Abstract
Adult neurogenesis er en stærkt reguleret, multi-trins proces, hvor nye neuroner er genereret ud fra en aktiveret neural stamcelle via stigende engagerede mellemliggende progenitor undertyper. Hver af disse undertyper udtrykker et sæt specifikke molekylære markører, der sammen med specifikke morfologiske kriterier, der kan bruges til at identificere dem. Typisk er immunfluorescerende teknikker anvendes involverer undertype-specifikke antistoffer i kombination med exo- eller endogene proliferationsmarkører. Heri beskrives immunolabeling metoder til påvisning og kvantificering af alle stadier af voksne hippocampus neurogenese. Disse omfatter anvendelsen af thymidinanaloger, transcardial perfusion, væv forarbejdning, varme epitopgenfinding, ABC immunhistokemi, flere indirekte immunofluorescens, konfokal mikroskopi og celle kvantificering. Derudover præsenterer vi en sekventiel behandling af flere immunfluorescens protokol, som omgår problemer usually følge af behovet for at anvende primære antistoffer rejst i den samme vært art. Det giver mulighed for en nøjagtig identifikation af alle hippocampus progenitor undertyper sammen med en spredning markør i en enkelt sektion. Disse teknikker er et kraftfuldt værktøj til at studere reguleringen af forskellige progenitor undertyper parallelt, deres deltagelse i hjernen patologier og deres rolle i bestemte hjernefunktioner.
Introduction
To hjerneområder konstitutivt generere nye neuroner i hele livet, den subventrikulære zone af de laterale ventrikler og subgranular zone (SGZ) i hippocampus tandede gyrus (DG). Den nyfødte neuroner stammer fra neurale stamceller og gå gennem forskellige stadier af morfologiske og fysiologiske udvikling, før de når modenhed 1,2. Fra et langsomt dividere radial glia-lignende stamceller (type 1) på hinanden følgende faser af transit uddybning opstår mellemliggende stamceller. De mere udifferentierede undertyper (type 2a og type 2b) har en uregelmæssig form med korte, tangentielle processer. De genererer neuroblasts (type 3), som gradvist forlader cellecyklussen for at blive umodne neuroner (med dendritter forlænget mod molekylære lag) og endelig integreret i hippocampus netværk modne granulceller. På grund af deres særlige fysiologiske karakteristika disse celler giver kredsløbet med forbedrede plasticitet 3 suggesTing en enestående rolle i hippocampus funktion. Faktisk undersøgelser af det sidste årti medført betydelig dokumentation for, at voksne neurogenese bidrager til rumlig hukommelse, mønster separation og følelsesmæssig adfærd 4,5.
Adult neurogenesis kan studeres ved hjælp af forskellige metoder. Thymidinanaloger inkorporere i DNA under S-fase af cellecyklussen og tillade fødslen dating, kvantificering og skæbne analyse af nyfødte celler 6-8. Sekventiel anvendes forskellige thymidinanaloger (f.eks CldU, edu eller IDU) kan bruges til at studere celle omsætning eller cellepopulationer født på forskellige tidspunkter i løbet af et eksperiment 9. En alternativ endogen markør for celleproliferation er Ki67. Det udtrykkes i delende celler i alle faser af cellecyklussen (G1, S, G2, M) bortset hvilefase (G0) og begyndelsen af G1 10,11. For at analysere fænotypen af nyfødte cellepopulationer i den voksne dentate gyrus flere fase-specifikke molekylære markører kan anvendes, såsom GFAP, nestin, DCX og NeuN 1,6. GFAP er en markør af modne astrocytter men kommer også til udtryk i radiale glia-lignende celler i den voksne forhjerne. Nestin er et mellemprodukt filament specifikt for radiale glia-lignende celler og tidlige mellemliggende progenitorceller. DCX er en mikrotubulus-associeret protein udtrykt i mellemliggende stamfædre, neuroblaster og umodne neuroner. Baseret på den (med) ekspression af disse tre markører og morfologiske træk ved de mærkede celler kan identificeres fire forskellige stamceller undertyper: type 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), type 2 a (GFAP -, nestin + , DCX -), type 2 b (GFAP -, nestin +, DCX +) og type 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-mærkning af DCX sammen med NeuN, som udtrykkes i postmitotiske neuroner, tillader differentiering af immature (DCX +, NeuN +) og modne (DCX -, NeuN +) granula neuroner.
De ovennævnte markører anvendes ofte til immunofluorescent co-mærkning og efterfølgende konfokal mikroskopi til at analysere antallet og identiteten af nyfødte celler. Dette kræver typisk antistoffer fra forskellige værtsarter for at forhindre uønsket antistof krydsreaktivitet. Men størstedelen af primære antistoffer er egnede til neurogenese forskning rejses i kaniner eller mus (fx mus α-BrdU, mus α-NeuN, kanin α-Ki67, kanin α-GFAP). Dette fører til alvorlige begrænsninger i antallet og kombinationen af antigener, der kan vurderes på en enkelt skive. Dette vil til gengæld ikke kun øger farvning indsats, som flere farvninger skal udføres, men kan også påvirke resultaternes pålidelighed. Desuden er nogle antigener er modtagelige for formalinfiksering-induceret epitop maskering (f.eks Ki67, Nestin). Vi beskriver heri modifikationer fra de klassiske enkelt- og multiple immunmærkning protokoller (f.eks epitopgenfinding, flere sekventiel immunfarvning, brug af nestin-GFP transgene mus 12), overvinde mange af disse problemer. Især sekventiel multipel immunofluorescens protokol tillader farvning mod op til fire forskellige antigener selv om en del af antistofferne er afledt fra den samme vært. Dette muliggør samtidig påvisning af type 1, type 2a, type 2b og type 3 progenitorceller, samt deres proliferative aktivitet inden for et enkelt afsnit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer, der involverer levende dyr blev udført i overensstemmelse med EF-direktiv 86/609 / EØF retningslinjer for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og godkendt af den lokale etiske komité (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).
1. intraperitoneal injektion af thymidinanaloger
- Dyr vejes dagen før injektion. Beregn mængden af thymidin-analog kræves for alle injektioner planlagt den næste dag samt individuelle injektionsvolumener på en 10 mg / ml stamopløsning vægtjusterede.
- Forbered 10 mg / ml thymidin stamopløsning. (ADVARSEL! Thymidinanaloger er giftige. Følg de specifikke sikkerhedsdatablade (MSDS), som leverandørerne, dvs. slid laboratoriekittel og handsker, bruge et stinkskab).
- Tag thymidin-analog fra fryseren og bringe det til RT ca. 21 ° C. Afvejes 10 mg og tilføjsterilt saltvand (for BrdU og CldU) eller 0,04 N NaOH (i sterilt saltvand, for stiknarkomaner), vortex. Sted efter mindst 10 - 15 min i et 50 ° C vandbad og vortex hver 2-3 min for at opløse pulveret.
BEMÆRK: Brug løsninger for op til 24 timer ved opbevaring ved stuetemperatur og i flere uger ved -20 ° C. Beskyt løsninger fra lys (cover med aluminiumsfolie). Kontroller altid for bundfald og igen opløses, hvis det er nødvendigt.
- Tag thymidin-analog fra fryseren og bringe det til RT ca. 21 ° C. Afvejes 10 mg og tilføjsterilt saltvand (for BrdU og CldU) eller 0,04 N NaOH (i sterilt saltvand, for stiknarkomaner), vortex. Sted efter mindst 10 - 15 min i et 50 ° C vandbad og vortex hver 2-3 min for at opløse pulveret.
- Begrænse musen ved harmoniske og intraperitonealt indsprøjte en passende, vægt-justeret volumen stamopløsning (ved stuetemperatur) med en fin dosering sprøjte med en 30 G nål.
BEMÆRK: I tilfælde CldU og IDU skal indgives sekventielt i samme dyr, overveje at injicere ækvimolære koncentrationer (f.eks 42,5 mg / kg CldU og 57,5 mg / kg IDU, som svarer til 50 mg / kg BrdU). Derfor justere volumen injektion af 10 mg / ml stamopløsninger i overensstemmelse hermed.
2. Vævspræparat
- Prepare 4% formaldehyd i 0,1 M phosphatbuffer pH 7,4 dagen før perfusion. Opbevares ved 4 ° C.
- Transkardialt perfundere dybt bedøvede mus (3,5% isofluran) via den venstre ventrikel med 10 ml iskold PBS, derefter med 40 ml iskold formaldehyd (strømningshastighed 5 ml / min). Skær hjernen og post-fix i samme fikseringsmiddel i 24 timer ved 4 ° C.
- Overfør hjerner hinanden i 10% (24 timer ved 4 ° C) og 30% saccharose (indtil hjernen dræn ca. 48 timer). Til frysning, langsomt nedsænkes kryobeskyttet hjerner i -25 ° C isopentan indtil ingen bobler frem fra vævet. Opbevares ved -80 ° C.
- Skær koronale sektioner af 40 pm tykkelse på en indefrysning mikrotom (blok temperatur på -25 til -16 ° C). Sekventielt overleveringsstrækningerne i frostvæske opløsning indeholdende brønde i en 24-brønds celledyrkningsplade (se figur 1). Opbevares ved -20 ° C.
Figur 1. Skematisk illustration af at overføre mikrotomknive skiver i en plade med 24 brønde Start. På A1 og placere efterfølgende skiver i række A, efter A6 gå til den næste række B og så videre. Når nåede D6, gå tilbage til A1 og fortsætte. Dette arrangement af skiver muliggør kvantificering af hvert n'te afsnit af en hel hjerne. For kvantificering af nyfødte celler tager hver 6. hjerne sektion (svarende til indholdet af en kolonne), for immunfluorescens fænotypebestemmelse tager hver 12. sektion (svarende til indholdet af 2 alternerende rækker af en kolonne).
3. Immunfarvning
BEMÆRK: Sektioner behandles fritflydende, sædvanligvis i 6-brønds plader forsynet med en bæreplade og mesh skær. Som en undtagelse, blokering, antistofinkubationer og ABC reaktion er færdig i 12- eller 24-brønds plader uden mesh indsatse (0,5 til 1 ml pr well er tilstrækkeligt, afhængigt af antallet af skiver, der skal farves). Under disse trin, overfører sektioner ved hjælp af en fin pensel (skyl med hver ny løsning). Alle inkubationer er udført med kontinuerlig omrøring (max 150 rpm).
- Immunhistokemi (ABC-metode)
- Overfør sektioner fra frostvæske i TBS og skylles grundigt (når O / N ved 4 ° C, 5 gange ved stuetemperatur i 10 minutter hver) for helt at fjerne frostvæske.
- Inkuber i 30 minutter i 1,5% H 2 O 2 i TBS-T for at standse endogen peroxidaseaktivitet. Vær opmærksom på boblende og igen dykke sektioner om nødvendigt. Skyl 3 gange i TBS i 15 minutter hver.
- Valgfrit: mellemtiden forvarme varmeskab og 2 N HCI til 37 ° C. Inkuber sektioner i 30 minutter ved 37 ° C i 2 N HCI for at denaturere DNA. Blidt separate sektioner ved hjælp af en pensel.
- Valgfrit: neutraliseres sektioner i 10 minutter i 0,1 M boratpuffer pH8,5, RT. Mens overføre kortvarigt aftør Mesh indeholder afsnittene om en køkkenrulle til at fjerne HCl efterladenskaber. Skyl 2 gange i TBS i 15 minutter hver.
- Inkuber i TBSplus at permeabilisere væv og til at blokere uspecifikke antistof-bindingssteder, 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber i primært antistof fortyndet i TBSplus, O / N ved 4 ° C. Skyl 3 gange i TBS i 15 minutter hver.
- Inkuber i biotinyleret sekundært antistof fortyndet i TBSplus, 3 timer ved stuetemperatur. Skyl 3 gange i TBS i 15 minutter hver. I mellemtiden ...
- Forbered ABC kompleks ifølge producentens protokol (1% A + 1% B i TBS-T). Lad det stå i 30 minutter ved stuetemperatur inden brug. Inkuber sektioner i AB reagens i 1 time ved stuetemperatur. Skyl 3 gange i TBS i 15 minutter hver.
- Forbered 50 ml 0,5 mg / ml DAB i TBS-T pr 6- eller 12-brønds plade, der er opdelt i to halvdele og pipette 4 ml eller 2 ml per brønd hhv. Overfør afdelinger, DAB-opløsning (ADVARSEL! DAB er giftig. Følg den specic MSDS leveres af leverandøren, dvs. slid laboratoriekittel og handsker, bruge et stinkskab).
- Tilsæt 0,5 ml 1% H 2 O 2 til de resterende 25 ml DAB opløsning, bland og pipette ækvivalente mængder som ovenfor til hver brønd for at starte peroxidase reaktion. Inkuber i 12 min. Skyl 3 gange i TBS i 15 minutter hver.
- Mount sektioner til dias i gelatine, lufttørre O / N. Dækglasset med permanent montering medium.
- Valgfrit: kontrastfarve før placere dækglasset (se afsnit 3.5).
BEMÆRK: Hvis signal-til-støj-forhold er lavt på grund af høj baggrund, gentag H 2 O 2 behandling efter inkubation med AB reagens (trin 3.1.8).
- Multiple-immunfluorescens
- Single eller samtidig flere immunofluorescens
- Overfør sektioner fra frostvæske i TBS og skylles grundigt (når O / N ved 4 ° C, 5 gange ved stuetemperatur i 10 min hver) til helt at fjerne entifreeze.
- Valgfrit: som trin 3.1.3 - 3.1.4.
- Inkuber i TBSplus at permeabilisere væv og blokere uspecifikke antistof-bindingssteder, 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber i primært antistof cocktail (f.eks rotte α-BrdU, marsvin α-DCX, ged α-GFP) fortyndet i TBSplus, O / N ved 4 ° C. Skyl 3 gange i TBS i 15 minutter hver.
- Inkuber i cocktail af fluorokrom-konjugerede sekundære antistoffer (fx rhodamin Red α-rotte, Alexa-647 α-marsvin, Alexa-488 α-ged; alle stammer i æsel) fortyndet i TBSplus, 3 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Fra nu af beskytte sektioner mod lys. Skyl 3 gange i TBS i 15 minutter hver.
- Mount sektioner til dias i gelatine, lufttørre O / N. Dækglasset med vandig mounting medium.
- Sekventiel behandling af flere immunofluorescens med primære antistoffer fra samme værtsart
- Som trin 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
- Der inkuberes i fiførste primært antistof (fx kanin α-antigen A), O / N ved 4 ° C. Skyl 3 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver.
- Inkuber i første fluorokrom-konjugeret sekundært antistof (fx rhodamin Red-conj. Æsel α-kanin), 3 timer RT. Fra nu af beskytte sektioner mod lys. Skyl 3 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver.
- Inkuber i 10% normalt serum fra samme vært som de primære antistoffer (fx kanin serum) i 3 timer RT for at mætte åbne paratoper den første sekundært antistof. Skyl 3 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver.
- Der inkuberes i TBSplus med 50 ug / ml ukonjugeret monovalente Fab-fragmenter mod værten af de primære antistoffer (fx α-kanin-IgG (H + L)) til dækning af epitoper, der kan anerkendes af den anden sekundære antistof, O / N på 4 ° C.
- Skyl mindst 3 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver. Mens overføre kortvarigt swab de Mesh indeholder afsnittene på et stykke køkkenrulle for at fjerne eventuelle Fab efterladenskaber.
- Inkuber i andet primære antistof (fx kanin α-antigen B), O / N ved 4 ° C. Skyl 3 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver.
- Der inkuberes i anden fluorokromkonjugerede sekundært antistof (f.eks Alexa-488-conj. Æsel α-kanin), 3 timer RT. Skyl 3 gange i TBS i 15 minutter hver, montere og dækglasset som ovenfor.
BEMÆRK: For at mærke antigener med antistoffer fra forskellige værtsarter tilføje dem til trin 3.2.2.2 og de respektive sekundære antistoffer til trin 3.2.2.3.
- Et af de sekundære antistoffer fra samme art som en af de primære antistoffer
BEMÆRK: Denne protokol er velegnet til firedobbelt-farvning mod BrdU eller Ki67 sammen med GFAP, nestin-GFP og DCX.- Følg nøje protokol trin 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Indtil dette punkt kun bruge æsel serum i TBSplus.
- Inkuber i TBSplus indeholdende 3% gedeserum i 1 time ved stuetemperatur. Dette dækker åbne paratoper på α ged sekundært antistof. Skyl 3 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver.
- Der inkuberes i AMCA-conj. ged α-kanin fortyndet i TBSplus, 3 hr RT eller O / N 4 ° C. Skyl tre gange i TBS i 15 minutter hver, montere og dækglasset som ovenfor.
- CldU, IDU co-farvning
- Skyl, denaturere og neutralisere sektioner som beskrevet i afsnit 3.2.1 (trin 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
- Inkuber med 20 ug / ml ukonjugeret Fab-fragmenter α-muse-IgG (H + L) i TBSplus, 1 time ved stuetemperatur. Skyl 4 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver.
- Inkuber i primært antistof cocktail indeholdende rotte α-BrdU (1: 400; oprenset IgG2) og muse α-BrdU (1: 350) fortyndet i TBSplus, O / N ved 4 ° C. Skyl 3 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver.
- Der inkuberes i sekundært antistof cocktail indeholdende biotinylerede æsel α-rotte (1: 500) og FITC-conj. donkey α-muse Fab-fragmenter (1: 100). Skyl 3 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver.
- Der inkuberes i Rhodamin Rød-conj. Streptavidin, 2 timer ved stuetemperatur. Skyl 3 gange i TBS i 15 minutter hver, montere og dækglasset som ovenfor.
- Amplifikation af fluorescenssignal i nestin-GFP-mus
- Tilføj ged α-GFP til det primære antistof cocktail.
- Tilføj et fluorochrom konjugeret sekundært antistof med spektrale egenskaber svarende til GFP (såsom Alexa 488 conj. Æsel α-ged) til det sekundære antistof cocktail.
- Single eller samtidig flere immunofluorescens
- Epitopgenfinding
- Udfør epitopgenfinding efter skylning ud frostvæske. Forvarm damper 6- eller 12-brønds plader indeholdende 0,1 M citratpuffer pH 6,0 til 95 - 99 ° C (ca. 25 min).
- Overfør afsnittene i den varme citratpuffer og damp i 30 minutter (dække pladerne med aluminiumsfolie plast lids er ikke varmebestandige).
- Umiddelbart placere pladerne i et isbad for at køle ned. Dette hjælper til at beskytte væv morfologi, som er af særlig betydning, når der arbejdes med hjerneudsnit fra postnatale dyr.
- Skyl 3 gange i TBS i 10 min hver at skylle og neutralisere citrat og fortsætte farvning.
- Museantistoffer på musevæv
- Tilsæt 20 ug / ml monovalente Fab-fragmenter α-muse-IgG (H + L; samme vært-arter end sekundært antistof) til den første blokerende trin (f.eks trin 3.1.5 eller 3.2.1.3).
- Skyl 4 gange i TBS og en gang i TBS-T i 10 minutter hver, og fortsætte med respektive protokol.
- Cresylviolet kontrastfarvning
- Forvarm cresylviolet opløsning til 60 ° C (i glas). Inkuber slides i den varme opløsning i 3 minutter.
- Skyl i aq. dest. og dehydrere 2 gange i 1 min hver i 70%, 96% og 100% isopropanol. Klar til 5 - 6 min i xylen eller en xylen erstatning og dækglas med en kompatibel permanent montering medium.
4. Data Analysis
- Tæl peroxidase farvede nyfødte celler i hver 6. sektion langs hele rostrocaudal omfanget af gyrus dentatus. Brug et lysmikroskop ved 400X forstørrelse.
- Multiplicer de resulterende celleantal med skæringspunktet interval at opnå et estimat af den samlede antal nyfødte celler.
- Billede af fluorescens mærkede sektioner med en konfokal laser mikroskop udstyret med passende lasere og filtersystemer. Tag billedstakke på tilfældige positioner langs hele omfanget af den tandede gyrus på 400X forstørrelse og analysere mindst 50 tilfældigt udvalgte celler af interesse pr halvkugle til co-mærkning med andre markører.
- Gang de resulterende procentdele af co-mærkede celler (% / 100) med det samlede antal nyfødte celler til at beregne absolutteantal specifikke nyfødte cellepopulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi anvendte de ovenfor beskrevne fremgangsmåder til at kvantificere og karakterisere nyfødte celler i postnatal og voksne hippocampus. Derfor brugte vi vildtype og neurogenese-mangel cyclin D2 knock out (Ccnd2 KO) mus opstaldet under betingelser, der vides at påvirke hastigheden af neurogenese (dvs. beriget miljø, EE) 13,14. Immunohistokemisk DAB farvning mod enten Ki67, BrdU, CldU eller IDU konsekvent vist forskelle i nyfødte celleantal mellem vildtype og Ccnd2 KO-mus (figur 3) 15. Desuden med træk ækvimolære injektioner af CldU og stiknarkomaner vi var i stand til at skelne cellepopulationer født under bestemte perioder af EE (figur 3C, D). Vedtagelsen afsnit 3.2.4 kunne vi med held opdage lige signalintensiteter og fremragende overlapning CldU og Idu efter deres samtidige levering (figur 4). BrdU mærkede nyfødte celler kunne fænotypebestemmes med en standard immunofluorescens metode enten samtidig anvende BrdU og NeuN (figur 5) eller BrdU, GFAP, nestin-GFP og DCX antistoffer (figur 6B). Denne teknik tillod vellykket identifikation type 1, 2a, 2b og 3 progenitorceller inden for en enkelt prøve (figur 6B, D). Co-mærkning af Ki67 med progenitor markører krævede den sekventielle anvendelse af antistoffer som primære antistoffer mod Ki67 og GFAP er blevet rejst i kanin (gælder punkt 3.2.2), i øvrigt en af de primære antistoffer (ged α-GFP) er fremstillet på den samme vært som en af de sekundære antistoffer (AMCA conj. ged α-kanin). En kombination af §§ 3.2.2 og 3.2.3 perfekt arbejdede hvis sektioner blev inkuberet først i Ki67 sammen med nestin-GFP-antistof, og for det andet i GFAP-antistof, men ikke omvendt (figur 6C). Figur 2B opsummerer den godkendte ansøgning ordninger.
Figur 2. sekventiel behandling af flere immunofluorescens med primære antistoffer afledt fra den samme vært art. (A) Skematisk illustration. (B) Vellykket kombinationer af antistoffer og deres rækkefølge immunofluorescens. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. lysmikroskopi billeder af ABC-immunhistokemi til kvantificering af nyfødte celler i den tandede gyrus. Afbildet er sammenligninger af forskellige proliferationsmarkører i WT og neurogenese-mangel Ccnd2 KO mus ved 100X og 400X forstørrelse. (A) g> Ki67-DAB-farvning viser klynger af prolifererende celler i subgranular zone af den tandede gyrus (postnatal dag 35). Antallet af prolifererende celler formindskes i Ccnd2 KO-mus sammenlignet med WT-mus. (B) Nyfødte celler ved 28 dage efter BrdU-administration (injektion ordning over billeder) bekræfter den reducerede proliferationshastighed i Ccnd2 KO mus. (C) CldU-administration i 6. uge EE (indsprøjtning ordning ovenstående billede) afslørede en stigning i antallet af nyfødte celler i gyrus dentatus fra WT men ikke Ccnd2 KO-mus. (D) IDU-administration under 8. uge af EE viste lignende resultater. Scale søjle repræsenterer 50 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
fig4.jpg "/>
Figur 4. Immunofluorescens co-farvning af CldU og IDU efter samtidig levering af ækvimolære koncentrationer. Signal amplifikation af CldU mærkede celler resulterede i en fremragende overlapning CldU og IDU. Scale søjle repræsenterer 20 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Immunofluorescens co-mærkning af NeuN og BrdU. (A) BrdU blev administreret 6 gange hver 8. time i 2 på hinanden følgende dage begyndende ved postnatal dag 14. Dyrene blev aflivet 28 dage senere. (B) Immunofluorescens co-mærkning af prolifererende celler med den modne neuronal markør NeuN viser et reduceret antal prolifererende celler i Ccnd2 KO forhold til WT dyr. Scale bar repræsenterer 50 um. (C) forstørret afbildning af (B), der viser co-mærkede celler i begge genotyper. Scale bar repræsenterer 20 um. (D) Stor forstørrelse eksempel på en BrdU / NeuN co-mærkede celle i den tandede gyrus. Scale bar udgør 10 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6. Quadruple immunofluorescens co-mærkning af forskellige proliferationsmarkører med GFAP, nestin-GFP og DCX til fænotypebestemmelse nyfødte granulerede celler i gyrus dentatus af nestin-GFP-mus. (A) BrdU blev administreret 3 gange hver 2 timer ved postnatal dag 70 . Dyrene blev aflivet 2 timer senere. (B) repræsentativt billede af en co-farvning for BrdU, GFAP,nestin-GFP og DCX. (C) Repræsentant billede af firdobbelt immunofluorescens for Ki67, GFAP, nestin-GFP og DCX. (D) Klassificering af stamceller typer efter deres immunfluorescens mærkning. Baseret på co-ekspression af forskellige markører og morfologiske træk ved de mærkede celler kan identificeres fire forskellige stamceller undertyper: type 1 (GFAP +, nestin +, DCX -), typen 2a (GFAP -, nestin +, DCX - ), type 2 b (GFAP -, nestin +, DCX +) og type 3 (GFAP -, nestin -, DCX +). Scale søjle repræsenterer 20 um. (E) Skematisk oversigt over de forskellige stadier af voksne hippocampus neurogenese. Det illustrerer 4 progenitor celletyper, umodne neuroner og modne granulceller, deres karakteristiske ekspression af markører og deres proliferative kapacitet. ML - molekylær cellelag, GCL -granuleret cellelag, SGL -. subgranular cellelag Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7. Eksempel på succesfulde og ikke-succesfulde sekventielle farvninger med to primære antistoffer i den samme art, afhængigt af rækkefølgen af antistof inkubation. De konfokale mikrografier viser resultatet af en sekventiel co-farvning mod Ki67 og GFAP med primære antistoffer både afledt fra kanin. I (A) immunohistokemi blev først afsluttet for GFAP, efterfulgt af farvning mod Ki67 hvilket førte til en udtalt overlapning af de to signaler. Navnlig Ki67 signalet var atypisk og lignede signalet af GFAP-farvning. (B) viser resultaterne fra den omvendtefarvning sekvens med Ki67 farvning afsluttet første og efterfølgende farvning mod GFAP. Her signalerne for begge antigener lignede det forventede udtryk mønster: Den Ki67 signal var begrænset til kerner i subgranular zone mens GFAP signalet blev fundet cytoplasmatisk, hovedsageligt i de cellulære processer, der følger af subgranular zone. Scale søjle repræsenterer 20 pm. RhX - Rhodamin X. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 8. Specificitet af α-BrdU-antistoffer anvendes til påvisning af CldU og IDU. Mus blev injiceret med enten CldU eller med IDU (ikke-samtidig anvendelse). I (A) hjerneudsnit fra CldU (A1) eller IDU (A2) injicerede mus var IMMUnostained anvendelse af det oprensede rotte α-BrdU antistof, som bør specifikt krydsreagerer til CldU, men ikke til IDU. (B) viser resultaterne af farvning hjerner fra CldU (B1) eller IDU (B2) injicerede mus med mus α-BrdU antistof, som forventes at krydsreagere med IDU, men ikke CldU. Scale søjle repræsenterer 20 pm. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantificering og identifikation af subpopulationer af nyfødte celler er et centralt spørgsmål i voksen neurogenese forskning. Kombinere proliferationsmarkører og antistoffer mod proteiner udtrykt i bestemte stadier af voksne neurogenese tillader immunhistokemisk påvisning af disse subpopulationer. Nogle af antistofferne eller antistof-kombinationer kræver specifik farvning betingelser.
Mærkning af delende celler med syntetiske thymidinanaloger er stadig den gyldne standard for at studere voksne hippocampus neurogenese. Det er afgørende at overveje passende injektionsprotokol før start af forsøget. Vi normalt administrere 50 mg / kg (legemsvægt ip) BrdU, men koncentrationerne kan variere afhængigt af eksperimentelle krav (op til 300 mg / kg for en bolus injektion) 8,16. Hvis IDU og CldU at have injiceres sekventielt for tidsmæssig diskrimination af cellepopulationer er det obligatorisk at injicere ækvimolære koncentrationer (
For immunofarvning, er sektioner generelt behandles fritflydende, sædvanligvis i 6-brønds plader, der er udstyret med en bæreplade og mesh indsatse hvilket forenkler deres overførsel fra en opløsning til en anden. Som en undtagelse, blokering, antistofinkubationer og ABC reaktion er færdigi 12- eller 24-brøndsplader uden Mesh at spare dyre løsninger (0,5 til 1 ml per brønd er tilstrækkelig, afhængigt af antallet af skiver, der skal farves). Under disse trin, overfører sektioner ved hjælp af en fin pensel, der skal skylles ved skift løsninger. Undgå afsnit fra udtørring og udfører inkubationer, der tager> 1 time i et befugtet kammer. Alle inkubationer skal ske med kontinuerlig omrøring (max 150 rpm). Altid teste og titreres hvert nyt antistof parti. Længere antistof inkubationstider (op til 2 dage ved 4 ° C), kan forbedre farvning. I tilfælde kun muse-antistoffer er tilgængelige mod antigener, du ønsker at visualisere i mus væv er det tilrådeligt at blokere endogene immunglobuliner med stærkt koncentreret monovalente Fab-fragmenter α-mus (afsnit 3.4). Når anvendelse af denne teknik forlænge følgende skylletrin. Ellers kan ubundne Fab-fragmenter binde til din primære muse-antistof. HCI forbehandling og boratneutralisering er kun nødvendige til påvisning af thymidinanaloger. Den 12 min peroxidase reaktion resultere i en optimal signal-til-støj-forhold med de betingelser og antistoffer anvendes i vores protokol. Som med enhver enzymatisk reaktion, hastigheden af peroxidase reaktion afhænger af mange faktorer (fx temperatur, pH, koncentration af enzym og substrat). Derfor behøver, reaktionstider at være optimeret til alle nye antistof sæt. For at visualisere anatomiske strukturer i DAB pletter med meget svag baggrund (f.eks CldU) kan skiver der modfarvet. Den cresylviolet metode beskrevet i afsnit 3.5 medfører en meget svag kontrastfarve, der ikke kompromitterer den specifikke DAB-signalet.
For flere immunofluorescens Brug primære antistoffer, der er rejst i forskellige arter eller forskellige isotyper og følg afsnit 3.2.1. Ellers udføre en sekventiel behandling af flere immunolabeling, som er blevet optimeret til at opdage flere primære antistofferfra den samme vært arter (dvs. mus eller kanin, afsnit 3.2.2). Det grundlæggende princip i denne metode er blevet opfundet af Ferguson og kolleger, der med succes farves forskellige muskelgrupper markører med to mus primære antistoffer 17. De Fab-fragmenter, der anvendes til at blokere i trin 3.2.2.5 bør være afledt fra den samme vært art som de sekundære antistoffer. Koncentrationerne og inkuberingstider beskrevet i afsnit 3.2.2 er optimeret til de specifikke antistoffer, der er beskrevet heri, og skal tilpasses til enhver ny antistof kombination. Vær opmærksom på at sekvensen af primære antistof inkubation kraftigt kan påvirke resultatet (som angivet i figur 7A). Hvor det er relevant, bør de antigener, der detekteres af de primære antistoffer, der er afledt fra den samme art viser et andet udtryk mønster, som forenkler påvisning af utilstrækkelig blokering. For at eliminere enhver mulighed for antistof krydsreaktion eller falsk-positive er essenoplys- at omfatte passende kontrol (dvs. kun-gymnasiale-antistof kontrolforanstaltninger, komplet immunhistokemi for første antigen efterfulgt af en inkubation med anden primære antistof eller andet sekundært antistof alene). 18 Figur 2B viser antistof kombinationer, der fungerede godt i vores hænder. For flere immunofluorescens er det også tilrådeligt at bruge sekundære antistoffer, der er rejst i den samme art (f.eks æsel) og har minimal krydsreaktivitet til din væv og til serum proteiner fra andre arter (dvs. præadsorberet). Ellers afsnit 3.2.3 kan medvirke til at forebygge eventuelle uventede interspecies krydsreaktivitet. Vælg fluorochromer med minimal spektral overlapning hensigtsmæssigt at dit detection system (f.eks AMCA, Alexa Fluor 488, Rhodamin Rød, Alexa Fluor 647). Hvis en nuklear kontrastfarve er påkrævet, tilsættes DAPI eller Hoechst 33342 (10 ug / ml) til det sekundære antistof cocktail (da ingen nær-UV sekundære antistof kan være osed). Disse nukleare counterstains ikke fungere, hvis væv er blevet forbehandlet med HCI. Tilsvarende kan HCI behandling kompromittere påvisning af nogle antigener og derfor dens indflydelse på individuelle antistof ydeevne skal testes. Når fluorokrom-konjugerede sekundære antistoffer er blevet anvendt Protect sektioner fra lys.
CldU og IDU kan visualiseres ved hjælp af to forskellige BrdU antistoffer, som krydsreagerer med enten CldU (rotte α-BrdU) eller IDU (muse α-BrdU) 9,19. Hvis begge thymidinanaloger er blevet injiceret i et dyr er det absolut nødvendigt at anvende det rensede rotte α-BrdU antistof til at detektere CldU fordi urenset antistof krydsreagerer til IDU. Som beskrevet af Vega et al. 9 behov for CldU signal, der skal forstærkes for immunofluorescent co-mærkning for at opnå tilsvarende påvisning af såvel thymidinanaloger. Derfor, i stedet for et fluorochrom-konjugeret sekundært antistof (α-rotte) et fluorochrom konjugeret streptavidin tilsættes efter inkubation i et biotinyleret sekundært antistof (α-rotte, afsnit 3.2.4). For at udelukke enhver uønsket antistof krydsreaktioner omfatter kontrol sektioner fra mus, der modtog enten stiknarkomaner eller CldU (separat, se figur 8). For at bekræfte ækvivalent påvisning af IDU og CldU brug afsnit fra dyr, der samtidig blev injiceret med ækvimolære mængder af CldU og stiknarkomaner (se figur 4).
At studere type 1 og type 2 stamceller vi foretrækker at bruge nestin-GFP transgene mus 12 som nestin antistoffer ofte ikke tilfredsstillende resultater. Nestin-GFP mus har den fordel pålideligt visualisere nestin-positive progenitorceller og deres morfologiske træk på et bestemt udviklingstrin. GFP-signal skal forstærkes ved indirekte immunofluorescens med en α-GFP-antistof. Det sekundære antistof skal være koblet til en fluorochrome med spektrale egenskaber svarende til GFP. Hvis det ønskes, kan nestin-GFP-mus blive krydset med andre mutante muselinjer at undersøge inddragelse af bestemte gener i neurogenese. Ved nu, er forbedrede nestin antistoffer leveres som etiket cellelegemer samt processer og kan anvendes som et alternativ til den transgene fremgangsmåde (se materiale liste).
Det er afgørende at overholde 24 timers fiksering for at forhindre overfixation. Den kemiske reaktion partnere af formaldehyd i væv er primært proteiner og formaldehyd genererer reaktive hydroxymethylgrupper på deres sidekæder, der fører til tværbinding af tilstødende aminosyrer (ved dannelse af methylen broer). Dette kan medføre maskering af antigen-epitoper og tab af immunreaktivitet (se kommentarer til specifikke antistoffer i Materials List). At genvinde tabte immunreaktivitet findes flere epitopgenfinding metoder, break formaldehyd-induceret protein tværbindinger via eXposure at opvarme 20. I denne protokol, det citratbuffer metode virker bedre end andre til påvisning af neurogenese i den postnatale og voksne hippocampus (afsnit 3.3). Bemærk, at skiver af meget unge dyr (<P21) kan blive meget skrøbelige eller forvrænget og skal håndteres med særlig omhu. Endvidere kan epitopgenfinding være skadeligt for nogle epitoper, og derfor individuelle antistoffer skal testes, om de er egnede til multipel farvning, der kræver denne forbehandling.
Sammenfattende denne protokol er en samling af grundlæggende og udarbejdet teknikker, der letter analysen af voksne hippocampus neurogenese. Det især giver en utvetydig identifikation af alle hippocampus progenitor subpopulationer sammen med en spredning eller fødsel-dating markør fra en enkelt sektion. Disse teknikker kan tilpasses til enhver kombination af antistoffer eller til andre arter at studere udvikling og regulering af hippocampal stamcelle i svar på specifikke stimuli og deres deltagelse i bestemte hjernefunktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24-well Cell culture multiwell plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3479 | pre-loaded in 6-well culture plates |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | for 24 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Vectastain Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| Rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
