Genexpressie analyse van een subset van cellen in een specifiek weefsel vormt een grote uitdaging. In dit artikel wordt beschreven hoe u een hoge kwaliteit totaal RNA van een specifieke cel populatie te isoleren door het combineren van een snelle immunolabeling methode met lasermicrodissectie.
Lasermicrodissectie (LCM) kan de isolatie van specifieke cellen uit dunne coupes met een hoge ruimtelijke resolutie. Effectieve LCM vereist een nauwkeurige identificatie van cellen subpopulaties uit een heterogene weefsel. Identificatie van cellen van belang voor LCM is gewoonlijk gebaseerd op morfologische criteria of fluorescerend eiwit reporters. De combinatie van LCM en snelle immunokleuring biedt een alternatieve en efficiënte manier om specifieke celtypen te visualiseren en te isoleren van de omringende weefsels. Hoogwaardige RNA kan vervolgens worden geëxtraheerd uit een zuivere celpopulatie en verder verwerkt voor stroomafwaartse toepassingen, waaronder RNA-sequencing, microarray of qRT-PCR. Deze benadering is eerder uitgevoerd en kort beschreven in enkele publicaties. Het doel van dit artikel is om te illustreren hoe snel immunolabeling van een cel populatie uit te voeren terwijl het houden van RNA integriteit, en hoe deze specifieke cellen met behulp van LCM isoleren. Hierin, we illustrerend deze multi-step procedure immunokleuring en vastleggen van dopaminerge cellen in hersenweefsel van één dag oude muizen. We belichten de belangrijkste kritische stappen die speciale aandacht verdienen. Dit protocol kan worden aangepast aan een verscheidenheid van weefsels en cellen van belang. Onderzoekers uit verschillende disciplines zullen waarschijnlijk profiteren van de demonstratie van deze aanpak.
De hersenen bestaan uit een grote verscheidenheid van verschillende typen neuronen vormen complexe netwerken. Deze neuronen zijn georganiseerd in verschillende groepen en subgroepen aan hun morfologie, connectiviteit en genexpressie patroon 1. De ontwikkeling van microarrays, next-generation sequencing, en qRT-PCR de mogelijkheid geboden om de genexpressie profielen van neuronale populatie te vergelijken in verschillende biologische contexten 1,2. Deze gevoelige analyses vereisen de precieze identificatie en isolatie van celtypen van belang terwijl RNA integriteit 2-4. Fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) techniek wordt veel gebruikt om specifieke celtypen basis van celoppervlak markers en / of morfologie isoleren. FACS is een cel dissociatie stap voor het sorteren, hetgeen resulteert in een volledig verlies van ruimtelijke resolutie 5. Vele neuronale subpopulaties van elkaar onderscheiden volgens hun anatomische verdeling the hersenen. Lasermicrodissectie toegepast op dunne hersensecties biedt een geschikte optie voor specifieke isolatie van cellen met een hoge ruimtelijke resolutie 6-8. Een belangrijke beperking van LCM is de noodzaak cellen van belang op basis van morfologische criteria of fluorescent proteïne reporters genetisch in diermodellen identificeren. De ontwikkeling van nieuwe technieken om snel immunokleuring methoden RNA integriteit behouden, in combinatie met LCM voeren, laat nu de isolatie van cel subpopulaties te gaan met gen-profiling experimenten.
Deze aanpak is al eerder uitgevoerd en kort beschreven in enkele publicaties 1,9-13. Hier tonen we een gedetailleerde procedure hoogwaardige RNA te verkrijgen van een specifieke subset van cellen in een complex weefselstructuur door het combineren snel immunokleuring met LCM. We laten zien hoe u de belangrijkste kritische stappen uit te voeren om maximale RNA herstel te verkrijgen en te voorkomen dat RNA degradatie als het kan sigdend effect genexpressie profilering.
Voor de demonstratie van dit protocol, werden dopaminerge neuronen van de ene dag oud muis middenhersenen gericht. Dopaminerge neuronen kunnen immunologisch met een antilichaam gericht tegen tyrosine hydroxylase (TH), de snelheidsbeperkende enzym dopamine synthese. Volgende TH immunostaining, individuele of groepen van dopaminerge neuronen kan vervolgens geïsoleerd worden met behulp van LCM. Gemicrodisseceerde cellen worden verzameld in de lysis buffer en RNA geëxtraheerd met behulp van een RNA isolatie kit. Kwaliteit en kwantiteit van geëxtraheerde RNA worden gemeten met behulp van een bioanalyzer 5. Verdere analyse van genexpressie gebruikmaking RNA sequencing, microarray of qRT-PCR kan vervolgens worden uitgevoerd 2,4,6. Als voorbeeld wordt een tweestaps qRT-PCR aangetoond op laser gevangen geïsoleerd dopaminerge domeinen. Relatieve kwantificatie van de expressie van twee dopaminerge neuronen marker genen illustreert de selectiviteit van dit protocol.
De meest kritische punt van deze methode bestaat uit het labelen van cellen plaats en voorkomt RNA degradatie. Zoals RNAses zijn actief in waterige oplossingen, de vermindering incubatietijd verbetert RNA behoud 11,15. Alle gebruikte oplossingen moeten met DEPC tot RNAses inactiveren. Alle materialen en oppervlakken moeten worden behandeld met een oppervlakte RNAse decontaminatie oplossing RNAses verontreiniging te voorkomen. Tenslotte, in deze omstandigheden, de toevoeging van RNAse inhibitor in alle oplossi…
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
Ethanol absolute | |||
Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |