Summary
Pek çok farklı yöntem akış sitometrik (FCM) ile hücre dışı veziküller (EVS) ölçülmesi için vardır. Kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Ölçüm EVs için iki protokoller bireysel algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EVS) hücre-hücre iletişimine yüksek ilgili olan ve biyolojik süreçler çok çeşitli düzenlemeye yardımcı vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. Akış sitometrik (FCM) ile AGH analizi nedeniyle küçük boyutu ve ilgi belirteçleri için pozitif ayrık nüfus eksikliği bildiği zor olmuştur. Oldukça son on yılda geliştirilmiş EV analiz yöntemleri, hala devam eden bir çalışma vardır. Ne yazık ki, orada hiç kimse-boyut-uyan tüm protokol ve kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Birkaç farklı işleme AGH için teknikler ve bireysel algılama veya boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanarak AGH analiz için iki protokol burada sundu. rasyonel f yaygın ticari preparatlarda bulunan antikor agregatları bertaraf yardımcı olacaktır Burada tarif edilen yöntemler, artan bir sinyal-gürültü oranı ve ayar kapılarıeşiğe tespitini en aza indirir ashion. İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EVS) hücre-hücre iletişimine yüksek ilgili olan ve biyolojik süreçler çok çeşitli düzenlemeye yardımcı vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. Akış sitometrik (FCM) ile AGH analizi nedeniyle küçük boyutu ve ilgi belirteçleri için pozitif ayrık nüfus eksikliği bildiği zor olmuştur. Oldukça son on yılda geliştirilmiş EV analiz yöntemleri, hala devam eden bir çalışma vardır. Ne yazık ki, orada hiç kimse-boyut-uyan tüm protokol ve kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Birkaç farklı işleme AGH için teknikler ve bireysel algılama veya boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanarak AGH analiz için iki protokol burada sundu. rasyonel f yaygın ticari preparatlarda bulunan antikor agregatları bertaraf yardımcı olacaktır Burada tarif edilen yöntemler, artan bir sinyal-gürültü oranı ve ayar kapılarıeşiğe tespitini en aza indirir ashion. İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır.
Ayrıca mikro şekilde bilinmektedir EVs, hücre-hücre iletişimine katılan ve biyolojik süreçler 1 çok çeşitli düzenlemeye yardımcı olan vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. 4 - Çeşitli yüzey belirteçleri ve / veya biyolojik maddenin doğrudan aktarımı ifadesi sayesinde, AGH aktive veya hücreler arası iletişimin 2 rol bastırmak ya oynamak için alıcı hücrelerin fonksiyonunu değiştirmek edebiliyoruz. Diğer tümör Metasta teşvik gelen, geniş bir şartlar aralığında katkıda gösterilmiştir ve Klinik, trombosit türevli EVs kuvvetli pıhtılaşmaya karşı etkinliğe 5 sahip olduğu bilinmektedirHastalığın 7 karşı korumaya sis 6. AGH boyutu ve kuşak 8 mekanizmaya bağlı olarak, bu tür bir eksozom ve microvesicles (MVs) gibi hücre-türevi veziküllerin küçük kategoriye ayrılabilir. MVs 100 1,000 kadar büyük ise hücre kökenli kese alt popülasyonlarının isimlendirme devam eden tartışmanın 8,9 bir konu olmaya devam ediyor, ancak, eksozomlar genellikle, küçük plazma zarı ile endosome füzyon elde edilen 40 ila 100 nm parçacıklar açıklanmıştır nm partiküller, plazma zarının 10 dökülme ile temsil edilmektedir. Burada, genel terim "EV bize" hücreleri tarafından salınan hücre dışı biyolojik veziküllerinin her türlü ifade etmek için kullanılacaktır.
Bütün kandan EV'lerin izolasyonu çok aşamalı bir işlemdir ve bir çok farklı işlem değişkenlerinin, depolama sıcaklığı ve süresi 11,12, antikoagülan / koruyucu 13 kullanılır ve de dahil olmak üzere, EV içeriği etkilediği gösterilmiştirsantrifüj yöntemi 14 kullanılır. Bu değişkenlerin standardizasyonu için bir ihtiyaç Tromboz ve Hemostaz Bilimsel ve uygun Standardizasyon Komitesi (ISTH SSC), kan işleme ve EV izolasyon prosedürleri 15,16 Uluslararası Derneği tarafından önerilerine yol açtı, ancak optimum protokolü araştırmacılar arasında fikir birliği hiçbir vardır etti 12 kullanmak için. En sıkı kontrollü ön-analitik değişkenler doğru ve tekrarlanabilir veriler için çok önemli olduğunu, ancak, kabul ediyorum.
AGH analiz etmek için, araştırmacılar 20,21 ve 22,23 lekeleme batı saçılma transmisyon elektron mikroskobu 17, taramalı elektron mikroskobu 18,19, atomik kuvvet mikroskobu, dinamik ışık da dahil olmak üzere, çeşitli yöntemler kullanmışlardır. FCM birçok araştırmacı 9,24 için seçim yöntemi iken - nedeniyle yüksek verim yetenekleri 26, FCM kullanarak EVs analizi olmuştur32 - nedeniyle boyutu ve ayrık olumlu nüfus 27 eksikliği oldukça zordur. Hücrelerin analizi ile karşılaştırıldığında, gerekli parçacık başına antijenlerin az sayıda nedeniyle yayılan 1) daha az floresans AGH sonuçların küçük boyutu ve post-leke yıkama 2) sınırlı fizibilite, arka plan floresan azaltmak için. Araştırmacılar arasında ortak zorluklar immunglobulin agrega 27,28 ve antikorların 29 kendini toplama kaynaklanan sinyalleri içerir. Ayrıca, uzun işlem süreleri ve mevcut protokollerin 33,34 birçok kişi tarafından kullanılan uzun yıkama / izolasyon prosedürleri onlara yüksek hacimli uygulamalar için idealdir daha az hale numunelerin az sayıda analiz etmek çok günlük zaman taahhütlerini gerektirir. Bazı araştırmacılar doğru bac değerlendirmek için böyle bir floresan eksi bir (FMO) ve izotiplerle yararsız olarak geleneksel olarak kullanılan FCM negatif kontroller render, tamamen bir yıkama adımı bırakmakkground floresan 30.
Antikor agrega ve diğer non-kesecikler, bağlanmamış antikor giderilmesinde zorluk ve farkedilebilir olumlu nüfus eksikliğinden kaynaklanan sinyaller: Bizim protokolleri AGH uygun FCM analizi engelleyebilir üç ortak sorunları çözmek. Burada tarif edilen teknikler, genel olarak ticari preparatlarda bulunan antikor toplulukları ortadan sinyal-gürültü oranını artırmak ve eşiğe tespitini en aza indirir rasyonel bir şekilde kapı ayarlama yardımcı olacaktır. İki farklı algılama yöntemleri burada sunulmuştur: İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Aşağıdaki protokoller, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak yapılmıştır. Bütün insan konu örnekleri kurumsal inceleme kurulu (KİK) -onaylı protokol kapsamında ve konuların bilgilendirilmiş rızası ile test edildi.
1. YÖNTEM A: Bireysel Algılama Yöntemi
AGH Kan Örneği / İzolasyon 1.1) İşleme
- Aşağıdaki 2 adımlı diferansiyel santrifüj protokolü kullanılarak ACD-Solüsyon A ya da diğer halinde, uygun bir antikoagülan ve proses (30 dakika içinde max), 1.5 ml ihtiva eden iki adet 10 ml'lik cam tüplere verici / hastadan alınan kan alımı.
NOT: Bu protokol, çekilen kan Birleştirilen ~ 17 ml den yaklaşık 10 ml trombosit bakımından yoksul plazma (PPP), bir yol açacaktır. Daha fazla veya daha az, PPP gerekirse, toplanan kan tüplerin sayısı uygun şekilde ayarlanabilir. - Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj örnekleribuffy coat ve kırmızı hücrelerin plazma ayırmak için. Buffy coat ve kırmızı hücreleri içeren alt katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olmak, 1.5 ml santrifüj tüplerine plazma süpernatant 1.2 ml hacimde aktarın.
- Trombosit ve büyük hücre parçalarını almak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13,000 x g'de dönerler. Dikkatle pelet bozulmasını önleyen ve yeni bir tüpe PPP eklemek için 200 ul geride bırakarak PPP aktarın.
- Bu noktada, daha sonra analiz için iki yıla kadar (bir genel bakış için 1A bakınız Şekil) -80 ° C de analiz veya yeni bir 1.5 ml'lik santrifüj tüplerine 1.0 mi alikotlar içinde transfer ve mağaza hemen PPP kullanın.
- Saflaştınldı AGH bir ultra santrifüj tüpüne fonksiyonel deneylerde, transferi PPP 6 mi için gerekli ve 0.2 um filtreden fosfat tamponlu tuzlu su içinde 28 ml (PBS) ekleyin ise. Bir sallanan kepçeli rotor ile donatılmış bir ultrasantrifüj kullanarak, oda sıcaklığında 100,000 x g'de 60 dakika süre ile spin. Aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon EV pel1.5 ml medyada bildirin.
NOT: En yüksek tekrarlanabilirlik için, kan örnekleri vericiden itibaren sürekli sürede işleme alınmalıdır. EV izolasyon yönteminin herhangi bir varyasyon ölçüde tespit AGH sayısını ve türünü etkileyebilir.
1.2) Analiz için Örnekleri Hazırlama
NOT: Bu noktadan itibaren, adım 3 panellerde 14 belirteçleri için 12 numune analiz için yüksek verimlilik protokolü açıklar. Ancak, antikorların ve diğer kombinasyonları burada kullanılabilir; Protokol ilgilenilenlerdir için önerilen belirteçler ile ikame diğer EV popülasyonları çalışma için adapte edilebilir.
- 37 ° C'de ve çözülme (-80 ° C 'de depolandığı takdirde) dondurucu 12 örnek çıkarın.
- Pipet içeriği yukarı ve aşağı birkaç kez karıştırın. Her bir örnekten 320 ul çıkarın ve 96 gözlü bir levhanın üst üste ekleyin.
NOT: Bir genişlik ayarlanabilir çok iyi pipetlemeyin bu ve eşek boyunca birçok diğer adımlar için son derece yararlı olanay, bir kerede birden fazla örnekleri analiz özellikle.
1.3) Boyama EV Örnekleri
- Boyamadan önce, olumlu sinyaller neden olabilir, agrega kaldırmak için tüm antikorları (Abs) filtre.
- Ab karışımın tümü filtreden geçtikten Kombine antikorlar 2 dakika boyunca oda sıcaklığında sabit bir açı tek hızlı santrifüj (~ 750 xg) ile ayrı bir 0.22 um santrifüj filtre tüpleri ve santrifüj içine 3 panellerin her kullanılacak kadar veya ve herhangi bir antikorun sıvı filtre yüzeyi üzerinde kalır. Mağaza Ab iki hafta buzdolabında kokteyller ama tekrar filtre kullanmadan önce her zaman.
- Iyi aralıksız 2'de her süzüldü antikor karışımının uygun miktarda (ör Her Ab 2 ul ile boyanır masasında örnekler, bu yüzden, süzüldü antikor kokteyli 12 ul'lik toplam 2 satır için her bir oyuğa ilave edilir). Önerilen plaka haritanın bir anahat için 1B Bakınız Şekil. Bu ek tekrarlayınDaha fazla paneller çalıştırmak eğer altındaki satırlara s (burada, iyi 4 satır için Panel III kokteyli 3 ve 11 ul / satır 8 ul / kuyu Panel II kokteyl ekleyin; özel paneli bilgileri için malzemeler Listesi'ne bakınız).
- Çok kanallı pipet kullanarak, yukarı ve aşağı satır 1 PPP örnekleri karıştırın ve 2. karıştırın yukarı ve aşağı satır kuyulara satır 1 kuyulardan 100 ul aktarın. 30 dakika boyunca 4 ° C 'de satır 3 ve 4 inkübasyona sıra 1 den 100 ul transfer değiştirme uçları ve tekrar.
1.4) Yıkama OG Örnekleri
- Biyolojik güvenlik kabini 96-kuyu 4 ° C plaka ve transferi çıkarın. / Oyuk satır 6-8 PBS 220 ul, bir çok kanallı pipet kullanarak (/ durulama lekeli PPP içeren kuyu yıkanması için kullanılmak üzere).
- Antikorların 3 panel, 12 x 3 = 36 filtre tüpleri ile, 12 numuneler için genişlik ayarlı çok kanallı pipet (kullanarak ön-etiketli santrifüj filtre tüpleri iyi her içeriğini aktarmak olacak) gerekli. Aynı ipuçları kullanarak, yıkama satırlardan PBS 200 ul kaldırmak ve PPP sadece çıkarıldığı gelen kuyulara ekleyin.
- Kuyu durulayın ve PPP önce ilave edildiği için aynı filtreler durulama çözüm aktarmak için aşağı yukarı karıştırın ve. Santrifüj filtre yakın üstleri. Değişim ipuçları.
- Tüm lekeli PPP örnekleri santrifüj filtre kendi durulama çözümleri ile birlikte devredilmiştir kadar kalan lekeli örnekleri ile bu işlemi tekrarlayın.
- Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 850 xg'de sabit rotor santrifüj ve spin santrifüj filtre aktarın.
NOT: Hiçbir sıvı filtre üstleri kalır emin olun. Santrifüj işleminden sonra, filtre, görünür sıvı tabaka üstünde kalan "kuru" olarak görünmelidir. Olası iken, bazı PPP örnekleri etkin bir filtre aracılığıyla taşımak için daha uzun bir santrifüj süresi gerekebilir. - Santrifüj filtre tüpleri çıkarın ve biyolojik güvenlik kabini dönmek.Çok kanallı bir pipet kullanılarak, PBS, 300 ul filtre tepelerini yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse içerikler derhal FCM analizi için tüpler etiketli önceden transfer.
NOT: Bu örnek-örnek varyasyon önlemek için numuneler arasında tutarlı pipet piston çöküntü kuvvet ve sayısını tutmak çok önemlidir. Bu ideal yukarı ve belirli bir hacme aşağı pipetlemeyin için programlanmış bir elektronik pipet kullanılarak yapılmalıdır (örn, 280 ul), her numune için zaman (örneğin, 8 kez) bir tam sayısı.
1.5) Sitometresi Kur
- FCM yazılımını açın. Kurulumu deneme (üreticinin talimatlarına) enstrüman kurulum boncuklar kullanarak günlük alet kalibrasyon ve kurulumu gerçekleştirmek için önce.
- EV örnekleri birden fazla antikor ile boyandı ve olan varsa birden fluorochromes aşağıdaki gibi tazminat değerlerini hesaplamak, bir kerede ölçülecek gibidir:
- Ön tazminat boncuk 2 damla ekleyin-etiketli borular (her bir florokrom-eşlenik antikor için 1 tüp) ve antikorun önerilen miktarını ekleyin. Lekesiz kompanzasyon kontrolü olarak kullanmak için başka bir tüp negatif tazminat boncuk 2 damla ekleyin.
- 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin PBS içinde 400 ul PBS ve tekrar süspansiyon ile yıkayın.
- Cihaz ile birlikte yazılım sitometrede akışını kullanarak, her tazminat tüpü çalıştırmak ve 5-on günlük bir ölçekte yaklaşık 10 4 her zirveye yerleştirmek için floresan gerilimler ayarlayın. Floresan tepe diğer tüm kanallara kıyasla kendi floresan kanalda yüksek (parlak) olduğundan emin olun ve gerekirse tekrar floresan parametrelerin gerilimleri ayarlayın. Her biri ayrı ayrı boyanmış abone ol tüp çalıştırın ve tüp başına en az 5.000 olayları yakalamak.
- Sonra seçin "Deney" sekmesini seçin "Telafisi," daha sonra tüm örnekler için tazminat değerlerini uygulamak için "Hesapla Telafisi" seçeneğini seçin.
- 0.22 mikron filtreli PBS bir tüp çalışırken, (yani, sadece olay hızı 5 olayları / sn aşan hangi gerilim eşiğinin altında) arka plan gürültüsü çoğunluğunu dışlamak en yüksek değerlere FSC & SSC gerilimleri ayarlayın.
- Gerekirse, PBS içinde seyreltilmiş 1.0 um boncuklar, - Daha sonra, 0.2 mikron ihtiva eden bir tüp çalıştırın. FCS SSC vs arsa, um 0.2 ila 1.0 olayları yakalamak için boncuk nüfus etrafında bir kapı çizin. Alternatif olarak, bir SSC-H histogramda, 1.0 mikron boncuk daha küçük tüm olayları kapsar bir kapı çizin.
- "Lo" (yaklaşık 8-12 ul / dk) sitometresinin akış hızını ayarlayın. Boncuk tüp kullanarak (ya da boncuk bilinen bir konsantrasyonu içeren diğer tüp) arifesinde kadar sitometresindeki akış hızı kadranını ayarlayınnt oranı yaklaşık 200 olay / sn ulaşır. Aynı akış hızında tüm numune tüpleri okuyun ve bu akım hızları koşular arasında tutarlı kalmasını sağlamak için gelecek deneylerde aynı boncuk konsantrasyonunu kullanın.
- PBS içinde seyreltilmiş gökkuşağı floresan parçacıkların bir tüp çalıştırın. 5.000 olayları Edinme. FSC, SSC, ve her renk kanalı için ortalama yoğunluk değerleri kaydedin. Bu floresan yoğunlukları deneyler arasında tutarlı kalmasını sağlamak için gelecek deneylerde gerilimleri ayarlamak için bu değerleri kullanın.
1.6) Örnek Okuma
- "Lo" (yaklaşık 8-12 ul / dk) sitometresinin akış hızını ayarlayın ve tam olarak 1 veya 2 dakika boyunca her örnek çalıştırın.
- Ilk okuma sonra, NP-40 aşağı her numune, pipet yukarı ve% 10 20 ul ekleyin ve tespit pozitif olayların çıkarma izin zaman aynı miktarda (1 ya da 2 dk) için yeniden okumak eşit bir zaman dilimi içinde lize örnek.
NOT: Bu son derece impNumuneler pipet yerine bir vorteks ile karıştırılabilir ki ortant. Bizim tecrübelerimize göre, vorteksleme EV-taklit olumlu olaylara yol açan, bazı antikorların kendine gelmesine neden olabilir. - Bir kez tüm örnekler verme ayrı bir dosya içine tüm dosyaları .fcs FCM analizi yazılımı kullanılarak ileri analiz için kullanılacak, okundu.
1.7) Veri Analizi
- FCM analiz yazılımı açın. Yeni bir deneme dosyası içine .fcs tüm dosyaları içe.
- Boncuklar sadece tüp açın. SSC-A arsa vs FSC-A'da, etrafında 0.2 mikron ile 1.0 mikron arasında büyüklükte tüm boncuklar bir kapı çizin. Bu EV kapısıdır. Sürükle tüm numunelerin eklemek için.
- Negatif kontrol olarak lize örnekleri kullanarak, kullanılan Her florasan kanalına eşiğe kenarında kapıları çizin. Her gelen olmayan lize numunenin EV kapısı içine floresan kapıları sürükleyin.
NOT: Bu noktada da ikili floresan iki parametre araziler incelemek yararlı olacaktır. Roket şekilleri içindebelirteçler alakasız hücre tipleri üzerinde ikamet bilinmektedir özellikle çift pozitif kadran toplama veya diğer kabarcık taklit olaylardan eserin göstergesi olabilir (Şekil 8). - Her bir floresan markör için, sigara lize numunede olay sayısı ile ilgili lize numunede olay sayısını çıkarılır. İsteğe bağlı olarak,% pozitif değerleri almak için olmayan lize EV kapısının içindeki EVs toplam sayısına göre bu sayı bölün.
2. YÖNTEM B: Boncuk Yöntemi
AGH Kan Örneği / İzolasyon 2.1) İşleme
- (Bölüm 1.1) Yöntem A'da tarif edilen kan işleme yöntemine bakınız.
2.2) Analiz için Örnekleri Hazırlama
- İstenirse, eksozom ve microvesicles içine PPP veya ultrasantifrüjlenmiş AGH damıtmak. 0.22 mikron santrifüj filtreler PPP veya ultrasantifrüjlenmiş AGH 250 ul ekleyin ve 750 x sabit rotor santrifüj ve spin aktarmakoda sıcaklığında 2 dakika boyunca örn.
NOT: Hiçbir sıvı filtre üstleri kalır emin olun. Santrifüj işleminden sonra, filtre, görünür sıvı tabaka üstünde kalan "kuru" olarak görünmelidir. Olası iken, bazı örnekler sıvı etkili bir filtre üzerinden hareket etmek için biraz daha uzun santrifüj süresi gerekebilir. - 2 ml kaplanmamış 6 mikron polistiren boncuklar (örneğin, negatif ABC boncuk) RPMI medya ile 2x ve tekrar süspansiyon yıkayın. Her bir FACS tüpü 6,000 boncuk ekleyin. Negatif kontrol tüpüne, boncuk tek başına RPMI medya 400 ul ekleyin. Diğer tüm tüpler için, PPP veya ultrasantifrüjlenmiş AGH (veya fraksiyonları) 200 ul ve RPMI medya 200 ul ekleyin.
- Ortam ile 400 ul bütün tüpler son hacim ayarlama ve bir çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- Ertesi sabah, ortam, 2 ml ile boncuk yıkayın. Süpernatant aspire.
- 4 ve 3 saat boyunca ortam (400 ul) içinde% 5 sığır serum albumin (BSA) ile bloke# 176, bir çalkalayıcı üzerinde ° C.
- Ortam, 2 ml ile boncuk yıkayın. Ortam 100 ul aspire ve tekrar süspansiyon pelet.
2.3) Boyama EV Örnekleri
- Tüm antikorları Filtre. Yöntem A'da kullanılan aynı antikor panelleri kullanarak ya da eğer arzu edilirse, sürece kendi fluorokromun birbirleriyle uyumlu olarak antikorlar, farklı bir kombinasyon yaratmak.
- Kombine Tüm antikorlar, bir 0.22 um filtre santrifüj tüpüne tek bir panelde kullanılır. 2 dakika boyunca ya da Ab karışımın tümü kadar sabit açılı tek hızlı santrifüj kullanılarak santrifüj filtreden geçirilir ve hiçbir antikor sıvı filtre yüzeyi üzerinde kalır.
- Tüm tüplere süzüldü antikor kokteylinin uygun hacimde ilave edin ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
- Sitometrede akış medya 400 ul medya, tekrar süspansiyon 2 ml boncuk yıkayın ve hemen çalıştırın (ya da aynı gün içinde).
2.4) Kurulum ve Numune Okuma Sitometrenin
- FCM yazılımını açın. Kurulumu deneme (üreticinin talimatlarına) enstrüman kurulum boncuklar kullanarak günlük alet kalibrasyon ve kurulumu gerçekleştirmek için önce.
- EV örnekleri birden fazla antikor ile boyandı ve olan varsa birden fluorochromes aşağıdaki gibi tazminat değerlerini hesaplamak, bir kerede ölçülecek gibidir:
- Tüpler etiketlenmiş önceden tazminat boncuk 2 damla (her florokrom-eşlenik antikor için 1 tüp) ekleyin ve antikorun önerilen miktarını ekleyin. Lekesiz kompanzasyon kontrolü olarak kullanmak için başka bir tüp negatif tazminat boncuk 2 damla ekleyin. 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin PBS içinde 400 ul PBS ve tekrar süspansiyon ile yıkayın.
- FCM yazılımı kullanarak, her tazminat tüpü çalıştırmak ve 5-on günlük bir ölçekte yaklaşık 10 4 her zirveye yerleştirmek için floresan gerilimler ayarlayın. Floresan tepe diğer tüm kanallara kıyasla kendi floresan kanalda (parlak) yüksek olduğundan emin olun veGerekirse tekrar floresan parametrelerin gerilimleri ayarlayın. Her biri ayrı ayrı boyanmış abone ol tüp çalıştırın ve tüp başına en az 5.000 olayları yakalamak.
- Sekmesini seçin "Deney," sonra "Tazminat," sonra "Hesapla Tazminat" tüm örnekler için tazminat değerlerini uygulamak için.
- Ölçek log ve her biri için sitometresindeki (FSC = 200 ve SSC = 200) tarafından izin verilen en düşük eşik seçmek için FSC ve SSC gerilim parametrelerini değiştirin.
- Tekli boncuk nüfus Run örnekleri, kapı ve bu kapıdan 2.000 olayları kazanır. Export .fcs dosyaları.
- Dosyaları .fcs analiz FCM analiz yazılımı kullanın. Tekli boncuklar üzerinde Kapısı. Her florokrom için geometrik ortalama floresan yoğunluğu (MFI) hesaplayın ve negatif kontrol MFI ile karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, izolasyon ve boncuk esaslı yöntemi veya tek tek tespit metodu kullanarak EV'lerin tespiti için genel işlem şemasını açıklar. FCM büyük AGH analiz için iyi çalışır ama çoğu sitometrelerinde bireysel eksozom gibi parçacıkları kadar küçük tespit yeteneğine sahip değildir kullanarak EVs Bireysel algılama. Bir tane bazlı yaklaşım, Tablo 1 'de belirtildiği gibi küçük EVs, ancak, bu yöntem kullanılarak ilişkili dezavantajları vardır tespit edilmesini sağlar. Genel olarak, (ya da bir sükroz gradyanı ayırma prosedürü eklenmeden) ultrasantrifüj kullanılarak EV'lerin yalıtılmasıdır EV bize, işlevsel tayinler için gerekli olduğunda tavsiye edilir. Ultrasantrifügasyon serum proteinleri ve fonksiyonel deneysel sonuçlarını etkileyebilir plazma, diğer çözünebilir kirleticiler içeren kirleri temizler. Ancak, Ultrasantrifügasyon zaman tüketen ve EV miktar ve kalitesini 12. değiştirebilir.
"> İki algılama deneyleri için Beklenen sonuçlar Şekil 2-3 tasvir edilir. Mukabil olmayan lize numune için kapıları (üst satır ayarlamak için kullanılan bireysel algılama deneyi, lize kontrolü (alt sıra, Şekil 2) için, Şekil 2). olayların çoğunluğu EV kapısı içinde olması gerekir. Quadrant kapıları çift pozitif olayları ortaya çıkarmayacaktır karşılaştırıldığında iki belirteçler normalde aynı hücrede bulunmayan zaman. Şekil 2'de sağ biparameter araziler işaretçileri CD108a ve CD235a göstermek , hücreler üzerinde bir arada bilinen iki kırmızı kan hücre belirteçleri olan. Burada, AGH üzerine, beklendiği gibi pozitif olayların yarısından fazlası, her iki belirteçler için olumludur. Aynı şekilde, bilinen hücre yüzey belirteçleri aynı hücreye ikamet gerekir AGH çift pozitifliği benzer özellikler göstermekte. merkez biparameter araziler hücreler üzerinde bir arada değil bilinen iki belirteçlerin EV ifadesini göstermektedir. CD235a Bu analizde (kırmızı BlooD hücre işaretleme maddesi) ve CD41a (trombosit belirteci) EVS farklı hücre tipleri alınan bu beklenen farklı, ayn pozitif kesimleri göstermektedir. Lize zaman olumlu olaylar kaybolur. Genel olarak, lizis sonra herhangi bir pozitif olaylar olmayan vezikül parçacıklar, birikmeler, ve / veya deterjan dayanıklı EV'lerin gelen sinyalin varlığına işaret etmektedir. Boncuk esaslı belirleme yöntemi kullanılarak sonuçlar beklenen 3: Şekil. Bireysel algılama yöntemi aksine, bu veriler / bi-parametre parsellerinde görülmemelidir olamaz. Üst nokta araziler, pozitif ve negatif nüfus arasında hiçbir ayrım var, ve olaylar nedeniyle normalde EVs iki tip bir bağlanacaktır gerçeğine aynı hücre tiplerinde bulunan olsa bile çift pozitif kadran görünür Tek boncuk. Boncuk esaslı saptama yöntemi için, veriler, en iyi (nokta araziler altında gösterilmektedir), negatif kontrol ile histogram bindirmeleri kullanılarak analiz edilir. Pozitiflik iBir işaretin MFI (ortalama flüoresans şiddeti) kullanılarak ölçüldü ve negatif kontrolün doğrudan ile karşılaştırılabilir. Bir örnek, söz konusu işaretleyici için pozitif ise, onun MFI negatif kontrole göre daha yüksek olacaktır. kordon yöntemi için negatif kontrol sadece aynı antikor ile boyandı ve EV-kaplanmış boncuklar birlikte yıkanmış BSA ile bloke boncukları (hiçbir EVs ilave) 'dir. Iki yöntem kullanılarak beklenen sonuçların bir karşılaştırması Şekil 4'te görülebilir.düzgün EV fenotipleri değerlendirmek için bireysel algılama tahlil yeteneği eşiğe gelen Ab-pozitif olayları ayırmak için doğru yolluk dayanır. Bu nedenle, bu uygulama en uygun taklit / belirli bir numune için arka plan floresan tahmin eden bir negatif kontrol seçmek çok önemlidir. Lekeli AGH okumadan önce yıkanıp değil zaman, genellikle (örneğin, isotypes) doğru plan fluorescenc tahmin başarısız negatif kontrolleri kullanılanTüm markalama e (Şekil 5A). Yıkama bir seçenek değilse, bu durumda, parçalanan örnekler arka plan floresan tahmin için daha iyi çalışmak eğilimindedir. Lekeli AGH okumadan önce yıkanır, ancak bir örnek (Şekil 5A) ve arka plan floresan tahmin etmek için iyi iş negatif kontroller (izotipler eritilir örnekleri) her ikisi de, (bu durumda, santrifüj filtrasyon kullanılarak). Ancak, unutulmamalıdır onlar (örn, deterjan-dayanıklı olmayan vezikül ile ilgili olayları ve / veya agrega varlığı) bir numune hakkında ek bilgi sağlar, çünkü tüm negatif kontroller "iş" lize kontrolleri tercih ederken o olmayan EV pozitif sinyaller neden ve yanlış Ab sayıları şişirmek. Lekeli örnek, eşleştirilmiş bir izotip kontrol antikor ile boyandı, aynı örnek daha az pozitif bir etkinliği Şekil 5B'de gösterildiği gibi Ayrıca, izotip kontrolleri bile bazen yıkanmış numunelerde, güvenilir olmayabilir. Bağlanmamış antikorun kapsamlı çıkarılması olmadan, bazı EV belirteçlerin FCM nokta araziler loş floresan parçacıkların bulutlar onların son derece floresan kökenden gelen farksız olarak görünen, (Şekil 6, üst arsa) yorumlamak için neredeyse imkansız. Arka plan ve pozitif işaret sinyalleri arasındaki ayrım santrifüj filtreleri kullanarak lekeli örnekleri artırır Çamaşır (Şekil 6, alt arsa); Ancak, küçük EVs ve eksozomlar filtrenin gözeneklerinden ile kaybolabilir.
Bir deterjan parçalama adımı kullanımı bağışıklık kompleksleri olumlu, kese-taklit olayları açığa ve protein 21 agrega. PPP lizis ile yok yok olumlu olayları karşılaşmak, bireysel algılama kullanılarak analiz edildiğinde oldukça sık görülen bir durumdur. Bu deterjan dayanıklı olaylar genellikle hem tek parametre ve biparameter araziler olarak şüpheli, son derece floresan diyagonal sinyalleri görünür (Şekil7). Klinik olarak, bu protein kompleksleri ve / veya çözünmez immün kompleksler örneğin romatoid artrit 28, nefrotik sendrom 19, ve sistemik lupus eritemi 29 gibi çeşitli hastalıkların 21 muzdarip hastalarda daha yaygındır. Bu nedenle, araştırma amacına bağlı olarak, bir dahil veya çapraz sinyaller özellikle parçalama reaktifi eklenerek (Şekil 8) sonra, numune vorteks tarafından oluşturabilir analysis.Another şekilde bunları kaldırmak isteyebilirsiniz. Numuneler, her zaman agregatların oluşumunu önlemek için pipet ile aşağı yukarı karıştırılmış ve edilmelidir.
Şekil 1: izolasyon ve boncuk esaslı yöntemi veya tek tek tespit metodu kullanarak EV'lerin tespiti için genel işlem şeması. (A) Tam kan ilk PPP içine işlenir. ItibarenPPP izole EV'lerini vermek üzere ultrasantrifüj kullanılarak daha ileri işlenmesi veya bireysel olarak saptanması ve boncuk esaslı deneylerde olduğu gibi kullanılabilir, ya da yeniden. ayrı belirleme yöntemi kullanılarak yüksek verimli örnek analiz için önerilen levha harita (B) ana hatlarıdır. tıklayın Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 2:. Bireysel Algılama için Beklenen sonuçlar nokta araziler Flow sitometri lize ve çözünen EV örneklerinin temsili boyanmasını göstermektedir. Değerler pozitif olayların yüzdelerini göstermektedir. olayların çoğunluğu EV kapısı giren. Sağ biparameter araziler gösterilen Olaylar soldaki FSC / SSC EV kapıları içindedir. lize örnek (alt sıra) ea için floresan tabanlı kapıları ayarlamak için kullanılırCH (non-lize) örnek gelir. Karşılaştırıldığında iki belirteçler normalde aynı hücrede bulunan değilken Quad kapıları çift pozitif olayları ortaya çıkarmayacaktır. Burada, biparameter CD235a ve CD41a arsa kırmızı kan hücre belirteçleri ifade AGH ve bu ifade trombosit hücre belirteçleri arasında belirgin bir ayrılık gösterir. Aynı şekilde, aynı hücreye ikamet bilinen hücre yüzey belirteçleri AGH çift pozitifliği benzer desenler göstermelidir. Sağ biparameter arsa CD235a-pozitif AGH yarısından fazlasının da ikincil kırmızı kan hücresi (RBC) işaretleyici, CD108a için olumlu olduğunu göstermektedir. Lize zaman olumlu olaylar kaybolur. Liziz sonra kalan pozitif olaylar olmayan vezikül ya da deterjana dirençli parçacıkları ve / veya birikinti gelen sinyalin varlığına işaret etmektedir.
Şekil 3: boncuk-tabanlı algılama kullanarak Beklenen sonuçlaryöntem. Negatif kontrol olarak hizmet veren BSA ile bloke boncuk kıyasla nokta araziler, boncuk bağlanmış AGH temsilcisi boyama göstermek Flow sitometri. Değerler pozitif olayların yüzdelerini göstermektedir. Sağ biparameter araziler gösterilen Olaylar soldaki FSC / SSC boncuk kapıları içindedir. Boncuklar-tabanlı algılama yöntemi için, veriler, en iyi (nokta araziler altında gösterilmektedir), negatif kontrol ile histogram bindirmeleri kullanılarak analiz edilir. Pozitiflik bir işaretin MFI (ortalama flüoresans şiddeti) kullanılarak ölçüldü ve negatif kontrolün ile doğrudan mukayese edilir.
Şekil 4:. Boncuk vs bireysel algılama kullanarak beklenen sonuçların karşılaştırılması bireysel algılama (alt sıra) kullanarak analiz AGH ile karşılaştırıldığında, sitometri araziler boncuk (üst satırda) bağlanmış AGH temsilcisi boyama göstermek nokta Akış. Olaylararaziler soldaki FSC / SSC boncuk kapıları içindedir biparameter sağda gösterilen.
Şekil 5:. Bireysel algılama analizinde farklı negatif kontrollerle karşılaştırılması Değerler pozitif olayların yüzdelerini göstermektedir. Gösterilen Olaylar FSC / SSC EV kapısı içindedir. Yıkanmamış vs negatif kontroller (A) Karşılaştırma örnekleri yıkanır. İzotip ya da parçalanması kontrol tam lekeli örneğin (alt sıra) iki farklı işaretleri arasında eşiğe uygun belirtmemiç etme kabiliyetleri açısından değerlendirildi. Her belirteç kapıları altında satır kopyalanır sonra lize örnek (üst satır) kullanılarak yapılmıştır. Izotip kontrol numunesi lekeli wi daha pozitif olaylar sahip boyanmış bir numune Yıkanmış numuneler sonrası leke filtrasyon kullanılarak yıkanmıştır. (B) 'Gerçek antikor th.
Şekil 6:. Bireysel algılama sonrası leke yıkama etkisi gösterisi yüzdeleri ve olumlu olayların sayıları Değerler. Gösterilen Olaylar FSC / SSC EV kapısı içindedir. Her bir numune için kapıları (; yıkanmış numunelerin vs yıkanmamış gate-ayarı için önceki şekle bakınız gösterilmemiştir), her numunenin lize muadili kullanılarak yapılmıştır. Yüksek plan floresan negatif olaylar zor (üst arsa) olumlu ayırt yapar. Yıkanmış zaman ilişkisiz floresan antikorlar kaldırılır ve arka plan floresan (alt arsa) azalır gibi, ancak, olumlu nüfus ortaya çıkar.
Şekil 7: Deterjan lizis olmayan EV s varlığını doğruladıgösterilen sinyali veren. Olaylar FSC / SCC EV kapısı içindedir. Değerler pozitif olayların yüzdelerini göstermektedir. Lekeli EV örnekleri daha önce (sol sütun) okundu ve deterjan (sağ sütun) ilavesinden sonra immün kompleksleri ve diğer non-EV-ilişkili olaylardan kaynaklanan olumlu sinyaller tespit etmek.
Şekil 8: vorteks olmayan EV sinyallerinin görünümünü neden gösterilen Olaylar FSC / SCC EV kapısı içindedir.. Değerler pozitif olayların yüzdelerini göstermektedir. Lekeli EV örnekleri daha önce (sol sütun) ve deterjan (sağ kolon) ilave edildikten sonra okundu. Örnekleri karıştırmak için bir girdap kullanarak EV-taklit, çapraz popülasyonları (üst satır) oluşmasına neden olabilir. Hafifçe yukarı ve bir pipet kullanarak aşağı miks edildiğinde, bununla birlikte, bu popülasyonlar oluşumu (alt sıra) önlenebilir. Vorteksleme o, lea, bazı örneklerde toplanmasına neden olabilir gibi, karıştırma için tavsiye edilmezding Diagonal-görünen etmek, olumlu popülasyonları. Genel olarak, olumlu bir kapısı içinde olay numarası parçalama sonra artış olmamalıdır.
| Boncuk Tabanlı Algılama | Bağımsız Algılama | |
| EV Boyutları | <100 nm yalnızca önerilen | > 100 nm için önerilen |
| Zaman | Gece boyunca inkübasyon gerektirmektedir | 1 gün <de tamamlayabilirsiniz |
| Duyarlılık | küme algılama | Tek parçacık algılama |
| Sonuçlar | nitel | nicel |
| Yıkama | Basit, standart santrifüj | santrifüj filtre gerektirir |
| Negatif kontrol | BSA ile kaplanmış boncuklar | parçalanan örnekler |
Tablo 1: Artıları ve her iki saptama yöntemleri eksilerini.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İzolasyon, tedavi ve EVs analizi için iki farklı protokol tek bir algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur. Kullanmak için en uygun yöntemi seçerek her zaman kolay değildir ve faiz bireysel alt popülasyonlar yanı sıra test edilen numunenin bir anlayış gerektirir. En uygun yöntemi tercih Bundan başka, satın alma için kullanılan sitometresinde duyarlılığı göz önünde bulundurulmalıdır. Çoğu zaman doğrusu yöntemlerin bir kombinasyonu, tek başına herhangi bir yöntem daha bir numune hakkında daha fazla bilgi sağlar, kullanmak için tek en iyi protokol var. İdeal olarak, birkaç farklı izolasyon ve algılama teknikleri, belirli EV nüfus çalışılan göre performans sitometrede göz bireyin içine alır uyarlanmış protokolü geliştirmek için ilk değerlendirilmelidir. Alternatif izolasyon teknikleri Ultrasantrifügasyon, sükroz yoğunluk ayırmasına, immünomanyetik b dahilEAD ayırma, kromatografi ve afinite arıtma 12 alternatif algılama yöntemleri taramalı elektron mikroskobu, transmisyon elektron mikroskobu, atomik kuvvet mikroskobu, dinamik ışık saçılması ve batı 8 lekeleme dahil ederken. Farklı teknikler birleştirerek, burada sunulan yöntemler, söz konusu farklı EV popülasyonlarının çalışmak için en uygun protokoller oluşturmak için adapte edilebilir.
Genel olarak, FCM büyük AGH analiz için iyi çalışır, ancak AGH küçük olsun hassasiyetini kaybeder kullanarak EVs bireysel algılama. Bireysel tespit büyük EV'lerini tespit daha tutarlı iken, boncuk esaslı algılama büyük EVS ve eksozom daha duyarlı saptanmasında daha az duyarlıdır. Büyük AGH sonrası leke filtrasyon yoluyla kolayca yıkanır ve FCM üzerinden tek tespit edilebilir. Daha küçük EVs ve eksozomlar, diğer taraftan, FCM ile de ayrı ayrı belirlenmesi ve daha zor sonrası boyama yıkamak için olan değildir. boncuk yakalamaprotokol AGH kolayca yıkanabilir ve birden fazla AGH FCM tarafından tespit geniş olumlu sinyaller oluşturmak için birlikte ölçülecek sağlayan, bu sorunların hem giderir. Ancak, Tablo 1 'de belirtildiği gibi, bu yöntem kullanılarak ilişkili dezavantajları vardır.
Daha az hassas sitometresinde çalışırken, bireysel olarak saptanması için kapasitesi sınırlıdır. EV analizinden önce sitometresinde duyarlılığı 0.1-1.0 um arasında değişen boncuk büyüklüklerinin bir karışımının kullanılarak tespit edilir. Sitometresinde başarısızlığı boncuk tabanlı protokol kullanımı gerekli olacaktır 1.0 um altında bir parçacık çoğunluğu tespit etmek. Yüksek ifade belirteçler kolayca ya protokolü kullanılarak tespit edilmiştir. Florokrom parlaklık, numunenin EV: boncuk r nadir popülasyonları boncuk yakalama protokolü yerine tek parçacık algılama protokolünü kullanarak tespit bazen kolay, ancak, bu gibi değişkenlere bağlı olarak değişebilirATIO ve nadir hücre yüzey markerini taşıyan EV boyutu. Tek bir parçacık birden fazla markalama tespiti ayrı tespit yönteminin kullanılmasını gerektirir. boncuk-tabanlı bir yöntem bireysel EV algılama yeteneğine sahip değildir. Bireysel algılama yöntemi daha nicel veriler verecek iken Bu nedenle, boncuk-tabanlı protokol, doğada daha nitel olan verileri elde edecektir.
AGH alt baş uygulamalar için gerekli olan her ilave izolasyon teknikleri kullanılmalıdır. Fonksiyonel analizlerde kullanılan AGH plazmada çözünür serum proteinleri, fonksiyonel deneysel sonuçları etkileyebilir çünkü, 3-adım diferansiyel santrifüj protokolü kullanılarak ultransantrifüjlenir edilmelidir. Bu ilave adım EV nitelik ve nicelik etkileyebilir çünkü AGH karakterizasyonu için, ancak, Ultrasantrifügasyon nedeniyle parçacıklar 12 kazandırılan yüksek kuvvetler, tavsiye edilmez.
Bireysel algılama protokol s içeriyordahil olmak üzere yüksek verimli testi için optimize everal önemli adımlar: Ab agrega neden pozitif olayların hızlı ve etkili çıkarılması için santrifüj filtre 1) uygulanması, 2) Ultrasantrifügasyon veya sukroz gradyan fraksiyonasyonuna daha pratik bir alternatif olarak filtrelerin kullanılması EV örnekleri sonrası boyama ve sadece olmayan EV'lerin neden olduğu pozitif olaylar ortaya ancak eşiğe iyi bir tahmini çekme negatif popülasyonlar pozitif ayırt sağlayan bir negatif kontrol olarak, deterjan liziz 3) kullanımı ilişkisiz Ab Yıkama kapılar. Bireysel tespit protokolü bir günde yapılabilir gibi Boncuk esaslı bir yöntem, bir gece boyunca inkübasyon gerektirmektedir ise örneklerin çok sayıda test ihtiyacı olduğunda tavsiye edilir.
her bir protokolde, negatif kontroller farklı avantajlar ve kullanılan tespit yöntemi, bağlı dezavantajları vardır. Boncuk-tabanlı a kullanmanın bir yararıssay aynı monoklonal antikorlar, pozitif ve negatif borular için kullanılabilir ve aynı negatif kontrol tüm örnekler için kullanılabilir olmasıdır. Bireysel tespit yöntemi, diğer taraftan, test edilen her numune için okunacak ayrı kontroller gerektirir. Bireysel tespit protokolü tarafından kullanılan negatif kontrol, ek antikorların kullanımı / tüketiminin gerektirmeyen, ancak, her boru yokedici maddenin ilave edilmesinden sonra bir ikinci kez okunmasını gerektirir parçalanan örnekleri kullanmaktadır. lize kontrolleri gibi immün kompleksleri 21 non-vezikül ile ilgili olayları isnat edilebilir olumlu sinyal oranını tespit edememek yararı var. Boncuk esaslı deneyi gerçek pozitif EV'lerin kaynaklanan sinyallerin olmayan veziküllerden oluşan arasındaki bu yeteneği todistinguish bulunmamaktadır.
Tekniğin Sınırlamalar
EV'lerin izolasyonu için herhangi bir standart yöntem olsa da, diferansiyelsantrifüj EV araştırmacılar arasında yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Burada anlatılan diferansiyel santrifügasyon yöntemi, 10-30 dakika boyunca 10,000-13,000 xg arasında ikinci bir santrifüj, ardından tipik olarak 10-20 dakika hücreleri çıkarmak için 1,200-1,500 xg arasında bir ilk santrifüj gerektiren PPP, izole edilmesi için ortak protokollerine dayanmaktadır trombosit 35 kaldırmak için. Burada tarif edilen protokol, 10 dakika boyunca 13,000 x g'de santrifüje edilerek ve ardından, 10 dakika boyunca 1500 x g'de bir santrifüj kullanır. 25,000-100,000 xg yüksek güçleri genellikle AGH pelet gerekli iken, daha büyük AGH bazı biz sunduk diferansiyel santrifüj protokolü ile kaldırılmış olabilir.
100,000 x g'de bir saat ultra-santrifüj ile kaybolur FCM tespit EV'lerin% 90 kadar (veriler gösterilmemiştir). Bu olumsuz numune bileşimi etki edilebilir uzun santrifüj kez dikkatli bir şekilde de olsa, dikkate alınmalıdır. Ek işlem f gerekiyorsaveya karakterizasyon çalışmaları, filtrasyon ayrıca parçacık boyutuna dayanan örnekleri fraksiyonlanması (boyama öncesi) 2 aşamalı santrifüj işleminden sonra gerçekleştirilebilir. Ultra santrifüj benzer şekilde, filtreleme pozitif işaret olayların% 50'ye kadar bir kaybına neden olabilir ve FCM tarafından bulgulanan toplam partiküllerin% 90'ı kadar (veriler gösterilmemiştir). Bir sinyal-gürültü oranı artışı açıkça yararlı olsa da herhangi bir yıkama ya da izolasyon yöntemi göz önüne alındığında, daha küçük EV'lerin kaybı önemli bir sınırlama oluşturmaktadır.
Son olarak, antikoagülan kullanılan (örneğin, heparin, ACD, etilendiamintetraasetik asit (EDTA), vb) kan toplama sırasında EV içeriğin kalitesini ve miktarını etkileyebilir. ACD eden çalışmalar için iyi ve güvenli bir antikoagülan olduğu kanıtlanmış olmakla birlikte, çok sayıda çözüm test uygulama için en uygun pıhtılaşma seçilir sağlamak için önerilir. AGH alt baş deneylerde kullanılacak olduğunda, bu özellikle önemlidirnerede sonucunu etkileyebilir kullanılan antikoagülan. Örneğin, bazı antikoagülan (örneğin, EDTA ve heparin) diğerleri (örneğin, teofilin, adenosin ve dipiridamol) trombosit 12 EV salınımını inhibe ettiği gösterilmiştir ve PCR reaksiyonları ile etkileşime girdiği bilinmektedir.
Oldukça son on yılda geliştirilmiş EV analiz yöntemleri, hala devam eden bir çalışma vardır. Sonuçta, araştırma bağlıdır AGH analiz için en iyi yöntem yürütülen ve araştırmacı araçlar kullanılabilir olması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek çıkar çatışması var.
Acknowledgments
Yazarlar enstrüman ayarları sitometrede akışı ile yaptığı yardım için kan Sistemler Araştırma Enstitüsü'nden Dale Hirschkorn teşekkür etmek istiyorum. NIH tarafından desteklenen bu çalışma HL095470 ve U01 HL072268 ve DoD sözleşmeleri W81XWH-10-1-0023 ve W81XWH-2-0028 verir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
