Genuttryck analys av en delmängd av celler i en specifik vävnad utgör en stor utmaning. I artikeln beskrivs hur du isolera högkvalitativa total-RNA från en specifik cellpopulation genom att kombinera en snabb immunomärkning metod med laser capture microdissection.
Laser capture microdissection (LCM) möjliggör isolering av specifika celler från tunna sektioner vävnad med hög rumslig upplösning. Effektiv LCM kräver exakt identifiering av celler subpopulationer från en heterogen vävnad. Identifiering av celler av intresse för LCM är vanligtvis baserad på morfologiska kriterier eller fluorescerande protein reportrar. Kombinationen av LCM och snabb immunomärkning erbjuder ett alternativt och effektivt sätt att visualisera specifika celltyper och att isolera dem från omgivande vävnad. Högkvalitativ RNA kan sedan extraheras från en ren cellpopulation och bearbetas vidare för tillämpningar efter, inklusive RNA-sekvensering, microarray eller QRT-PCR. Detta synsätt har tidigare utförts och kortfattat beskrivet i några publikationer. Målet med denna artikel är att belysa hur man utför en snabb immunomärkning av en cellpopulation samtidigt RNA integritet, och hur man kan isolera dessa specifika celler med hjälp LCM. Häri vi illustrerad detta förfarande i flera steg genom immunomärkning och fånga dopaminerga celler i hjärnvävnad från en dag gamla möss. Vi belysa viktiga kritiska steg som förtjänar särskild uppmärksamhet. Detta protokoll kan anpassas till en variation av vävnader och celler av intresse. Forskare från olika områden kommer sannolikt gynnas av demonstration av denna strategi.
Hjärnan består av ett stort utbud av olika neuron typer bildar komplexa nätverk. Dessa nervceller är organiserade i olika grupper och undergrupper enligt deras morfologi, uppkoppling och genuttryck mönster 1. Utvecklingen av mikroarrayer, nästa generations sekvensering, och QRT-PCR erbjöd möjligheten att jämföra genuttrycksprofilerna av neuronala populationer i olika biologiska sammanhang 1,2. Dessa känsliga analyser kräver exakt identifiering och isolering av celltyper av intresse samtidigt hålla RNA integritet 2-4. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) teknik har använts i stor omfattning för att isolera specifika celltyper baserade på markörer och / eller morfologi på cellytan. FACS kräver en cell dissociation steg före sortering, vilket resulterar i en fullständig förlust av rumslig upplösning 5. Många neuronala subpopulationer särskiljs från varandra enligt deras anatomiska distribution i the hjärnan. Laser capture microdissection appliceras på tunna hjärnsektioner ger ett lämpligt alternativ för specifik isolering av celler med hög rumslig upplösning 6-8. En viktig begränsning av LCM har varit behovet att identifiera celler av intresse baserade på morfologiska kriterier eller fluorescerande protein reportrar genmanipulerade i djurmodeller. Utvecklingen av nya tekniker för att utföra snabba immunomärkning metoder som bevarade RNA integritet, i kombination med LCM, gör det nu möjligt isolering av cellpopulationer att gå vidare med gen-profileringsexperiment.
Detta synsätt har tidigare utförts och beskrivs kortfattat i några publikationer 1,9-13. Här visar vi ett detaljerat förfarande för att få hög kvalitet RNA från en särskild undergrupp av celler i en komplex vävnadsstruktur genom att kombinera snabb immunomärkning med LCM. Vi visar hur du utför viktiga kritiska åtgärder för att få maximal RNA återhämtning och undvika RNA nedbrytning eftersom det kan SIGligt slag genuttryck profilering.
För demonstration av detta protokoll, var dopaminerga neuroner från en-dag-gamla mus mitthjärnan riktade. Dopaminerga neuroner kan immunolabeled användning av en antikropp riktad mot tyrosinhydroxylas (TH), det hastighetsbegränsande enzymet för dopaminsyntes. Efter TH immunfärgning, enskilda eller grupper av dopaminerga nervceller kan sedan isoleras med hjälp av LCM. Microdissected Cellerna uppsamlas i lysbuffert, och RNA extraheras med användning av ett RNA-isoleringskit. Kvalitet och kvantitet av extraherat RNA mäts med hjälp av en bioanalyzer 5. Ytterligare analys av genuttryck använder: RNA-sekvensering, microarray, eller QRT-PCR kan därefter utföras 2,4,6. Som ett exempel, är en två-stegs QRT-PCR demonstrerade på laser fångade isolerade dopaminerga domäner. Relativ kvantifiering av expressionsnivåer av två dopaminerga neuron markörgener illustrerar selektivitet detta protokoll.
Den mest kritiska punkten av denna metod består i att märka celler av intresse samtidigt förhindra RNA nedbrytning. Som RNAs är aktiva i vattenlösningar, minskar inkubationstider förbättrar RNA bevarande 11,15. Alla lösningar som används måste behandlas med DEPC att inaktivera RNAs. Alla material och ytor måste behandlas med en yta RNAs dekontamineringslösning att förhindra RNAs kontamination. Slutligen, under dessa förhållanden, är tillsatsen av RNAs-inhibitor i alla lösningar effektiva i at…
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC: 418391-2012). AC receives a scholarship from the Centre thématique de recherche en Neurosciences (CTRN). HDB is funded by a scholarship from the Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) and ML is a FRSQ Chercheur-Boursier.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Membrane coated slides | Leica Biosystems | 11505158 | MembraneSlides PEN-Membrane 2,0 µm; 50 pcs |
Surface RNAse decontamination solution | Life technologies | AM9780 | RNaseZap |
Fixative | 70% Ethanol kept at -20 °C | ||
Anti-TH | Pel-Freez | P40101 | 1:25 |
RNAse free buffer | DEPC PBS + 1% BSA+0.02% triton | ||
RNAse inhibitor | Promega | N2615 | Rnasine Plus Rnase Inhibitor 40 kU/ml (stock) |
Anti-rabbit biotinylated | Vector Laboratories | BA-1000 | |
Vectastain Elite ABC kit Standard | Vector Laboratories | PK-6100 | 8µl/ml |
DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
RNA isolation kit | Life technologies | KIT0204 | Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit |
H2O2 30% | Sigma | HC4060 | |
Ethanol absolute | |||
Laser microdissection system | Leica microsystems | Model AS-LMD | |
DEPC | Alfa Aesar | B22753-14 | |
Bioanalyzer | Agilent | Agilent 2100 Bioanalyzer | |
Embedding mold | Leica Biosystems | 14702218311 | 6x8mm |
Hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Frozen tissue embedding media | Tissue-Tek | 4583 | |
Bioanalyzer chip | Aligent Technologies | 5067-1513 | RNA 6000 Pico LabChip used with Agilent 2100 Bioanalyzer |
Hot start reaction mix for quantitative PCR | Roche | 6402712001 | Fast Start Essential DNA Green Master |
Reverse transcriptase | Life technologies | 11752-050 | SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR |