Summary
Mange forskjellige fremgangsmåter eksisterer for måling av ekstracellulære vesikler (kjøretøyer) ved hjelp av strømningscytometri (FCM). Flere aspekter bør vurderes når man skal avgjøre den mest hensiktsmessige metoden å bruke. To protokoller for måle elbiler presenteres, enten ved hjelp av individuell gjenkjenning eller en perle basert tilnærming.
Abstract
Ekstracellulære Blemmer (elbiler) er små, membran-avledet vesikler som finnes i kroppsvæsker som er svært involvert i celle-celle kommunikasjon og hjelper med å regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser. Analyse av elbiler bruker flowcytometri (FCM) har vært notorisk vanskelig på grunn av sin lille størrelse og mangel på diskrete populasjoner positive for markører av interesse. Metoder for EV analyse, mens betydelig forbedret de siste ti årene, er fortsatt et arbeid som pågår. Dessverre, det er ingen one-size-fits-all-protokollen, og flere aspekter må vurderes når man skal avgjøre den mest hensiktsmessige metoden å bruke. Presenteres her er flere forskjellige teknikker for behandling elbiler og to protokoller for å analysere elbiler ved hjelp av enten individuell gjenkjenning eller en perle basert tilnærming. Metodene som beskrives her, vil hjelpe til med å eliminere de antistoffaggregater som vanligvis finnes i kommersielle preparater, øker signal-til-støy-forhold, og innstillings portene i en rasjonell fashion som minimerer påvisning av bakgrunnen fluorescens. Den første protokollen bruker en individuell deteksjonsmetode som er spesielt godt egnet for å analysere et høyt volum av kliniske prøver, mens den andre protokollen bruker en perle basert tilnærming for å fange opp og oppdage mindre elbiler og exosomes.
Introduction
Ekstracellulære Blemmer (elbiler) er små, membran-avledet vesikler som finnes i kroppsvæsker som er svært involvert i celle-celle kommunikasjon og hjelper med å regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser. Analyse av elbiler bruker flowcytometri (FCM) har vært notorisk vanskelig på grunn av sin lille størrelse og mangel på diskrete populasjoner positive for markører av interesse. Metoder for EV analyse, mens betydelig forbedret de siste ti årene, er fortsatt et arbeid som pågår. Dessverre, det er ingen one-size-fits-all-protokollen, og flere aspekter må vurderes når man skal avgjøre den mest hensiktsmessige metoden å bruke. Presenteres her er flere forskjellige teknikker for behandling elbiler og to protokoller for å analysere elbiler ved hjelp av enten individuell gjenkjenning eller en perle basert tilnærming. Metodene som beskrives her, vil hjelpe til med å eliminere de antistoffaggregater som vanligvis finnes i kommersielle preparater, øker signal-til-støy-forhold, og innstillings portene i en rasjonell fashion som minimerer påvisning av bakgrunnen fluorescens. Den første protokollen bruker en individuell deteksjonsmetode som er spesielt godt egnet for å analysere et høyt volum av kliniske prøver, mens den andre protokollen bruker en perle basert tilnærming for å fange opp og oppdage mindre elbiler og exosomes.
Elbiler, også kjent som mikropartikler, er små, membran-avledet vesikler som finnes i kroppsvæsker som er involvert i celle-celle kommunikasjon og hjelper med å regulere et mangfoldig utvalg av biologiske prosesser 1. Ved ekspresjon av forskjellige overflatemarkører og / eller direkte overføring av biologisk materiale, EV er i stand til å endre funksjonen av mottakercellene til å spille enten aktivere eller undertrykke roller i intercellulær kommunikasjon 2 - 4. Klinisk platederivert EV er kjent for å ha sterk antikoagulerende aktivitet 5, mens andre har vist seg å bidra til et bredt spekter av tilstander, fra å fremme tumor metastasis 6 til å beskytte mot sykdom 7. Elbiler kan klassifiseres i mindre kategorier av celle-stammer vesikler som exosomes og mikrovesikler (MV), avhengig av størrelse og mekanisme generasjon 8. Nomenklaturen av celle-avledet vesikkel subpopulasjoner fortsetter å være et emne for debatt 8,9, men exosomes er generelt beskrevet som små, 40 til 100 nm-partikler avledet fra endosomale fusjon med plasmamembranen, mens MV er større 100 til 1000 nm partikler dannet ved utstøtingen av plasmamembranen 10. Her vil den generelle termen "elbiler" brukes til å referere til alle typer ekstracellulære biologiske vesikler utgitt av celler.
Isolering av el-biler fra helblod er en flertrinns fremgangsmåte og mange forskjellige prosessvariable har vist seg å påvirke EV innhold, inkludert lagringstemperatur og varighet 11,12, antikoagulant / konserveringsmiddel som brukes, og 13sentrifugeringsmetoden brukes 14. Et behov for standardisering av disse variablene har ført til anbefalinger fra International Society på Trombose og Haemostasis Vitenskapelige og Standardisering Committee (ISTH SSC) for skikkelig blod prosessering og EV isolasjonsprosedyrer 15,16, men det finnes ingen enighet blant forskere om den optimale protokollen å bruke 12. De fleste er imidlertid enige om at tett kontrollert pre-analytiske variabler er avgjørende for nøyaktige og reproduserbare data.
For å analysere elektriske biler, har forskere benyttet forskjellige metoder, inkludert transmisjonselektronmikroskopi 17, scanning elektronmikroskopi 18,19, atomkraftmikroskopi, dynamisk lysspredning 20,21 og western-blotting 22,23. Mens FCM er metoden for valg for mange forskere 9,24 - 26 på grunn av sin store gjennomgangs evner, har analyse av elbiler bruker FCM værtnotorisk vanskelig på grunn av deres størrelse og mangel på adskilte positive populasjoner 27-32. Sammenlignet med analyser av celler, til den lille størrelsen av EVS resulterer i 1) mindre fluorescens avgitt på grunn av det mindre antall antigener per partikkel og 2) begrenset muligheten for post-flekk vasking, noe som er nødvendig for å redusere bakgrunnsfluorescens. Felles utfordringer blant forskere inkluderer signaler som kommer fra immunglobulinaggregater 27,28 og selv aggregering av antistoffer 29. Videre er lang saksbehandlingstid og lange vask / isolering prosedyrer som brukes av mange av de aktuelle protokollene 33,34 krever multi-dagers tid forpliktelser til å analysere et lite antall prøver, noe som gjør dem mindre enn ideell for programmer med høy gjennomstrømning. Noen forskere avkall en vasketrinn helt, rende tradisjonelt brukt FCM negative kontroller som fluorescens minus én (FMO) og antistoffisotypene ubrukelig for nøyaktig vurdering av background fluorescens 30.
Våre protokoller adressere tre vanlige problemer som kan hemme riktig FCM analyse av elbiler: signaler som oppstår ved antistoff aggregater og andre ikke-blemmer, vanskeligheter med å fjerne ubundet antistoff, og mangel på bare positive populasjoner. De teknikker som er beskrevet her, vil hjelpe til med å eliminere de antistoffaggregater vanligvis finnes i kommersielle preparater, øker signal-til-støy-forhold, og å sette portene på en rasjonell måte som minimerer påvisning av bakgrunnsfluorescens. To forskjellige deteksjonsmetoder presenteres her: den første protokollen bruker en individuell deteksjonsmetode som er spesielt godt egnet for å analysere et høyt volum av kliniske prøver, mens den andre protokollen bruker en perler basert tilnærming for å fange opp og oppdage mindre elbiler og exosomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Følgende protokoller er utført i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd. Alle menneskelige lagt prøvene ble testet under en Institutional Review Board (IRB) -godkjent protokoll og med informert samtykke av fagene.
1. METODE A: Individuell Detection Method
1.1) Behandling av Blood Sample / Isolering av elbiler
- Trekke blod fra donor / pasient inn i to 10 ml glassrør inneholdende 1,5 ml ACD-løsning A eller annet egnet antikoagulant og prosessen umiddelbart (innen 30 min maks) ved hjelp av følgende to-trinns differensialsentrifugering protokollen.
MERK: Denne protokollen vil gi ca 10 ml av blodplate dårlig plasma (PPP) fra de kombinerte ~ 17 ml blod trukket. Hvis mer eller mindre PPP er nødvendig, kan antallet av rør av blod oppsamlet justeres tilsvarende. - Sentrifuger prøvene ved 1500 xg i 10 min ved RTfor å separere plasma fra buffy coat og røde celler. Overfør 1,2 ml deler av plasmasupernatant til 1,5 ml sentrifugerør, være forsiktig for ikke å forstyrre de nederste lagene som inneholder fibrinlagområdet og røde blodlegemer.
- Rotere ved 13.000 xg i 10 minutter ved RT for å fjerne blodplater og store cellefragmenter. Nøye overføre PPP, etterlot 200 mL å unngå å forstyrre pelleten og legge PPP til et nytt rør.
- På dette punktet, bruker PPP umiddelbart for analyse eller overføring i 1,0 ml deler til nye 1,5 ml sentrifugerør og oppbevares ved -80 ° C i inntil to år for senere analyse (se Figur 1A for oversikt).
- Hvis det trenges rensede EV for funksjonell eksperimenter, overførings 6 ml PPP til et ultrasentrifugerør og tilsett 28 ml av 0,2 um-filtrert fosfatbufret saltvann (PBS). Spinn i 60 minutter ved 100 000 x g ved romtemperatur ved bruk av en ultrasentrifuge utstyrt med en svingende spannrotor. Aspirer supernatanten og resuspender EV pella i 1,5 ml media.
MERK: For høyeste reproduserbarhet, bør blodprøver bli behandlet så konsekvent som mulig fra giver til donor. Enhver variasjon i EV isolasjon metoden kan ha betydelig innvirkning på antall og type av elbiler oppdaget.
1.2) Forberede Prøver for analyse
MERK: Fra nå av trinnene forklare en høy gjennomstrømning protokoll for å analysere 12 prøver for 14 markører i tre paneler. Imidlertid kan andre kombinasjoner av antistoffer som brukes her; protokollen kan tilpasses for å studere andre EV populasjoner ved å anvende de foreslåtte markører for de av interesse.
- Fjern 12 prøver fra fryseren (hvis det er lagret ved -80 ° C) og tine ved 37 ° C.
- Pipettes innholdet opp og ned flere ganger for å blande. Fjern 320 mL fra hver prøve og legge til den øverste raden i en 96 brønners plate.
MERK: En bredde-justerbar multi-brønn pipette er svært nyttig for dette og mange andre skritt over hele rumpaay, spesielt når analysere flere prøver på en gang.
1,3) Farging EV Samples
- Før farging, filtrere alle antistoffer (ABS) for å fjerne aggregater, noe som kan føre til positive signaler.
- Kombiner antistoffer som skal brukes i hver av de tre plater i separate 0,22 um sentrifugale filterrør og sentrifuge ved bruk av en fast vinkel enkelt hastighet sentrifuge (~ 750 x g) ved romtemperatur i 2 minutter, eller inntil alt av det Ab blandingen har passert gjennom filteret og ikke noe antistoff væske forblir på overflaten av filteret. Oppbevar Mage cocktails i kjøleskapet i opptil to uker, men re-filter hver gang før bruk.
- Legg riktig mengde filtrert Ab blandingen til hver brønn i rad to (f.eks prøver i Panel jeg er farget med 2 mL av hver Ab, så totalt 12 mL av filtrert Ab cocktail er tilsatt per brønn til rad 2). Se figur 1B for en skisse av platen kart foreslått. Gjenta disse tilleggs til radene under hvis flere paneler blir drevet (her, legg 8 pl / brønn av Panel II cocktail i rad 3 og 11 ul / brønn Panel III cocktail til rad 4; se Materials List for spesifikk informasjon panel).
- Ved hjelp av multikanal pipette, blande de PPP-prøver i rad 1 opp og ned og overføre 100 ul fra brønnene i rad 1 til brønnene i rad 2. Bland opp og ned. Endre tips og gjenta, overføre 100 mL fra rad 1 til rad 3 og 4. Inkuber ved 4 ° C i 30 min.
1,4) Vaske MV Samples
- Fjern 96-brønners plate fra 4 ° C og overføres til biologisk trygghetskabinett. Ved hjelp av en multikanal pipette, tilsett 220 ul av PBS / brønn i radene 6-8 (brukes til skylling / vasking av brønnene inneholdende farget PPP).
- Overfør innholdet av hver brønn til pre-merket sentrifugalfilter rør ved hjelp av breddejusterbare flerkanals pipette (For 12 prøver, med tre paneler av antistoffer, 12 x 3 = 36 filter rør vilvære nødvendig). Ved hjelp av de samme tipsene, fjerne 200 mL PBS fra vaske rader og legge til de tilsvarende brønner som PPP ble nettopp fjernet.
- Bland opp og ned for å skylle brønnene og overføre skylle løsning på de samme filtrene som PPP ble tidligere lagt til. Nære topper av sentrifugal filtre. Endre tips.
- Gjenta denne prosessen med de resterende farget prøvene før alle farget PPP prøver har blitt overført sammen med sine skylle løsninger på sentrifugal filtre.
- Overføre sentrifugalkreftene filtrene til en fast rotorsentrifuge og sentrifugering ved 850 x g i 3 min ved RT.
MERK: Pass på at ingen væske forblir på filter topper. Etter sentrifugering, bør filteret synes å være "tørr" uten noen synlig væskesjikt er igjen på toppen. Mens usannsynlig, kan visse PPP prøvene krever en lengre sentrifuge tid for effektivt å bevege seg gjennom filteret. - Fjern de sentrifugale filterrørene, og går tilbake til den biologisk trygghetskabinett.Ved hjelp av multikanal pipette, resuspender toppene av filtrene i 300 ul PBS. Overfør resuspendert innholdet til forhåndsmerkede rør for umiddelbar FCM analyse.
MERK: Det er svært viktig å holde styrken og antall pipette stempel depresjoner konsistente blant prøver å unngå sample-to-sample variasjon. Dette bør ideelt gjøres ved hjelp av en elektronisk pipette som har blitt programmert til å pipettér opp og ned et bestemt volum (for eksempel 280 ul) et eksakt antall ganger (for eksempel åtte ganger) for hver prøve.
1.5) Cytometer Setup
- Åpne FCM programvare. Før eksperimentere oppsett, utføre daglig instrument kalibrering og oppsett du bruker installerings instrument perler (etter produsentens anvisninger).
- Hvis EV prøvene har blitt farget med mer enn ett antistoff og flere fluorokromer skal måles samtidig, beregne kompensasjonsverdier som følger:
- Tilsett 2 dråper kompensasjon perler til pre-merkede rør (1 tube for hver fluorokromkonjugerte antistoffet) og legge den anbefalte mengden av antistoff. Tilsett 2 dråper negative kompensasjon perler til et annet rør som skal brukes som unstained kompensasjon kontroll.
- Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter, vask med PBS og resuspendert i 400 ul PBS.
- Bruke flowcytometer programvaren som følger med instrumentet, kjøre hver kompensasjon rør og justere fluorescerende spenninger å plassere hver topp på ca 10 4 på en fem-ti log skala. Kontroller at fluorescens topp er høyest (lyseste) i sin egen fluorescerende kanal sammenlignet med alle andre kanaler, og justere spenninger på fluorescerende parametre igjen om nødvendig. Kjør hver individuelt-farget komp rør og fange minst 5000 hendelser per tube.
- Velg fanen "Experiment", velg deretter "Kompensasjon", velg deretter "Beregn Erstatning" for å bruke kompensasjonsverdiene til alle prøvene.
- Mens du kjører en tube på 0,22 mikrometer-filtrert PBS, justere FSC & SSC spenninger til de høyeste verdiene som utelukker de fleste av bakgrunnsstøy (dvs. rett under spenning terskelen for når hendelsesrate overgår fem hendelser / sek).
- Deretter kjører du en tube som inneholder 0,2 mikrometer - 1,0 mikrometer perler, fortynnet i PBS om nødvendig. I en FCS vs. SSC tomten, tegne en gate rundt perle befolkningen til å fange opp hendelser mellom 0,2 mikrometer og 1,0 mikrometer. Alternativt, i en SSC-H histogram, tegne en gate for å inkludere alle hendelser mindre enn 1,0 mikrometer perler.
- Still cytometer største strømningshastigheten til "Lo" (ca. 8-12 ul / min). Bruke perler tube (eller annet rør som inneholder en kjent konsentrasjon av perler) justere vannstrømmen hjulet på cytometeret inntil like førnt sats når omtrent 200 hendelser / sek. Les alle prøverør på samme strømningshastighet og bruke samme perle konsentrasjon i fremtidige eksperimenter for å sikre at strømningshastigheter forbli konsistent mellom kjøringer.
- Kjør en tube av regnbue fluorescerende partikler fortynnet i PBS. Erverve 5000 hendelser. Spill gjennomsnittsintensitetsverdiene for FSC, SSC, og hver fargekanal. Bruk disse verdiene til å justere spenninger i fremtidige eksperimenter for å sikre at fluorescensintensiteter forbli konsistent mellom eksperimenter.
1.6) Eksempel Reading
- Still cytometer største strømningshastigheten til "Lo" (ca. 8-12 ul / min) og drives hver prøve for nøyaktig 1 eller 2 minutter.
- Etter den første lesning, tilsett 20 pl av 10% NP-40 til hver prøve, pipette opp og ned, og re-les for samme tidsperiode (enten 1 eller 2 minutter) for å muliggjøre subtraksjon av positive hendelser detektert i den lyserte prøve i løpet av en lik tidsperiode.
MERK: Det er svært important at prøvene blandes ved hjelp av en pipette i stedet for en vortex. I vår erfaring, kan virvling forårsake selv aggregering av noen antistoffer, som fører til EV-hermet positive hendelser. - Når alle prøvene som er lest og eksportere alle .fcs filer til en egen fil som skal brukes til videre analyse ved hjelp av FCM analyse programvare.
1.7) Data Analysis
- Åpne FCM analyse programvare. Importere alle .fcs filer til et nytt eksperiment fil.
- Åpne perler-bare rør. I FSC-A vs. SSC-A plot, tegne en gate rundt alle perler størrelse mellom 0,2 mikrometer og 1,0 mikrometer. Dette er den EV gate. Dra for å legge til alle prøvene.
- Ved hjelp av de lyserte prøver som negative kontroller, trekke porter på kanten av bakgrunnsfluorescens i hvert fluorescens kanal anvendt. Dra fluorescerende portene inn i EV gate av hver tilsvarende ikke-lysert prøven.
MERK: På dette punktet er det også nyttig å undersøke dual fluorescerende bi-parameter plott. Rocket former idobbel-positive kvadrant (se figur 8), særlig hvis de markører er kjent for å befinne seg på ikke-relaterte celletyper, kan det være en indikasjon på gjenstanden fra aggregering eller annet vesikkel-ligne hendelser. - For hver fluoriserende fargestoff, trekke fra antall hendelser i lysert prøven fra antall hendelser i den ikke-lysert prøven. Eventuelt kan dele dette tall med det totale antall av el-biler innen de ikke-lyserte EV port for å få% positive verdier.
2. B: Perler Method
2.1) Behandling av Blood Sample / Isolering av elbiler
- Refererer til blodbearbeidelsesfremgangsmåten beskrevet i metode A (avsnitt 1.1).
2.2) Forberede Prøver for analyse
- Dersom det er ønskelig, fraksjonerer PPP eller ultrasentrifugert elbiler i exosomes og mikrovesikler. Legg 250 mL av PPP eller ultrasentrifugert elbiler til 0,22 mikrometer sentrifugale filtre og overføre til en fast rotor sentrifuge og spinn på 750 xg i 2 min ved RT.
MERK: Pass på at ingen væske forblir på filter topper. Etter sentrifugering, bør filteret synes å være "tørr" uten noen synlig væskesjikt er igjen på toppen. Mens usannsynlig, kan visse prøver kreve en noe lengre tid for sentrifuge fluidet for effektivt å bevege seg gjennom filteret. - Vask ubestrøket 6 mikrometer polystyrenperler (f.eks negative ABC perler) 2x med RPMI media, og resuspender i 2 ml. Legg 6.000 perler til hver FACS tube. Til den negative kontrollen tube, tilsett 400 mL av RPMI media alene til perlene. Til alle andre rør, legge til 200 mL av PPP eller ultrasentrifugert elbiler (eller deres fraksjoner) og 200 pl RPMI media.
- Justere det endelige volum av alle rør til 400 pl med media og inkuber over natten ved 4 ° C på en ristemaskin.
- Neste morgen, vaske perler med 2 ml av media. Aspirer av supernatanten.
- Blokk med 5% bovint serumalbumin (BSA) i mediet (400 ul) i 3 timer ved 4 &# 176 C på en ristemaskin.
- Vask perler med 2 ml av media. Aspirer og resuspender pelleten i 100 pl medium.
2,3) Farging EV Samples
- Filtrere alle antistoffer. Bruk samme antistoffpaneler som benyttes i metode A, eller hvis ønskelig, å skape en annen kombinasjon av antistoffer, så lenge deres fluorokromer er kompatible med hverandre.
- Kombiner alle antistoffene som skal anvendes i et enkelt panel i et 0,22 um filter sentrifugal-rør. Sentrifuger ved hjelp av en fast vinkel enkelt hastighet sentrifuge i 2 minutter eller inntil alt Ab blandingen har passert gjennom filteret, og ingen antistoff væske forblir på overflaten av filteret.
- Legg passende volum av filtrert antistoff cocktail til alle rør og inkuberes i 30 min ved 4 ° C.
- Vask perler med 2 ml av media, resuspender i 400 mL av media og kjøre umiddelbart (eller innen samme dag) på flowcytometeret.
2.4) Cytometer Setup og Sample Reading
- Åpne FCM programvare. Før eksperimentere oppsett, utføre daglig instrument kalibrering og oppsett du bruker installerings instrument perler (etter produsentens anvisninger).
- Hvis EV prøvene har blitt farget med mer enn ett antistoff og flere fluorokromer skal måles samtidig, beregne kompensasjonsverdier som følger:
- Tilsett 2 dråper kompensasjon perler til forhåndsmerkede rør (1 tube for hver fluorokromkonjugerte antistoffet) og legge den anbefalte mengden av antistoff. Tilsett 2 dråper negative kompensasjon perler til et annet rør som skal brukes som unstained kompensasjon kontroll. Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter, vask med PBS og resuspendert i 400 ul PBS.
- Bruke FCM programvare, kjøre hver kompensasjon rør og justere fluorescerende spenninger å plassere hver topp på ca 10 4 på en fem-tiår log skala. Kontroller at fluorescens topp er høyest (lyseste) i sin egen fluorescerende kanal sammenlignet med alle andre kanaler, ogjustere spenninger fluorescerende parametere på nytt hvis det er nødvendig. Kjør hver individuelt-farget komp rør og fange minst 5000 hendelser per tube.
- Velg fanen "Experiment" og deretter "Kompensasjon" og deretter "Beregn Erstatning" for å bruke kompensasjonsverdiene til alle prøvene.
- Endre FSC og SSC spenning parametere for å logge skala og velge de laveste terskler tillates av cytometeret (FSC = 200 og SSC = 200) for hver.
- Kjør prøver, gate på singlet perler befolkning og erverve 2000 hendelser i denne gate. Eksport .fcs filer.
- Bruk FCM analyse programvare for å analysere .fcs filer. Gate på singlet perler. Beregn geometrisk gjennomsnitt fluorescerende intensitet (MFI) for hver fluorokrom og sammenligne med MFI av den negative kontrollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 skisserer den generelle prosesseringsskjema for isolering og påvisning av el-biler enten ved hjelp av kulebasert metode eller individuelle påvisningsmetode. Individuell påvisning av elbiler bruker FCM fungerer godt for å analysere større elbiler, men de fleste cytometere er ikke i stand til individuelt detektere partikler så små som exosomes. En kulebasert tilnærming tillater små EV som skal detekteres, men det er ulemper forbundet med å bruke denne metoden, som beskrevet i tabell 1. Vanligvis er isolering av el-biler ved hjelp av ultrasentrifugering (med eller uten tilsetning av en sukrosegradient fraksjoneringsprosedyre) anbefales når elbiler er behov for funksjonelle analyser. Ultracentrifugation fjerner urenheter, inkludert serumproteiner og andre oppløselige forurensninger fra plasma, som kan påvirke funksjonelle eksperimentelle resultater. Imidlertid er ultrasentrifuge tidkrevende og kan endre EV kvantitet og kvalitet 12.
"> Er Forventede resultater for de to deteksjons analysene er vist i figurene 2-3. For den enkelte deteksjonsanalyse, den lyserte kontroll (nederste rad, figur 2) brukes for å sette porter for det tilsvarende ikke-lysert prøve (øverste rad, figur 2). De fleste av hendelsene skal falle innenfor EV gate. Quadrant porter skal ikke avsløre doble positive hendelser når de to markørene i sammenligning ikke er normalt på samme celle. De riktige biparameter tomter i Figur 2 viser markørene CD108a og CD235a , som er to røde blodcellemarkører som er kjent å eksistere på celler. Her, på el-biler, over halvparten av de positive hendelser er positive for begge markører, som forventet. På samme måte, til celleoverflatemarkører som er kjent, er i samme celle bør viser lignende mønstre av dobbel positivitet på elbiler. De sentrum biparameter tomter viser EV uttrykk for to markører som er kjent for ikke å eksistere på celler. I denne analysen av CD235a (en rød blood celle markør) og CD41a (et blodplate markør), de elbiler viser forskjellige, separate, positive populasjoner, som forventes siden de kommer fra forskjellige celletyper. Når lysert, bør positive hendelser forsvinne. Generelt, enten positive hendelser som er igjen etter lysis indikerer tilstedeværelse av signalet som kommer fra ikke-vesikkel partikler, aggregater og / eller detergentresistente EV. Figur 3 viser forventede resultater ved hjelp av kulebasert påvisningsmetode. I motsetning til de enkelte deteksjonsmetoden, er disse data ikke kan / bør ikke sees i bi-parameter plott. I de øvre dot plots, noe skille mellom de positive og negative populasjoner eksisterer, og hendelser vises i de doble positive kvadranter, selv om de ikke normalt finnes på de samme celletyper på grunn av det faktum at begge typer av el-biler vil binde seg til en enkelt perle. For perlen-basert gjenkjenning metoden, er data beste analysert ved hjelp av histogram overlegg med negativ kontroll (avbildet under dot tomter). Positivitet is målt ved anvendelse av en markør MFI (gjennomsnittlig fluorescensintensitet) og sammenlignes direkte med den for den negative kontroll. Hvis prøven er positiv for markeringen i spørsmålet, vil dens MFI være høyere enn den negative kontroll. Den negative kontroll for den kulemetoden er ganske enkelt perler blokkert med BSA (ingen EV tilsatt), som har blitt farget med de samme antistoffer og vasket sammen med EV-belagte kuler. En sammenligning av de forventede resultater ved hjelp av de to metodene kan sees i figur 4.Evnen til den enkelte deteksjon analyse for å vurdere riktig EV fenotyper avhengig tungt på riktig gating å skille Ab-positive hendelser fra bakgrunnen fluorescens. Derfor er det viktig å velge en negativ kontroll som mest hensiktsmessig ligner / predikerer bakgrunnsfluorescens for en gitt prøve. Når farget elbiler ikke er vasket før du leser, som vanligvis brukes negative kontroller (f.eks isotyper) ikke klarer å forutsi nøyaktig bakgrunn fluorescence for alle merkene (figur 5A). I disse tilfeller, hvis vaskingen er ikke et alternativ, lyserte prøver har en tendens til å fungere bedre til å forutsi bakgrunnsfluorescens. Imidlertid, når farget EV vaskes før lesing (ved hjelp av sentrifugal filtrering, i dette tilfellet), både negative kontroller (isotyper og lyserte prøver) fungere godt for å forutsi bakgrunnsfluorescens av en prøve (figur 5A). Det bør imidlertid bemerkes, at mens alle negative kontroller "arbeid" lyserte kontroller er foretrukket fordi de gir ytterligere informasjon om en prøve (f.eks nærvær av vaskemiddelresistent, ikke-vesikkel-relaterte hendelser og / eller aggregater) som kan resultere i ikke-EV positive signaler og feil blåse Mage teller. Videre kan isotype kontroll noen ganger være upålitelig, selv i de vaskede prøver, som vist i figur 5B, hvor det fargede prøven har færre positive hendelser enn den samme prøven farget med matchede isotypekontrollantistoffer. Uten grundig fjerning av ubundet antistoff, FCM prikkplotter av noen EV markørene er nesten umulig å tolke, fremstår som skyer av svakt fluorescerende partikler utvisket fra deres høyt fluoriserende bakgrunn (Figur 6, topp tomten). Vaske farget prøver ved hjelp sentrifugale filtre forbedrer separasjon mellom bakgrunnen og positive markør signaler (Figur 6, bunn tomten); Imidlertid kan små elektriske biler og exosomes gå tapt gjennom porene i filteret.
Bruken av et vaskemiddel lysetrinn avslører positive, vesikkel-hermet hendelser fra immunkomplekser og protein aggregater 21. Når PPP er analysert ved hjelp av individuell gjenkjenning, opplever positive hendelser som ikke forsvinner med lyse er en ganske ofte forekomst. Disse vaskemiddel bestandig hendelser vises ofte som mistenkelige, sterkt fluorescerende diagonale signaler i både single parameter og biparameter plott (figur7). Klinisk disse proteinkomplekser og / eller uoppløselige immunkomplekser er mer vanlig hos pasienter som lider av forskjellige sykdommer, 21 så som reumatoid artritt 28, 19 nefrotisk syndrom og systemisk lupus erythematosus 29. Derfor, avhengig av målet for undersøkelser, kan det være ønskelig å inkludere eller fjerne dem fra analysis.Another måte diagonale signaler kan dannes er ved å virvle prøvene, spesielt etter tilsetning av lysis-reagens (figur 8). Prøvene bør alltid være blandet opp og ned ved pipette for å hindre dannelsen av aggregater.
Figur 1: Samlet behandling ordningen for isolering og påvisning av elbiler ved hjelp av enten perlen basert metode eller individuell gjenkjenning metoden. (A) Fullblod blir først behandlet i PPP. Frare, PPP kan enten bli behandlet videre ved hjelp av ultrasentrifugering for å gi isolerte elbiler eller brukes som den er i den enkelte påvisning eller perle baserte analyser. (B) Oversikt over foreslåtte plate kartet for høy gjennomstrømning analyse av prøver med den enkelte påvisningsmetoden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Forventet resultater for Individuell Detection flowcytometri prikkplotter viser representative farging av lyserte og ulyserte EV prøver. Verdier viser prosenter av positive hendelser. De fleste av hendelsene faller innenfor EV gate. Hendelser som vises i de rette biparameter tomter er innenfor FSC / SSC EV porter på venstre. Den lysert prøve (nederste rad) brukes til å angi fluorescerende-baserte porter for each tilsvar (ikke-lysert) prøve. Quad porter skal ikke avsløre doble positive hendelser når de to markørene i sammenligning ikke er normalt på samme celle. Her, biparameter CD235a og CD41a plottet viser en tydelig skille mellom elbiler uttrykker røde blodcellemarkører og de uttrykker platecellemarkører. Likeledes bør celleoverflatemarkører kjent for å ligge på samme celle viser lignende mønstre av dobbel positivitet på elbiler. Den høyre biparameter plott viser at over halvparten av CD235a-positive elbiler er også positiv for den sekundære røde blodceller (RBC) markør, CD108a. Når lysert, bør positive hendelser forsvinne. Positive hendelser som er igjen etter lysis indikerer tilstedeværelse av signalet som kommer fra ikke-vesikkel eller detergentresistente partikler og / eller aggregater.
Figur 3: Forventet resultatene med perle-basert gjenkjenningmetoden. Strømningscytometri dot plots viser representative farging av el-biler koplet til perler, sammenlignet med perler blokkert med BSA, som tjener som negativ kontroll. Verdier viser prosenter av positive hendelser. Hendelser som vises i de rette biparameter tomter er innenfor FSC / SSC perler porter på venstre. For perler basert deteksjon metoden, er data beste analysert ved hjelp av histogram overlegg med negativ kontroll (avbildet under dot tomter). Positivitet måles ved hjelp av en markør MFI (gjennomsnittlig fluorescensintensitet) og sammenlignes direkte med den for den negative kontroll.
Figur 4:. Sammenligning av forventede resultater ved hjelp av perler vs. individuell gjenkjenning Flowcytometri dot tomter viser representative farging av elbiler koblet til perler (øverste rad), sammenlignet med elbiler analysere ved hjelp av individuell gjenkjenning (nederste rad). Hendelservist i retten biparameter tomter er innenfor FSC / SSC perler porter på venstre.
Figur 5:. Sammenligning av ulike negative kontroller i individuell gjenkjenning analyse Verdier viser prosenter av positive hendelser. Hendelser som vises er innenfor FSC / SSC EV gate. (A) Sammenligning av negative kontroller i uvasket vs. vasket prøver. Isotype eller lyserte kontroller ble evaluert for deres evne til å gi passende indikasjoner på bakgrunnsfluorescens over to forskjellige markører i et fullt farget prøve (nederste rad). Porter for hver markør ble gjort ved hjelp av lysert prøven (øverste rad) og deretter kopiert til radene under. Vasket prøvene ble vasket ved hjelp av post-flekken filtrering. (B) Eksempel på en prøve farget med isotypekontroll ha mer positive hendelser enn prøven farget with faktiske antistoff.
Figur 6:. Effekt av post-flekken vask i individuell gjenkjenning verdier viser prosenter og antall positive hendelser. Hendelser som vises er innenfor FSC / SSC EV gate. Porter for hver prøve ble gjort ved hjelp av hver prøve er lysert motstykke (ikke vist, se forrige figur for gate-innstillingen i uvasket vs vasket prøver). Høy bakgrunn fluorescens gjør skille positive fra negative hendelser vanskelig (øverst tomt). Når vaskes, er imidlertid den positive populasjon avslørt som ubundne fluorescerende antistoffer blir fjernet og bakgrunnsfluorescens reduseres (bunnflekk).
Figur 7: Vaskemiddel lyser bekrefter tilstedeværelsen av ikke-EV signals. Hendelser som vises er innenfor FSC / SCC EV gate. Verdier viser prosenter av positive hendelser. Stained EV prøvene ble lest før (venstre kolonne) og etter tilsetting av vaskemiddel (høyre kolonne) for å identifisere positive signaler forårsaket av immunkomplekser og andre-EV-relaterte ikke hendelser.
Figur 8: virvling forårsaker fremkomsten av ikke-EV-signaler Arrangement som vises er innenfor FSC / SCC EV port.. Verdier viser prosenter av positive hendelser. Stained EV prøvene ble lest før (venstre kolonne) og etter tilsetting av vaskemiddel (høyre kolonne). Ved hjelp av en vortex å blande prøver kan føre til EV-etterligning, diagonale populasjoner for å danne (øverste rad). Når blandes forsiktig opp og ned ved hjelp av en pipette, men dannelsen av disse bestandene kan unngås (nederste rad). Virvling er ikke anbefalt for miksing, da det kan føre aggregering i enkelte prøver, leading til Diagonal-vises, positive populasjoner. Generelt bør hendelse nummer innenfor en positiv port ikke øke etter lysering.
| Perle-basert gjenkjenning | Individuell Detection | |
| EV Størrelser | anbefales for <100 nm bare | anbefales for> 100 nm bare |
| Tid | krever over natten inkubasjon | kan fullføre i <1 dag |
| Følsomhet | klynge deteksjon | enkelt deteksjon partikkel |
| Resultater | kvalitativ | kvantitativ |
| Vasking | enkel, standard sentrifugering | krever sentrifugale filtre |
| Negative kontroll | BSA-belagte perler | lyserte prøver |
Tabell 1: Fordeler og ulemper med begge deteksjonsmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
To forskjellige protokoller for isolering, behandling og analyse av elbiler ble presentert, ved hjelp av enten en enkeltperson påvisning eller perle basert tilnærming. Velge den mest hensiktsmessige metoden å bruke er ikke alltid enkel og krever en forståelse av prøven blir testet samt de enkelte subpopulasjoner av interesse. Videre må følsomheten av cytometer som brukes for anskaffelse tas i betraktning ved valg av den mest hensiktsmessige metode. Ofte er det ingen enkelt beste protokoll som brukes, snarere en kombinasjon av metoder gir mer informasjon om en prøve enn én metode alene. Ideelt sett bør flere forskjellige isolerings- og deteksjonsteknikker evalueres først for å utvikle en skreddersydd protokoll som tar hensyn til individuelle cytometer ytelse med hensyn til den spesifikke EV populasjonen som blir studert. Alternative isolasjonsteknikker inkluderer ultracentrifugation, sukrosetetthets fraksjonering, immunomagnetisk bead separasjon, kromatografi og affinitetsrensing 12, mens alternative metoder inkluderer scanning elektronmikroskopi, transmisjonselektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi, dynamisk lysspredning, og western blotting 8. Ved å kombinere ulike teknikker, kan de metodene som presenteres her tilpasses for å skape protokoller best egnet for å studere ulike EV bestander av interesse.
Generelt, individuell påvisning av elbiler bruker FCM fungerer godt for å analysere større elbiler men mister følsomhet som elbiler blir mindre. Mens enkelte påvisning er mer konsekvent i å oppdage større elbiler, er perle-basert gjenkjenning mindre sensitiv i å oppdage større elbiler og mer følsom for exosomes. Større elbiler kan vaskes enkelt via post-flekken filtrering og oppdaget enkeltvis via FCM. Mindre EV og exosomes, på den annen side ikke blir detektert vel individuelt ved hjelp av FCM og er mye vanskeligere å vaske etter farging. Perlen-fangstprotokollen løser begge disse problemene, slik at elbiler skal være lett vaskes og flere elbiler som skal måles sammen for å skape større positive signaler påvisbare av FCM. Imidlertid er det ulemper forbundet med å bruke denne metoden, som beskrevet i tabell 1.
Når du arbeider med en mindre følsom cytometer, er kapasiteten for individuell gjenkjenning begrenset. Før EV analyse, bør følsomheten av cytometer bli bestemt ved anvendelse av en blanding av perlestørrelser 0,1 til 1,0 um. Svikt i cytometer for å detektere et flertall av partikler under 1,0 um ville nødvendiggjøre bruk av vulsten-basert protokoll. Sterkt uttrykt markørene er lett oppdages ved hjelp av enten protokollen. Sjeldnere bestander er ofte lettere å oppdage ved hjelp av enkelt partikkel deteksjon protokollen i stedet for perlefangst protokollen, men dette kan variere avhengig av slike variabler som: lysstyrken på fluorokrom, prøvens EV: perle rasjo, og størrelsen på EV som bærer sjeldne celleoverflatemarkør. Deteksjon av multiple markører på en enkelt partikkel nødvendiggjør bruk av den enkelte deteksjonsmetode. Vulsten basert metode er ikke i stand til individuelt EV deteksjon. Derfor vil vulsten-basert protokoll gi data som er mer kvalitative av natur, mens den enkelte deteksjonsmetode vil gi mer kvantitative data.
Ekstra isolasjonsteknikker må utnyttes når elbiler er nødvendig for nedstrøms applikasjoner. Elbiler som brukes i funksjonelle analyser bør ultrasentrifugert hjelp av tre-trinns differensialsentrifuge protokollen, siden de løselige serumproteiner i plasma kan påvirke funksjonelle eksperimentelle resultater. For karakterisering av el-biler har imidlertid ultrasentrifugering er ikke anbefalt, siden dette ekstra trinn kan påvirke EV kvalitet og kvantitet på grunn av de høye krefter som påføres på partiklene 12.
Den enkelte deteksjon protokollen inneholder several nøkkeltrinn som er optimalisert for high-throughput-testing, blant annet: 1) for gjennomføring av sentrifugalkreftene filtre for rask og effektiv fjerning av positive hendelser forårsaket av Ab aggregater, 2) bruken av filtre som en mer praktisk alternativ til ultrasentrifugering eller sukrose gradient fraksjone for vasking av ubundet Ab fra EV prøver post-flekker, og 3) utnyttelse av vaskemiddel lyse som en negativ kontroll, som ikke bare avslører positive hendelser forårsaket av ikke-elbiler, men gir en god tilnærming til bakgrunnsfluoresens å skille positive fra negative befolkningstall for tegning porter. Den enkelte deteksjons protokollen anbefales når et stort antall prøver må testing som den kan utføres på en enkelt dag, mens vulsten basert metode krever en inkubering over natten.
De negative kontroller i hver protokoll har ulike fordeler og ulemper avhengig av hvilken gjenkjenning metoden er brukt. En fordel med å bruke en kule-basertessay er at de samme monoklonale antistoffer kan anvendes for negative og positive rør, og den samme negativ kontroll kan brukes for alle prøver. Den enkelte deteksjonsmetode, på den annen side, krever separate kontroller som skal leses for hver prøve testet. Den negative kontroll som brukes av de enkelte deteksjons protokollen bruker lyserte prøver, som ikke krever bruk / forbruk av ytterligere antistoffer, men krever at hvert rør leses en gang etter tilsetningen av det lyserende midlet. De lyserte kontrollene har den ekstra fordelen av å være i stand til å identifisere andelen positive signal som kan tilskrives ikke-vesikkel relaterte hendelser som immunkomplekser 21. Den perle-baserte analysen har ikke denne evnen todistinguish mellom positive signaler som kommer fra sanne elbiler og de som oppstår fra ikke-blemmer.
Begrensninger av teknikken
Selv om det ikke er standardisert metode for isolering av elektriske biler, differensialsentrifugering er en mye brukt teknikk blant EV forskere. Differensialsentrifugeringsmetoden som er beskrevet her er basert på felles protokoller for isolering av PPP, som vanligvis krever en innledende sentrifugering mellom 1,200-1,500 x g i 10 til 20 minutter for å fjerne cellene, etterfulgt av en andre sentrifugering mellom 10,000-13,000 xg i 10-30 min å fjerne blodplater 35. Den protokoll som er beskrevet her anvender en sentrifugering ved 1500 xg i 10 minutter etterfulgt av en sentrifugering ved 13 000 xg i 10 min. Mens høyere krefter 25,000-100,000 xg er vanligvis nødvendig for å pellet elbiler, kan noen av de større elbiler fjernes med differensialsentrifuge protokollen vi har presentert.
Opp til 90% av elbiler oppdages av FCM er tapt med én time ultrasentrifugering ved 100.000 xg (data ikke vist). Lengre sentrifugeringstider bør vurderes, om enn forsiktig, da dette kan ha negativ innvirkning prøven sammensetning. Dersom ytterligere behandling er nødvendig feller karakteriseringsstudier, kan filtreringen utføres etter to-trinns sentrifugering (før farging) for ytterligere å fraksjonere prøver basert på partikkelstørrelse. I likhet med ultrasentrifugering, filtrering, kan resultere i et tap på opptil 50% av positive markerings hendelser, og opp til 90% av de totale partikler detektert av FCM (data ikke vist). Mens økningen i signal-til-støyforhold er av åpenbar fordel, tap av mindre EV representerer en betydelig begrensning når man vurderer noen vasking eller isolasjonsmetode.
Til slutt, den antikoagulerende brukes (f.eks heparin, ACD, ethylendiamintetraeddiksyre (EDTA), etc.) under fyllingen kan ha innvirkning på kvaliteten og kvantiteten av EV-innhold. Mens ACD har vist seg å være en god og pålitelig antikoagulant for våre studier, er testing av flere løsninger som anbefales for å sikre at de mest egnede antikoagulasjonsmiddel for anvendelse velges. Dette er spesielt viktig når elbiler vil bli brukt i nedstrøms analyserhvor antikoagulant som anvendes kan påvirke utfallet. For eksempel har noen antikoagulerende midler (for eksempel EDTA og heparin) er kjent for å interferere med PCR-reaksjoner, mens andre (for eksempel teofyllin, adenosin og dipyridamol), har blitt vist å hemme EV frigjøring fra blodplater 12.
Metoder for EV analyse, mens betydelig forbedret de siste ti årene, er fortsatt et arbeid som pågår. Til syvende og sist, de beste metodene for å analysere elbiler vil avhenge av forskningen som foregår og verktøy tilgjengelig for forskeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dale Hirschkorn fra Blood Systems Research Institute for hans hjelp med strømningscytometer instrumentinnstillinger. Dette arbeidet ble støttet av NIH tilskudd HL095470 og U01 HL072268 og DoD kontrakter W81XWH-10-1-0023 og W81XWH-2-0028.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSR II benchtop flow cytometer | BD Biosciences | 3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red) | |
| FACS Diva software | BD Biosciences | PC version 6.0 | |
| FlowJo software | Treestar US | Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5 | |
| Sphero Rainbow fluorescent particles | BD Biosciences | 556298 | used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency |
| Ultra Rainbow fluorescent particles | Spherotech | URFP-10-5 | used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch |
| Megmix-Plus SSC beads | Biocytex | 7803 | used to adjust FSC and SSC voltages to maintain consistency between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs |
| AbC Anti-Mouse Bead Kit | Life Technologies | A-10344 | used for compensation controls & negative AbC beads used for beads-based method |
| Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9) | Santa Cruz | sc-281108 | used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month. |
| BD TruCOUNT Tubes | BD Biosciences | 340334 | used whenver absolute EV concentrations are needed |
| Ultrafree-MC, GV 0.22 µm Centrifugal Filter Units | Millipore | UFC30GVNB | used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size |
| Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A | BD Biosciences | 364606 | |
| Facs tubes 12x75 polystrene | BD Biosciences | 352058 | |
| 50 ml Reservoirs individually wrapped | Phenix | RR-50-1s | |
| Green-Pak pipet tips - 10 µl | Rainin | GP-L10S | |
| Green-Pak pipet tips -200 µl | Rainin | GP-L250S | |
| Green -Pak pipet tips - 1,000 µl | Rainin | GP-L1000S | |
| Stable Stack L300 tips presterilized | Rainin | SS-L300S | |
| Pipet-Lite XLS 8 Channel LTS Adjustable Spacer | Rainin | LA8-300XLS | |
| 96 well tissue culture plates | E&K Scientific | EK-20180 | |
| RPMI 1640 Media (without Hepes) | UCSF Cell Culture Facility | CCFAE001 | media used for bead-based detection method |
| Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 µm filtered | UCSF Cell Culture Facility | CCFAL003 | |
| Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear | BECKMAN COULTER INC | 344058 | |
| PANEL I | |||
| CD3 PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 344808 | 2 µl |
| CD14 APC-Cy7 | Biolegend | 301820 | 2 µl |
| CD16 V450 | BD Biosciences | 560474 | 2 µl |
| CD28 FITC | biolegend | 302906 | 2 µl |
| CD152 APC | BD Biosciences | 555855 | 2 µl |
| CD19 A700 | Biolegend | 302226 | 2 µl |
| PANEL II | |||
| CD41a PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 340930 | 2 µl |
| CD62L APC | Biolegend | 304810 | 2 µl |
| CD108 PE | BD Biosciences | 552830 | 2 µl |
| CD235a FITC | biolegend | 349104 | 2 µl |
| PANEL III | |||
| CD11b PE-Cy7 | Biolegend | 301322 | 2 µl |
| CD62p APC | Biolegend | 304910 | 2 µl |
| CD66b PE | Biolegend | 305106 | 2 µl |
| CD15 FITC | exalpha | X1496M | 5 µl |
| CD9 PE | Biolegend | 555372 | |
| CD63 APC | Biolegend | 353008 | |
| APC-Cy7 Ms IgG2a, κ | Biolegend | 400230 |
References
- Andaloussi, S., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).
- Mause, S. F., Weber, C. Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange. Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).
- Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -M. Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
- Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis. Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).
- Gatti, S., Bruno, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. Circulating microparticles: square the circle. BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).
- Van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles. Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).
- Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -F., López, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing. Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).
- Lacroix, R., Judicone, C., et al. Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).
- Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogné, J. -M. Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).
- Peramo, P., et al. Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters. Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).
- Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients. Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).
- Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome. Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).
- Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Miguet, L., Béchade, G., et al. Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).
- Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles. Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).
- Mobarrez, F., Antovic, J., et al. A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles. Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).
- Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).
- György, B., Szabó, T. G., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).
- György, B., Módos, K., et al. Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters. Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).
- György, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling. Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).
- Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it. Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).
- Shet, A. S., Aras, O., et al. Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes. Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Nolte-’t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Van der Vlist, E. J., Nolte-’t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Orozco, A. F., Lewis, D. E. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma. Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).
