셀 특정 부분 집단에서 RNA 분리 빠른 Immunolabeling과 결합 레이저 캡처 이외에 Microdissection을 사용하여
Summary
특정 조직에서 세포의 서브 세트의 유전자 발현 분석가 중대한 과제이다. 이 문서에서는 레이저 캡처 미세 절제와 빠른 immunolabeling 방법을 결합하여 특정 세포 집단에서 고품질의 총 RNA를 분리하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
레이저 캡처 미세 절제 (LCM)는 높은 공간 해상도를 가진 얇은 조직 섹션에서 특정 세포의 분리를 할 수 있습니다. 효과적인 LCM은 이종 조직에서 세포 개체군의 정확한 식별이 필요합니다. LCM에 대한 관심의 세포의 식별은 일반적으로 형태 학적 기준에 형광 단백질 기자 기반으로합니다. LCM 신속한 immunolabeling의 조합은 대안적이고 효율적인 수단은 특정 유형의 세포를 시각화 및 주변 조직에서 그들을 분리를 제공한다. 고품질 RNA는 순수한 세포 집단에서 압축하고 상기 RNA 시퀀싱, 마이크로 어레이 또는 QRT-PCR를 포함한 다운 스트림 애플리케이션을 위해 처리 할 수있다. 이러한 접근법은 이전에 수행 짧게 몇 공보에 기재되어있다. 이 글의 목표는 LCM을 사용하여이 특정 세포를 분리하는 RNA의 무결성을 유지하면서 세포 인구의 급속한 immunolabeling을 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 여기서, 우리는 설명D immunolabeling 하나 일된 마우스로부터 뇌 조직에서 도파민 성 세포를 포착함으로써 이러한 다단계 절차. 우리는 특별한 배려를받을 자격이 키 중요한 단계를 강조 표시합니다. 이 프로토콜은 관심 조직 및 세포의 종류에 적용될 수있다. 다양한 분야의 연구자 가능성이 방법의 데모에서 도움이 될 것입니다.
Introduction
뇌는 복잡한 네트워크를 형성하는 다른 신경 세포 유형의 많은 종류로 구성되어있다. 이 신경 세포는 형태, 연결 및 유전자 발현 패턴 (1)에 따라 별개의 그룹과 하위 그룹으로 구성됩니다. 마이크로 어레이를 개발, 차세대 시퀀싱 및 QRT-PCR은 상이한 생물학적 상황에서 1,2- 뉴런 집단의 유전자 발현 프로필을 비교할 수있는 가능성을 제공 하였다. 이러한 민감한 분석 RNA 무결성 2-4을 유지하면서 관심의 세포 유형의 정확한 식별 및 격리가 필요합니다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 기술이 널리 세포 표면 마커 및 / 또는 형태에 따라 특정 유형의 세포를 분리하는데 사용되어왔다. FACS는 공간 해상도 (5)의 전체 손실이 발생하기 전에 정렬에 세포 해리 단계가 필요합니다. 대부분의 신경 세포 개체군은 번째의 해부학 적 분포에 따라 서로 구별된다전자 두뇌입니다. 얇은 뇌 부분에 적용되는 레이저 캡처 미세 절제는 높은 공간 해상도 6-8와 세포의 특정 격리를위한 적절한 옵션을 제공합니다. LCM의 주요 제한은 형태 학적 기준에 유전자 또는 동물 모델에서 설계 형광성 단백질 리포터에 기초하여 관심있는 세포를 식별 할 필요가있다. LCM과 조합하여, RNA의 무결성을 보존 immunolabeling 빠른 방법을 수행하기위한 새로운 기술들의 개발은 현재 유전자 프로파일 실험을 진행하는 세포의 아 집단을 분리한다.
이러한 접근법은 이전에 수행 짧게 몇 1,9-13 공보에 기재되어있다. 여기서, 우리는 빠른 immunolabeling LCM과 조합함으로써 복합 조직 구조체에서 세포의 특정 서브 세트로부터 고품질의 RNA를 얻기 상세한 절차를 보여준다. 우리는 최대 RNA 회복을 얻기 위해 키 중요한 단계를 수행하고 있으므로 시그마 RNA의 분해를 방지하는 방법을 보여심하게 저 충격 유전자 발현 프로파일 링.
이 프로토콜의 데모를 들어, 하나의 일 된 마우스 중뇌의 도파민 신경 세포의 타겟이되었다. 도파민 뉴런은 티로신 수산화 효소 (TH)에 대해 유도 된 항체, 도파민 합성에 대한 속도 제한 효소를 사용 immunolabeled 수있다. TH 면역 염색 후, 개별 또는 도파민 신경 세포 집단은 LCM을 사용하여 단리 할 수있다. Microdissected 세포 용해 완충액에 수집되고, RNA는 RNA 분리 키트를 사용하여 추출한다. 품질과 추출 된 RNA의 양이 bioanalyzer (5)를 사용하여 측정한다. 사용하여 유전자 발현의 추가의 분석 : RNA 시퀀싱, 마이크로 어레이 또는 QRT-PCR이어서 2,4,6을 행할 수있다. 예로서, 두 단계 QRT-PCR은 레이저 캡처 절연 도파민 도메인에서 설명된다. 두 도파민 성 신경 세포 마커 유전자의 발현 량의 상대적 정량이 프로토콜의 선택도를 나타낸다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법의 가장 중요한 점은 RNA 저하를 방지하면서 관심의 세포를 라벨로 구성되어 있습니다. RNAses는 수용액에서 활약하는 바와 같이, 배양 시간을 감소하는 RNA 절약 11, 15을 향상시킨다. 사용되는 모든 솔루션은 RNAses을 비활성화 할 DEPC로 처리해야합니다. 모든 재료 및 표면 RNAses 오염을 방지하기 위해 표면의 RNAse 염액으로 처리 될 필요가있다. 마지막으로, 이러한 조건에서 모든 솔루션?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
| Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
| Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
| Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
| RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
| RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
| Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
| H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
| Ethanol absolute | |||
| Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
| DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
| Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
| Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
| Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
| Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
| Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |
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