausforderungen unter den Forschern umfassen Signale, die aus Immunoglobulinaggregaten 27,28 und Selbstaggregation von Antikörpern 29. Außerdem sind die langen Bearbeitungszeiten und langwierigen Wasch / Isolationsverfahren von vielen der derzeitigen Protokolle 33,34 verwendet werden, erfordern Mehrtageszeit Zusagen, um eine kleine Anzahl von Proben zu analysieren, so dass sie weniger als ideal für Anwendungen mit hohem Durchsatz. Einige Forscher verzichten einen Waschschritt zusammen und macht traditionell verwendet FCM Negativkontrollen wie Fluoreszenz minus eins (FMO) und Antikörper-Isotypen nutzlos für eine präzise Bewertung background Fluoreszenz 30.
Unsere Protokolle adressieren drei häufige Probleme, die richtige FCM-Analyse von Elektrofahrzeugen behindern können: Signale, die aus Antikörperaggregate und andere nicht-Vesikel, Schwierigkeiten beim Entfernen ungebundener Antikörper und Mangel an erkennbaren positiven Populationen. Die hier beschriebenen Techniken mit Eliminierung der Antikörperaggregate üblicherweise in kommerziellen Präparaten erhöht Signal-zu-Rausch-Verhältnis, und Einstellen Gates in rationeller Weise, die Detektion von Hintergrundfluoreszenz minimiert unterstützen. Zwei unterschiedliche Detektionsmethoden werden hier präsentiert: das erste Protokoll verwendet einen einzelnen Erkennungsverfahren, das zum Analysieren eines hohen Volumens von klinischen Proben besonders gut geeignet ist, während das zweite Protokoll verwendet ein Kügelchen basierenden Ansatz zu erfassen und zu erkennen kleineren EVs und Exosomen.
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Protocol
HINWEIS: Die folgenden Protokolle wurden in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das Wohlergehen der Menschen durchgeführt. Alle menschlichen Subjekt Proben wurden unter einem Institutional Review Board (IRB) -zugelassene Protokoll und mit Einwilligung der Versuchspersonen getestet.
1. Methode A: Individuelle Erkennungsmethode
1.1) Die Verarbeitung von Blut-Probe / Isolation von Elektrofahrzeugen
- Blutentnahme vom Spender / Patienten in zwei 10 ml Glasröhrchen mit 1,5 ml ACD-A-Lösung oder einem anderen geeigneten Antikoagulans und Prozess sofort (innerhalb von 30 Min), mit dem folgenden 2-Schritt differentielle Zentrifugation Protokoll.
Hinweis: Dieses Protokoll wird aus den kombinierten ~ 17 ml Blut entnommen etwa 10 ml plättchenarmes Plasma (PPP) zu erhalten. Wenn mehr oder weniger PPP benötigt wird, kann die Anzahl der Rohre von Blut gesammelt entsprechend angepasst werden. - Zentrifugiere die Proben bei 1500 g für 10 min bei RTum das Plasma aus dem Buffy-Coat und rote Zellen zu trennen. Übertragen Sie 1,2 ml Aliquots der Plasmaüberstand bis 1,5 ml Zentrifugenröhrchen, darauf achten, daß die unteren Schichten mit dem Buffy-Coat und roten Zellen zu stören.
- Schleudern bei 13.000 xg für 10 min bei RT an Blutplättchen und große Zelltrümmer zu entfernen. Sorgfältig überweisen Sie den PPP und hinterließ 200 ul zu vermeiden, das Pellet aufzurühren und fügen Sie die PPP in ein neues Röhrchen.
- An dieser Stelle verwenden PPP sofort für die Analyse oder die Übertragung in 1,0 ml Aliquots auf neue 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen und bei -80 ° C für bis zu zwei Jahren für eine spätere Analyse (siehe 1A Übersicht Abbildung).
- Wenn gereinigt EVs sind für funktionelle Experimenten Übertragungs 6 ml des PPP zu einem Ultrazentrifugenröhrchen benötigt und füge 28 ml von 0,2 & mgr; m filtriert, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Spin für 60 min bei 100000 · g bei RT mit einer Ultrazentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet. Überstand entfernen und resuspendieren EV pellassen Sie in 1,5 ml Medium.
HINWEIS: Für höchste Reproduzierbarkeit, Blutproben sollten so konsequent wie möglich von Spender zu Spender verarbeitet werden. Eine Differenzierung der EV Isolation Methode könnte einen wesentlichen Einfluss auf die Anzahl und Art von Elektrofahrzeugen erkannt.
1.2) Vorbereitung Proben für die Analyse
HINWEIS: Von diesem Zeitpunkt an werden die Schritte erläutern, einen hohen Durchsatz Protokoll zur Analyse von 12 Proben für 14 Marker in 3 Panels. Jedoch können auch andere Kombinationen von Antikörpern, hier verwendet werden; das Protokoll angepasst, um andere EV Bevölkerung, indem die vorgeschlagenen Marker für diejenigen von Interesse zu untersuchen.
- Entfernen 12 Proben aus dem Gefrierschrank und Auftauen bei 37 ° C (wenn bei -80 ° C gelagert).
- Pipette Inhalt nach oben und unten mehrere Male, um zu mischen. Entfernen Sie 320 ul von jeder Probe und zu der oberen Reihe einer 96-Well-Platte.
HINWEIS: Ein breitenverstellbar Multi-Well-Pipette ist äußerst hilfreich für diese und viele andere Schritte in der ganzen Arschay, insbesondere bei der Analyse von mehreren Proben gleichzeitig.
1.3) Die Färbung EV Proben
- Vor dem Färben, filtern alle Antikörper (Abs), um Aggregate zu entfernen, die positive Signale verursachen können.
- Kombinieren Antikörper in jeder der Platten 3 in einzelne 0,22 um Filterzentrifuge und Zentrifugenröhrchen mit einem festen Winkel einzigen Geschwindigkeitszentrifuge (~ 750 · g) bei RT für 2 Minuten verwendet werden, oder bis der gesamte Ab Mischung durch den Filter geleitet und keine Antikörperflüssigkeit auf der Oberfläche des Filters bleibt. Shop Ab Cocktails im Kühlschrank bis zu zwei Wochen, aber erneut Filter vor jedem Gebrauch.
- Fügen Sie die entsprechende Menge des gefilterten Ab Mischung in jede Vertiefung in der Reihe 2 (zB Proben in Panel I werden mit 2 ul jeder Ab gefärbt, so dass insgesamt 12 ul des gefilterten Ab Cocktail pro Vertiefung zugegeben zu Zeile 2). Siehe 1B für einen Überblick über die vorgeschlagene Platten Karte Abbildung. Wiederholen Sie diese zusätzlichs zu den Zeilen darunter, wenn mehr Platten ausgeführt (dabei ist, füge 8 ul / Vertiefung des Panel II Cocktail bis 3 und 11 ul / Vertiefung des Panel III Cocktail zu Zeile 4 Zeile, siehe Materialliste für spezifische Panel Informationen).
- Mit dem Mehrkanalpipette, mischen Sie die PPP-Proben in Reihe 1 nach oben und unten und dann 100 & mgr; l aus den Vertiefungen in Zeile 1 in die Vertiefungen in Reihe 2. Mischen Sie nach oben und unten. Tipps und wiederholen Sie die Änderung, Übertragung 100 ul von Reihe 1, Zeilen 3 und 4. Inkubation bei 4 ° C für 30 min.
1.4) Wasch MV Proben
- Entfernen Sie die Platte mit 96 Vertiefungen von 4 ° C und Transfer zum biologischen Sicherheitsschrank. Mit einer Mehrkanal Pipette 220 ul PBS / Well, Zeilen 6-8 (bis zum Spülen / Waschen der Vertiefungen mit Bunt PPP verwendet werden).
- Den Inhalt der Vertiefungen zu voretikettierten Kreiselfilterrohre mit Hilfe der Breite anpassbare Mehrkanalpipette (für 12 Proben, mit 3 Panels von Antikörpern, 12 x 3 = 36 Filterrohre werdenbenötigt werden). Mit den gleichen Spitzen, nehmen 200 ul PBS aus den Wasch Zeilen und fügen Sie in die entsprechenden Wells, von der PPP war einfach entfernt werden.
- Mischen Sie nach oben und unten, um die Wells spülen und übertragen Sie die Spüllösung auf dieselben Filter auf die der PPP wurde zuvor aufgenommen. Schließen Spitzen der Kreisel Filter. Tipps ändern.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den restlichen gefärbte Proben, bis alle befleckt PPP Proben wurden zusammen mit ihren Spüllösungen zu Schleuderfilter übertragen.
- Übertragen Sie die Kreisel Filter auf einen festen Rotor Zentrifuge und Spin bei 850 × g für 3 min bei RT.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass keine Flüssigkeit auf die Filterplatten bleibt. Nach der Zentrifugation sollte der Filter erscheinen "trocken" mit keinen sichtbaren Flüssigkeitsschicht auf der Oberseite verbleibenden sein. Obwohl unwahrscheinlich, dass bestimmte PPP Proben erfordern eine längere Zentrifugationszeit, effektiv durch den Filter bewegen. - Die zentrifugalen Filterrohre entfernen und zur biologischen Sicherheitsschrank.Mit dem Mehrkanalpipette resuspendieren die Oberseiten der Filter in 300 ul PBS. Bringen Sie zur sofortigen FCM-Analyse die resuspendierten Inhalte vorab markierten Röhrchen.
HINWEIS: Es ist sehr wichtig, um die Kraft und die Anzahl der Pipettenkolbenvertiefungen konsistent zu halten, um Proben von Probe zu Probe Variation zu vermeiden. Diese sollte im Idealfall unter Verwendung einer elektronischen Pipette, die programmiert ist, um auf und ab einem bestimmten Volumen pipettieren geführt werden (beispielsweise 280 & mgr; l) einer genauen Anzahl von Malen (beispielsweise 8-fach) für jede Probe.
1.5) Cytometer-Setup
- Öffnen Sie die FCM-Software. Vor dem Setup zu experimentieren, gehen täglich Gerätekalibrierung und Setup mit Geräteeinstellung Perlen (nach Herstellerangaben).
- Wenn der EV-Proben mit mehr als einem Antikörper gefärbt worden und mehrere Fluorochrome auf einmal gemessen werden, zu berechnen Korrekturwerte wie folgt:
- 2 Tropfen Entschädigung Perlen vor,-markierten Rohre (1 Röhre für jedes Fluorochrom konjugierte Antikörper), und fügen Sie die empfohlene Menge an Antikörper. 2 Tropfen negative Kompensations Perlen in ein anderes Röhrchen als ungefärbte Kompensationssteuerung zu verwenden.
- Inkubieren bei 4 ° C für 30 Minuten, Waschen mit PBS und Resuspendieren in 400 ul PBS.
- Mit dem Durchflusszytometer-Software mit dem Gerät enthalten sind, laufen jede Ausgleichsrohr und passen fluoreszierende Spannungen, jeden Peak bei etwa 10 4 auf einer 5-Dekade logarithmischen Skala zu platzieren. Sicherzustellen, dass der Fluoreszenz-Peak am höchsten (am hellsten) in einem eigenen Fluoreszenzkanal im Vergleich zu allen anderen Kanälen und erneut einstellen Spannungen Fluoreszenzparameter, falls erforderlich. Führen Sie jede einzeln gefärbten comp Rohr und erfassen mindestens 5.000 Veranstaltungen pro Röhrchen.
- Wählen Sie die Registerkarte "Experiment", wählen Sie dann "Compensation", wählen Sie dann "Vergütung berechnen", um Korrekturwerte für alle Proben beantragen.
- Während der Ausführung eines Rohrs von 0,22 & mgr; m-filtriert PBS, passen die FSC und SSC Spannungen an die höchsten Werte, die den Großteil der Hintergrundrauschen (dh knapp unterhalb der Schwellenspannung, bei der Ereignisrate überschreitet 5-Ereignisse / sec) aus.
- Als nächstes führen Sie ein Röhrchen mit 0,2 um - 1,0 um Glasperlen, in PBS verdünnt, wenn nötig. In einem FCS vs. SSC Plot, ziehen ein Gatter um den Wulst Bevölkerung, an Veranstaltungen finden zwischen 0,2 um und 1,0 um zu erfassen. Alternativ kann in einem SSC-H Histogramm, zeichnen Sie ein Tor, um alle Ereignisse kleiner als die 1,0 um Kügelchen enthalten.
- Durchflussrate der Zytometer ist auf "Lo" (etwa 8-12 & mgr; l / min). Verwendung der Kügelchen Rohr (oder anderen Röhre mit einer bekannten Konzentration von Kugeln) die Durchflussratenscheibe am Zytometer bis Vorabendnt Rate erreicht rund 200 Veranstaltungen / sec. Alle Probenröhrchen mit der gleichen Fließrate und die gleiche Perlenkonzentration in zukünftigen Experimenten zu gewährleisten, dass die Durchflussmengen konsistent bleiben zwischen den Läufen.
- Führen Sie einen Schlauch von Regenbogen fluoreszierende Partikel in PBS verdünnt. Erwerben 5.000 Veranstaltungen. Werden die Mittelintensitätswerte für FSC, SSC, und jeden Farbkanal. Verwenden Sie diese Werte, um Spannungen in zukünftigen Experimenten anpassen, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Intensitäten konsistent bleiben zwischen den Experimenten.
1,6) Probenlese
- Durchflussrate der Zytometer ist auf "Lo" (etwa 8-12 & mgr; l / min) und führen Sie jede Probe für genau 1 oder 2 min.
- Nach dem ersten Lesen, mit 20 ul 10% NP-40 zu jeder Probe, einer Pipette auf und ab, und für die gleiche Zeitspanne (1 oder 2 min) erneut zu lesen, um die Subtraktion der positiven Ereignisse erfasst ermöglichen die lysierte Probe über eine gleiche Zeitrahmen.
HINWEIS: Es ist sehr important, dass die Proben mit einer Pipette, anstatt einen Wirbel gemischt werden. Nach unserer Erfahrung kann Vortex Selbstaggregation von einigen Antikörpern verursachen, was zu EV-imitiert positive Ereignisse. - Nachdem alle Proben eingelesen wurden, exportieren alle .fcs Dateien in eine separate Datei zur weiteren Analyse mit FCM-Analyse-Software verwendet werden.
1.7) Datenanalyse
- Öffnen Sie die FCM-Analyse-Software. Importieren Sie alle .fcs Dateien in ein neues Experiment-Datei.
- Öffnen Sie die Perlen nur Rohr. In der FSC-A vs. SSC-A-Grundstück, zeichnen Sie ein Tor um alle Perlen zwischen 0,2 um und 1,0 um Größe. Dies ist die EV-Gatter. Ziehen Sie, um zu allen Proben hinzuzufügen.
- Mit den lysierten Proben als negative Kontrollen, zeichnen Gates an der Kante der Hintergrundfluoreszenz in jedem Fluoreszenzkanal verwendet. Ziehen fluoreszierende Tore in die EV-Gate jeder entsprechenden nicht-lysierte Probe.
HINWEIS: An diesem Punkt ist es nützlich, dual Fluoreszenz bi-Parameter Stücke zu prüfen. Rocket-Formen indie doppelt positiven Quadranten (siehe Abbildung 8), insbesondere wenn die Markierungen bekannt, auf unabhängige Zelltypen befinden, kann ein Hinweis auf Artefakt Aggregation oder andere Vesikel ähnliche Ereignisse. - Für jeden fluoreszierenden Marker, Subtrahieren der Anzahl an Ereignissen in der lysierten Probe von der Anzahl von Ereignissen in der nicht-lysierten Probe. Optional teilen diese Zahl durch die Gesamtzahl von Elektrofahrzeugen in der nicht-lysierten EV Tor% positive Werte zu erhalten.
2. Methode B: Perlen-Methode
2.1) Die Verarbeitung von Blut-Probe / Isolation von Elektrofahrzeugen
- Beziehen sich auf die in Verfahren A (Abschnitt 1.1) beschriebenen Blutverarbeitungsmethode.
2.2) Vorbereitung Proben für die Analyse
- Wenn gewünscht, fraktioniert PPP oder ultrazentrifugierten EVs in Exosomen und Mikrovesikel. Fügen Sie 250 ul PPP oder ultrazentrifugierten EVs bis 0,22 um zentrifugale Filter und Transfer zu einem festen Rotorzentrifuge und Spin bei 750 xg für 2 min bei RT.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass keine Flüssigkeit auf die Filterplatten bleibt. Nach der Zentrifugation sollte der Filter erscheinen "trocken" mit keinen sichtbaren Flüssigkeitsschicht auf der Oberseite verbleibenden sein. Wenn unwahrscheinlich können bestimmte Proben erfordern eine etwas längere Zentrifugationszeit das Fluid wirksam durch den Filter zu bewegen. - In 2 ml waschen unbeschichteten 6 um Polystyrolkügelchen (zB negativ AbC Perlen) 2x mit RPMI-Medium, und resuspendieren. In 6000 Perlen zu jedem FACS-Röhrchen. Um den negativen Kontrollröhrchen 400 ul RPMI-Medium allein an die Perlen. An alle anderen Röhren, fügen Sie 200 ul PPP oder ultrazentrifugierten EVs (oder deren Fraktionen) und 200 ul RPMI-Medium.
- Stellen Sie die Endvolumen von allen Röhrchen zu 400 ul mit Medien und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler.
- Am nächsten Morgen, waschen Perlen mit 2 ml Medium. Saugen Sie den Überstand.
- Blockieren mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) in Medium (400 ul) für 3 h bei 4 &# 176; C auf einem Schüttler.
- Mit 2 ml Medium zu waschen Perlen. Verwerfen und Pellet in 100 ul Medium.
2.3) Die Färbung EV Proben
- Filtern Sie alle Antikörper. Verwenden Sie die gleichen Antikörper-Panels in Verfahren A verwendet werden, oder, falls gewünscht, erstellen Sie eine andere Kombination von Antikörpern, solange ihre Fluorochromen untereinander kompatibel sind.
- Kombinieren alle Antikörper in einer einzigen Platte in einer 0,22 um Filterzentrifuge Röhre verwendet werden. Zentrifuge mit einem Festwinkel einzigen Geschwindigkeitszentrifuge 2 Minuten lang oder bis die gesamte Ab Mischung durch den Filter geleitet und keine Antikörperflüssigkeit auf der Oberfläche des Filters bleibt.
- In geeigneten Volumen gefiltert Antikörper-Cocktail in alle Röhrchen und Inkubation für 30 min bei 4 ° C.
- Waschen Sie Perlen mit 2 ml Medium, resuspendiert in 400 ul Medium und sofort ausgeführt werden (oder innerhalb des gleichen Tages) am Durchflusszytometer.
2.4) Cytometer-Setup und Sample Lesen
- Öffnen Sie die FCM-Software. Vor dem Setup zu experimentieren, gehen täglich Gerätekalibrierung und Setup mit Geräteeinstellung Perlen (nach Herstellerangaben).
- Wenn der EV-Proben mit mehr als einem Antikörper gefärbt worden und mehrere Fluorochrome auf einmal gemessen werden, zu berechnen Korrekturwerte wie folgt:
- 2 Tropfen Entschädigung Perlen an vorher markierten Röhrchen (1 Röhrchen für jedes Fluorochrom konjugierte Antikörper), und fügen Sie die empfohlene Menge an Antikörper. 2 Tropfen negative Kompensations Perlen in ein anderes Röhrchen als ungefärbte Kompensationssteuerung zu verwenden. Inkubieren bei 4 ° C für 30 Minuten, Waschen mit PBS und Resuspendieren in 400 ul PBS.
- Mit dem FCM-Software, laufen jede Ausgleichsrohr und passen fluoreszierende Spannungen, jeden Peak bei etwa 10 4 auf einer 5-Dekade logarithmischen Skala zu platzieren. Sicherzustellen, dass der Fluoreszenz-Peak am höchsten (am hellsten) in einem eigenen Fluoreszenzkanal im Vergleich zu allen anderen Kanälen, underneut einstellen Spannungen von Fluoreszenzparameter, wenn nötig. Führen Sie jede einzeln gefärbten comp Rohr und erfassen mindestens 5.000 Veranstaltungen pro Röhrchen.
- Wählen Sie die Registerkarte "Experiment", dann "Compensation", dann "Compensation berechnen", um Korrekturwerte für alle Proben beantragen.
- Ändern Sie den FSC und SSC Spannungsparameter maßstabsloggt und wählen Sie den niedrigsten Schwellenwerte vom Zytometer (FSC = 200 und SSC = 200) erlaubt für jeden.
- Führen Proben, Tor auf der Singulett-Perlen Bevölkerung und erwerben 2.000 Veranstaltungen in diesem Tor. Export .fcs Dateien.
- Verwenden FCM-Analyse-Software zu analysieren .fcs Dateien. Tor auf Singulett-Perlen. Berechnen des geometrischen Mittels der Fluoreszenzintensität (MFI) für jedes Fluorochrom und Vergleichen mit dem MFI der negativen Kontrolle.
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Representative Results
Abbildung 1 skizziert den gesamten Verarbeitungssystem für die Isolierung und den Nachweis von EVs entweder mit dem Wulst-basierten Verfahren oder einzelne Nachweismethode. Individuelle Detektion EVs mit FCM funktioniert gut für die Analyse großer EVs aber die meisten Zytometer nicht fähig sind einzeln Detektieren von Teilchen so klein wie Exosomen. Ein Wulst basierte Ansatz erlaubt kleine EVs nachzuweisenden jedoch gibt es Nachteile bei der Verwendung dieser Verfahren verbunden sind, wie in Tabelle 1 angegeben. In der Regel ist die Isolierung von Elektrofahrzeugen mit Ultrazentrifugation (mit oder ohne Zusatz eines Saccharosegradienten-Fraktionierung Verfahren) empfohlen, wenn Elektrofahrzeuge sind für funktionelle Assays benötigt. Ultrazentrifugation entfernt Verunreinigungen wie Serumproteine und andere lösliche Verunreinigungen aus dem Plasma, das funktionelle Versuchsergebnisse beeinflussen können. Allerdings ist Ultrazentrifugation zeitaufwendig und kann EV Quantität und Qualität 12 ändern.
"> Erwartete Ergebnisse für die beiden Nachweistests sind in den Abbildungen 2-3 dargestellt. Für den einzelnen Nachweistests, die lysierte Steuer (untere Reihe, Bild 2) wird verwendet, um Tore für die entsprechende nicht-lysierte Probe (obere Reihe gesetzt, Abbildung 2). sollte Die Mehrzahl der Ereignisse in der EV Tor fallen. Quadrant Tore sollten nicht verraten Doppel positive Ereignisse, wenn die beiden Marken im Vergleich sind in der Regel nicht auf der gleichen Zelle. Die richtigen biparameter Grundstücke in Abbildung 2 zeigen die Marker CD108a und CD235a , die zwei rote Blutzellmarker bekannt, auf Zellen koexistieren. Hier, auf EVs, über die Hälfte der positiven Ereignisse sind positiv für beide Marker, wie erwartet. In der gleichen Weise, Zelloberflächenmarker bekannt, auf der gleichen Zelle liegen sollte zeigen ähnliche Muster der doppelten Positivität auf EVs. Die Mittel biparameter Plots zeigen EV Expression von zwei Markierungen, die bekannt sind, nicht auf Zellen vorhanden sein. In dieser Analyse von CD235a (eine rote blood Zellmarker) und CD41a (a Thrombozyten Marker), die Elektrofahrzeuge zeigen deutliche, getrennte, positive Bevölkerungsgruppen, die voraussichtlich, da sie von verschiedenen Zelltypen kommen. Wenn lysiert, sollten positive Ereignisse verschwinden. In der Regel werden alle positiven Ereignisse nach der Lyse übrigen zeigen die Anwesenheit von Signal, das von nicht-Vesikel Partikel, Zuschlagstoffe und / oder Reinigungsmittel-resistente EVs. Abbildung 3 zeigt die erwarteten Ergebnisse mit Hilfe des Bead-basierten Nachweisverfahren. Im Gegensatz zu den einzelnen Erkennungsverfahren, diese Daten können / darf nicht in bi-Parameter Stücke betrachtet werden. In den oberen Dot-Plots, keine Trennung zwischen den positiven und negativen Populationen existieren, und Veranstaltungen in den doppelt positiven Quadranten, obwohl sie in der Regel nicht auf die gleichen Zelltypen aufgrund der Tatsache, dass beide Arten von Elektrofahrzeugen wird eine Bindung gefunden erscheinen einzelne Perle. Für die Bead-basierende Verfahren werden Daten am besten analysiert mittels Histogrammüberlagerungen mit der Negativkontrolle (unterhalb der Dotplots dargestellt). Positivität is, gemessen unter Verwendung eines Markers MFI (mittlere Fluoreszenz-Intensität) und direkt mit der von der Negativkontrolle verglichen. Wenn eine Probe positiv für die Markierung in Frage ist, wird seine MFI höher als die negative Kontrolle sein. Die negative Kontrolle für den Wulst Verfahren ist einfach Perlen mit BSA blockiert (keine EVs hinzugefügt), die mit den gleichen Antikörpern gefärbt und neben den EV-beschichteten Kügelchen gewaschen wurden. Ein Vergleich der erwarteten Ergebnisse nach den beiden Verfahren kann in 4 gesehen werden kann.Die Fähigkeit der einzelnen Nachweistest richtig zu beurteilen EV Phänotypen stützt sich stark auf korrekte Gating zu Ab-positive Ereignisse von Hintergrundfluoreszenz zu trennen. Daher ist es entscheidend, eine negative Kontrolle, die am geeignetsten imitiert / prognostiziert Hintergrundfluoreszenz für eine gegebene Probe zu wählen. Bei Bunt EVs nicht vor dem Lesen gewaschen, häufig verwendete Negativkontrollen (zB Isotypen) nicht genau vorhersagen Hintergrund fluorescence für alle Markierungen (5A). In diesen Fällen, wenn Waschen nicht möglich ist, neigen lysierten Proben zur Vorhersage der Hintergrundfluoreszenz besser funktionieren. Wenn jedoch gefärbten EVs sind vor dem Lesen gewaschen (mittels Zentrifugenfiltration, in diesem Fall), die beide negative Kontrollen (Isotypen und lysierten Proben) gut zur Vorhersage der Hintergrundfluoreszenz einer Probe (5A). Es sollte jedoch angemerkt werden, daß, während alle negativen Kontrollen "Arbeit" lysiert Kontrollen werden bevorzugt, da sie zusätzliche Informationen über eine Probe (beispielsweise der Anwesenheit von Detergenz-resistenten, nicht-Vesikel relevanten Ereignissen und / oder Aggregate) dass man kann in nicht-EV positiven Signalen führen und falsch aufblasen Ab zählt. Weiterhin kann Isotypenkontrollen manchmal unzuverlässig sein, auch in gewaschenen Proben, wie in 5B, wobei die gefärbte Probe hat weniger positive Ereignisse als die gleiche Probe mit abgestimmt Isotypkontrolle Antikörpern gefärbt gezeigt. Ohne gründliche Entfernung von ungebundenen Antikörper sind FCM Punktdiagramme einiger EV Marker fast unmöglich zu interpretieren, wie Wolken von schwach fluoreszierenden Teilchen zu unterscheiden von ihren stark fluoreszierenden Hintergründe erscheinen (Abbildung 6, Top-Grundstück). Waschen gefärbte Proben mit zentrifugalen Filter verbessert die Trennung zwischen Hintergrund und positive Markierungssignale (Bild 6, unten Grundstück); jedoch können kleine EVs und Exosomen durch die Poren des Filters verloren.
Die Verwendung eines Detergens Lyseschritt zeigt positive, Vesikel-ähnlichen Ereignissen aus Immunkomplexen und Proteinaggregate 21. Bei PPP wird mit einzelnen Detektions, Begegnung positive Ereignisse, die nicht mit der Lyse nicht verschwinden analysiert ist eine ziemlich häufig vorkommen. Diese Reinigungsmittel-resistente Ereignisse werden oft als verdächtig, stark fluoreszierende diagonal Signale in beiden einzigen Parameter und biparameter Grundstücke (Abbildung7). Klinisch sind diese Proteinkomplexe und / oder unlösliche Immunkomplexe sind sie bei Patienten mit verschiedenen Krankheiten, 21, leidet, wie rheumatoide Arthritis 28, nephrotisches Syndrom 19 und systemischer Lupus erythematosus 29. Daher, abhängig von dem Ziel der Forschung kann man wünschen, zu schließen oder sie aus dem Weg analysis.Another diagonalen Signale Form wird durch Vortexen der Proben, insbesondere nach der Zugabe des Lysereagenz (Abbildung 8). Proben sollten immer nach oben und unten mit einer Pipette gemischt werden, um die Bildung von Aggregaten zu verhindern.
Figur 1: Gesamtverarbeitungsschema für die Isolierung und den Nachweis von EVs entweder mit dem Wulst-basierten Verfahren oder einzelne Nachweismethode. (A) Vollblut wird zuerst in PPP verarbeitet. Aus derwieder, PPP kann entweder weiter mit Ultrazentrifugation isolierte Elektrofahrzeugen ergeben verarbeitet oder genutzt werden, wie sie ist in der Einzelerfassung oder Wulst basierte Assays werden. (B) Übersicht über die vorgeschlagene Platten Karte für Hochdurchsatz-Analyse von Proben mit Hilfe der einzelnen Erkennungsverfahren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 2: Erwartete Ergebnisse für individuelle Erkennung Durchflusszytometrie Dot-Plots zeigen repräsentative Färbung der lysiert und unlysierten EV Proben. Die Werte zeigen, Prozentzahlen positiver Ereignisse. Der Großteil der Veranstaltungen fallen in den EV Tor. Veranstaltungen in den richtigen biparameter Grundstücke gezeigt sind innerhalb der FSC / SSC EV Toren auf der linken Seite. Die lysierte Probe (untere Reihe) wird verwendet, um Fluoreszenz-basierten Tore für ea eingestelltch entsprechenden (nicht lysiert) Probe. Quad Tore sollten nicht verraten Doppel positive Ereignisse, wenn die beiden Marken im Vergleich sind in der Regel nicht auf der gleichen Zelle gefunden. Hier wird die biparameter CD235a und CD41a Plot zeigt eine deutliche Trennung zwischen den EVs Ausdruck roten Blutkörperchen Marker und diesen Ausdruck Thrombozytenzellmarker. Ebenso sollten die Zelloberflächenmarker bekannt, auf der gleichen Zelle liegen ähnliche Muster der Doppel Positivität EVs zeigen. Das Recht biparameter Plot zeigt, dass über die Hälfte der CD235a-positive EVs sind ebenfalls positiv für die sekundäre roten Blutkörperchen (RBC) Marker, CD108a. Wenn lysiert, sollten positive Ereignisse verschwinden. Positive Ereignisse nach der Lyse übrigen zeigen die Anwesenheit von Signal, das von nicht-Vesikel oder Reinigungsmittel feste Partikel und / oder Aggregate.
Abbildung 3: Erwartete Ergebnisse mit dem Wulst basierte ErkennungMethode. Die Durchflusszytometrie Dot-Plots zeigen repräsentative Färbung von Elektrofahrzeugen, um die Kügelchen gekoppelt sind, im Vergleich zu Perlen mit BSA, die als Negativkontrolle dient blockiert. Die Werte zeigen, Prozentzahlen positiver Ereignisse. Veranstaltungen in den richtigen biparameter Grundstücke gezeigt sind innerhalb der FSC / SSC Perlen Toren auf der linken Seite. Für die Kügelchen basierende Nachweisverfahren werden Daten am besten untersucht unter Verwendung eines Histogramms Lagerungen mit der Negativkontrolle (unterhalb der Dotplots dargestellt). Positivität wird mit einer Markierung MFI (mittlere Fluoreszenz-Intensität) gemessen und direkt mit der von der Negativkontrolle verglichen.
Abb. 4: Vergleich der erwarteten Ergebnisse mit Perlen vs. einzelnen Detektions Durchflusszytometrie Dot-Plots zeigen repräsentative Färbung von Elektrofahrzeugen, um Perlen (obere Reihe) gekoppelt sind, im Vergleich zu Elektrofahrzeugen Analyse mit einzelnen Detektions (untere Reihe). Geschehenin der rechten Seite angezeigt biparameter Grundstücke innerhalb der FSC / SSC Perlen Toren auf der linken Seite.
Abb. 5: Vergleich von verschiedenen negativen Kontrollen in einzelnen Erkennungsanalyse Werte zeigen Prozentzahlen positiver Ereignisse. Events gezeigt innerhalb des FSC / SSC EV Tor. (A) Vergleich der Negativkontrollen in ungewaschenen vs. gewaschenen Proben. Isotyp oder lysierte Kontrollen wurden auf ihre Fähigkeit, angemessene Anzeichen für die Hintergrundfluoreszenz in zwei verschiedenen Markern in einer vollständig gefärbten Probe (untere Reihe) bereitzustellen ausgewertet. Gates für jeden Marker wurden unter Verwendung der lysierten Probe (obere Reihe) und dann zu den Zeilen unterhalb kopiert. Gewaschenen Proben wurden mit post Fleck Filtration gewaschen. (B) Beispiel einer Probe mit der Isotyp-Kontrolle mit mehr positive Ereignisse als die Probe gefärbt wi gebeiztth tatsächlichen Antikörper.
Abb. 6: Einfluss der post Fleck Waschen in einzelnen Detektions Werte Prozentangaben und Zahlen positiver Ereignisse. Events gezeigt innerhalb des FSC / SSC EV Tor. Tore für jede Probe wurden mit jeder Probe lysiert Gegenstück (nicht dargestellt, siehe vorherige Abbildung für Tor-Einstellung in ungewaschenen vs gewaschenen Proben). Hohe Hintergrundfluoreszenz ermöglicht die Unterscheidung von positiven negativen Ereignisse schwer (oben Grundstück). Wenn gewaschen, aber die positive Bevölkerung offenbart als ungebundene fluoreszierende Antikörper werden entfernt, und die Hintergrundfluoreszenz wird reduziert (untere Grundstück).
Abbildung 7: Detergenslyse bestätigt das Vorhandensein von nicht-EV sgezeigt ignals. Events sind im FSC / SCC EV Tor. Die Werte zeigen, Prozentzahlen positiver Ereignisse. Bunt EV Proben wurden vor (linke Spalte) ausgelesen und nach der Zugabe von Detergens (rechte Spalte), um positive Signale, die durch Immunkomplexe und andere nicht-EV-bezogene Ereignisse verursacht identifizieren.
Abbildung 8: Vortexen verursacht das Auftreten von nicht-EV Signale Events gezeigt innerhalb des FSC / SCC EV Tor.. Die Werte zeigen, Prozentzahlen positiver Ereignisse. Bunt EV Proben wurden vor (linke Säule) und nach der Zugabe von Detergens (rechte Spalte) gelesen. Unter Verwendung eines Vortex, um Proben zu mischen kann dazu führen, EV-imitiert, diagonal Populationen zu bilden (obere Reihe). Wenn sanft nach oben und unten mit einer Pipette gemischt, jedoch die Bildung dieser Bevölkerungsgruppen vermieden werden (untere Reihe). Vortexen nicht zum Mischen empfohlen, da es die Aggregation in einigen Proben lea verursachensprechend Diagonale erscheinende, positive Bevölkerungsgruppen. Im allgemeinen sollte die Ereignisnummer innerhalb einer positiven Gate nicht nach Lysieren erhöhen.
| Bead-basierte Erkennung | Individuelle Erkennung | |
| EV Größen | nur <100 nm empfohlen | für> 100 nm nur empfohlen |
| Zeit | erfordert Inkubation über Nacht | kann füllen in <1 Tag |
| Empfindlichkeit | Cluster-Erkennung | Einzelpartikeldetektion |
| Ergebnisse | qualitativ | quantitativ |
| Waschen | einfach, Standard Zentrifugation | erfordert Schleuderfilter |
| Negative Kontrolle | BSA-beschichtete Beads | lysierten Proben |
Tabelle 1: Vor- und Nachteile der beiden Nachweismethoden.
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Discussion
Zwei verschiedene Protokolle für die Isolierung, Behandlung und Analyse EVs vorgestellt, unter Verwendung entweder eines einzelnen Detektions oder Wulst-basierten Ansatz. Die Auswahl des geeignetsten Methode zu verwenden, ist nicht immer einfach und erfordert ein Verständnis der Probe, die ebenfalls getestet, wie die einzelnen Subpopulationen von Interesse. Weiterhin muss die Empfindlichkeit des Zytometer zur Erfassung verwendet bei der Auswahl des am besten geeigneten Verfahren sein. Oft gibt es keine einzelne beste Protokoll zu verwenden, sondern eine Kombination von Methoden enthält weitere Informationen zu einer Probe als einem Verfahren allein. Idealerweise sollten verschiedene Isolierungs- und Nachweistechniken zuerst um einen maßgeschneiderten Protokoll, Berücksichtigung individueller, der bestimmte zu EV Population untersucht nimmt Zytometer Leistung hinsichtlich Entwicklung beurteilt werden. Alternative Isolierungstechniken umfassen Ultrazentrifugation, Saccharose Dichte Fraktionierung, immun bead Trennung, Chromatographie und Affinitätsreinigung 12, während alternative Nachweismethoden umfassen Rasterelektronenmikroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie, dynamische Lichtstreuung und Western-Blot 8. Durch die Kombination verschiedener Techniken, können die hier vorgestellten Methoden, um Protokolle besten geeignet für die Untersuchung verschiedener EV Populationen von Interesse zu schaffen angepasst werden.
In der Regel Einzelerkennung von Elektrofahrzeugen mit FCM arbeitet auch für die Analyse von größeren Elektrofahrzeuge aber verliert Empfindlichkeit EVs kleiner. Während einzelne Erkennung ist konsequenter bei der Aufdeckung von größeren Elektrofahrzeugen ist Wulst basierte Erkennung bei der Aufdeckung von größeren Elektrofahrzeuge und für Exosomen empfindlicher weniger empfindlich. Größere EVs kann einfach über Post-Fleck Filtration gewaschen und einzeln über FCM erkannt werden. Kleinere EVs und Exosomen, auf der anderen Seite, sind nicht gut einzeln mit FCM erkannt und sind viel schwieriger, nach der Färbung waschen. Die Wulst-Capture-Protokoll löst beide Probleme, so dass EVs zu leicht gewaschen werden und mehrere Elektrofahrzeuge zusammen gemessen, um größere positive Signale von FCM nachweisbar zu schaffen. Jedoch gibt es Nachteile bei der Verwendung dieses Verfahrens, wie in Tabelle 1 umrissen verbunden.
Beim Arbeiten mit einem weniger empfindlichen Zytometer ist die Kapazität für die einzelnen Detektions begrenzt. Vor EV Analyse sollte die Empfindlichkeit des Zytometers Verwendung einer Mischung von Perlengrößen im Bereich von 0,1 bis 1,0 & mgr; m bestimmt werden. Ausfall der Zytometer, eine Mehrheit der Teilchen unter 1,0 & mgr; m zu erfassen, würde die Verwendung des Wulstes basiertes Protokoll erforderlich machen. Stark exprimierten Marker werden einfach mit Hilfe der beiden Protokolle festgestellt. Seltener Populationen sind manchmal leichter zu erkennen unter Verwendung des Einzelpartikeldetektion Protokoll statt dem Wulst Erfassungsprotokoll, kann dies jedoch in Abhängigkeit von solchen Variablen variieren, wie: der Helligkeit des Fluorochroms der Probe EV: bead rieru, und die Größe der EV mit dem seltenen Zelloberflächenmarker. Nachweis von mehreren Markierungen auf einem einzelnen Teilchen erfordert die Verwendung der einzelnen Nachweisverfahren. Die Wulst-basierte Verfahren ist nicht in der Lage, einzelne EV Detektion. Deshalb wird die Sicke basierte Protokolldaten, die mehr qualitativer Natur sind abgeben, während die einzelnen Erkennungsverfahren werden mehr quantitative Daten erhalten wurde.
Zusätzliche Isolationstechniken eingesetzt werden müssen, wenn Elektrofahrzeuge sind für Downstream-Anwendungen benötigt werden. EVs in funktionelle Assays verwendet werden, sollten mit Hilfe der 3-Stufen-Differentialzentrifugation Protokoll, da die löslichen Serumproteinen im Plasma können funktionelle experimentellen Bilanz beeinflussen ultrazentrifugiert werden. Zur Charakterisierung EVs jedoch Ultrazentrifugation wird nicht empfohlen, da diese zusätzliche Stufe kann EV Qualität und -quantität beeinträchtigt durch die hohen Kräfte auf die Partikel 12 vermittelt.
Die einzelnen Detektionsprotokoll enthält sehrere wichtigsten Schritte für die Hochdurchsatz-Tests optimiert, einschließlich: 1) die Durchführung der zentrifugalen Filter für die schnelle und effektive Entfernung von positiven Ereignissen von Ab Aggregate verursacht, 2) die Verwendung von Filtern als eine weitere praktische Alternative zu Ultrazentrifugation oder Saccharosegradienten-Fraktionierung zum Waschen von ungebundenen Ab EV Proben nach der Färbung und 3) Nutzung von Detergenslyse als negative Kontrolle, die nicht nur zeigt, positive Ereignisse, die von Nicht-Elektrofahrzeuge verursacht werden, sondern bietet eine gute Annäherung an Hintergrundfluoreszenz von negativen Bevölkerung für das Zeichnen positiv zu unterscheiden Gates. Die einzelnen Nachweisprotokoll wird empfohlen, wenn eine große Anzahl von Proben benötigt Test, wie er in einem einzigen Tag durchgeführt werden, während die Wulst-basierte Methode erfordert eine Inkubation über Nacht.
Die negativen Kontrollen in jedem Protokoll haben unterschiedliche Vorteile und Nachteile, je nachdem, welche Nachweismethode verwendet wird. Ein Vorteil der Verwendung der Wulst Basis assay ist, dass die gleichen monoklonalen Antikörper können für die negativen und positiven Röhren verwendet werden und die gleiche negative Kontrolle für alle Proben verwendet werden. Die einzelnen Nachweisverfahren, andererseits erfordert separate Steuerungen für jede getestete Probe gelesen werden. Die negative Kontrolle durch die einzelnen Detektions Protokoll verwendet lysierten Proben, welche die Verwendung / Verbrauch zusätzlicher Antikörper erfordern aber erfordern, dass jedes Rohr ein zweites Mal nach der Zugabe der lysierenden Mittel gelesen werden. Die lysierten Steuerungen haben den zusätzlichen Vorteil, in der Lage, den Anteil der positiven Signal, das nicht-Vesikel-bezogene Ereignisse zurückzuführen ist identifizieren, wie Immunkomplexe, 21. Die Wulst-basierte Assays nicht über diese Fähigkeit todistinguish zwischen positiven Signale aus echten EVs und diejenigen, die aus nicht-Vesikel.
Grenzen der Technik
Zwar gibt es keine standardisierte Methode zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, DifferentialZentrifugation ist eine weit verbreitete Technik bei den EV Forscher. Die hier beschriebene differentielle Zentrifugation Verfahren auf gemeinsamer Protokolle zur Isolierung von PPP, die typischerweise eine anfängliche Zentrifugation von 1200-1500 g für 10-20 min zur Entfernung der Zellen beruht, gefolgt von einer zweiten Zentrifugation von 10,000-13,000 xg 10-30 Minuten an Plättchen 35 zu entfernen. Das hier beschriebene Protokoll verwendet eine Zentrifugation bei 1.500 × g für 10 min, gefolgt von einer Zentrifugation bei 13.000 × g für 10 min. Während höhere Kräfte von 25.000-100.000 xg müssen typischerweise pelle EVs, können einige der größeren EVs mit dem Differential Zentrifugationsprotokoll wir dargestellt haben, entfernt werden.
Bis zu 90% von EVs durch FCM detektiert werden mit einer Stunde verloren Ultrazentrifugation bei 100.000 xg (Daten nicht gezeigt). Längere Zentrifugationszeiten sollten berücksichtigt werden, wenn auch vorsichtig, da dies negative Auswirkungen auf die Probenzusammensetzung. Wenn zusätzliche Verarbeitung f erforderlichoder Charakterisierungsstudien können Filtration nach dem 2-Schritt-Zentrifugation durchgeführt werden kann (vor dem Färben), weitere Fraktionierung Proben basierend auf Teilchengrße. Ähnlich wie Ultrazentrifugation, Filtration kann zu einem Verlust von bis zu 50% der positiven Marker-Events führen und bis zu 90% der von FCM erkannt Gesamtpartikel (Daten nicht gezeigt). Während die Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnis ist der offensichtliche Vorteil, den Verlust von kleiner EVs stellt eine erhebliche Einschränkung bei der Prüfung einer Wasch- oder Isolationsverfahren.
Schließlich verwendet das Antikoagulans (zB Heparin, ACD, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), etc.) während der Blutabnahme kann Auswirkungen auf die Qualität und Quantität der EV-Gehalt. Während ACD hat sich als ein guter und zuverlässiger Antikoagulans für unsere Studien sein Testen mehrerer Lösungen empfohlen, um sicherzustellen, dass die am besten geeignete Antikoagulans für die Anwendung ausgewählt wird. Dies ist besonders wichtig, wenn EVs in Downstream-Assays verwendet werdenwo die verwendeten Antikoagulans kann das Ergebnis beeinflussen. Zum Beispiel sind einige Antikoagulantien (zB EDTA und Heparin) bekannt, mit PCR-Reaktionen stören, während andere (zB Theophyllin, Adenosin und Dipyridamol) haben gezeigt, dass EV-Freisetzung aus Thrombozyten 12 zu hemmen.
Methoden zur Analyse EV, während sich im Laufe der letzten zehn Jahre verbessert, sind immer noch ein work in progress. Letztlich sind die besten Methoden für die Analyse von Elektrofahrzeugen wird auf die Forschung angewiesen durchgeführt und Werkzeuge zur Verfügung, die Forscher.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offen zu legen.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Dale Hirsch von Blut Systems Research Institute für seine Hilfe bei Durchflusszytometer Geräteeinstellungen zu danken. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt HL095470 und U01 HL072268 und DoD Verträge W81XWH-10-1-0023 und W81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
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