Abstract
成体神経新生は、新しいニューロンが次第にコミット中間前駆体サブタイプを介して活性化神経幹細胞から生成された高度に調節され、多段階プロセスである。これらのサブタイプの各々は、一緒に、特定の形態学的基準とのそれらの同定のために使用することができる特定の分子マーカーの組を表す。典型的に、免疫蛍光技術は、エキソヌクレアーゼまたは内因性の増殖マーカーと組み合わせてサブタイプに特異的な抗体を含む適用される。私たちはここに大人の海馬の神経新生のすべての段階の検出および定量のための方法を免疫標識について説明します。これらは、チミジン類似体、腔的灌流、組織処理、熱誘導性エピトープ回復、ABC免疫組織化学、複数の間接的免疫蛍光、共焦点顕微鏡法および細胞定量化の適用を含む。さらに私たちは、問題のuを回避するシーケンシャル複数の免疫蛍光プロトコルを提示sually同じ宿主種に上げ、一次抗体を使用する必要性から生じる。これは、単一のセクション内増殖マーカーと一緒にすべての海馬前駆細胞サブタイプの正確な同定を可能にする。これらの技術は、並列に異なる前駆体サブタイプの調節、脳の病理への関与、特定の脳機能におけるそれらの役割を研究するための強力なツールである。
Introduction
二つの脳領域を構成的生涯を通じて新しいニューロンを生成し、側脳室の脳室下帯と海馬歯状回（DG）の下帯（SGZ）。新生ニューロンは、神経前駆細胞から派生し、成熟1,2に到達する前に形態学的および生理学的な開発のさまざまな段階を経る。ゆっくり分裂放射状グリア様幹細胞（タイプ1）から、トランジットの連続したステージは、中間前駆細胞を増幅が生じる。より未分化のサブタイプ（タイプ2aおよび2b型）が短く、接線プロセスとの不規則な形状を有する。彼らは徐々に未熟ニューロン（樹状突起と分子層の方に延長）になるために細胞周期を終了し、最終的に成熟した顆粒細胞などの海馬ネットワークに統合する神経芽細胞（タイプ3）を生成します。それらの特定の生理学的特性には、これらの細胞は、強化された可塑3 suggesで回路を提供ティン海馬機能で独自の役割。実際には、最後の十年の研究では、成人の神経新生が空間記憶、パターン分離と情動行動4,5に寄与することを実質的証拠を生成した。
成体神経新生は、異なるアプローチを用いて研究することができる。チミジン類似体は、細胞周期のS期の間にDNAに組み込むと新生児の細胞6-8の誕生デート、定量化と運命分析を可能にする。別のチミジン類似体（ 例えば、CldU、EDUのまたはIDU）を順次適用は、細胞の代謝回転または実験9の経過中の異なる時点で生まれた細胞集団を研究するために使用することができる。代替、細胞増殖のための内因性のマーカーはKi67のです。これは、細胞周期（G1、S、G2、M）休止期を除く（G0）及びG1 10,11の先頭のすべての段階の間に分裂する細胞において発現される。成人における新生児細胞集団の表現型を解析するために、dentat電子状回いくつかの段階特異的な分子マーカーは、GFAP、ネスチン、およびNeuNのDCX 1,6として使用することができる。 GFAPは成熟したアストロサイトのマーカーであるだけでなく、大人の前脳における放射状グリア細胞様細胞に発現している。ネスチンは、放射状グリア様細胞および初期の中間前駆細胞に特異的な中間径フィラメントである。 DCXは、中間前駆細胞、神経芽細胞と未熟ニューロンにおいて発現微小管結合タンパク質である。 +、ネスチン- 、2A型（GFAP - 1型（GFAP +、ネスチン+、DCX）：これらの3つのマーカーと4の異なる前駆細胞のサブタイプを識別できる標識された細胞の形態学的特徴の（共）式に基づいて、 、DCX - ）、2B型（GFAP - 、ネスチン+、DCX +）とタイプ3（GFAP - 、ネスチン- 、DCX +）1。一緒に有糸分裂後ニューロンに発現しているのNeuN、とDCXの同時標識、immaturの分化を可能にする電子（DCX +、のNeuN +）および（DCX - 、のNeuN +）成熟顆粒ニューロン。
上述したマーカーは、しばしば、新生児細胞の数および同一性を分析するために免疫蛍光同時標識およびその後の共焦点顕微鏡検査のために使用される。これは、典型的には望ましくない抗体の交差反応性を防止するために、異なる宿主種由来の抗体を必要とする。しかし、神経発生の研究に適した一次抗体の大部分は、どちらウサギまたはマウス（ 例えば、マウスα-BrdUを、マウスα-のNeuN、ウサギα-Ki67の、ウサギα-GFAP）で飼育されている。これは、単一のスライスで評価することができる抗原の数との組み合わせで重大な制約をもたらす。これは、複数の染色を実行しなければならないように、染色の労力を増加させるだけでなく、結果の信頼性を損なう可能性だけでなく。さらに、いくつかの抗原は、ホルマリン固定誘導性エピトープマスキング（ 例えば、Ki67の影響を受けやすい、ネスチン）。私たちはここに、これらの問題の多くを克服古典的な単一および複数の免疫標識プロトコル（ 例えば、エピトープ回復、複数の連続免疫染色、ネスチン-GFPトランスジェニックマウス12の使用）からの変更について説明します。特に、複数のシーケンシャル免疫プロトコルは、抗体の一部は、同じ宿主に由来する場合であっても、最大4つの異なる抗原に対する染色を可能にする。これは、同時タイプ1、タイプ2aと2b型と3型前駆細胞の検出、ならびに単一セクション内のそれらの増殖活性を可能にする。
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Protocol
注：生きている動物に関わるすべての手順は、実験動物の管理と使用に関するEC指令609分の86 / EECガイドラインに従って行われ、地元の倫理委員会（テューリンゲンのLandesamtエリーゼLebensmittelsicherheitウントVerbraucherschutz）によって承認された。
チミジン類似体の1。腹腔内注射
- 動物に注射前日に秤量する。 10 mg / mlのストック溶液の次の日に計画されたすべての注射に必要なチミジンアナログの量だけでなく、個々の重量調整後の注入量を計算します。
- 10 mg / mlのチミジンストック溶液を準備します。 （ 注意！チミジン類似体は有毒である。供給業者によって提供される特定化学物質等安全データシート（MSDS）に従う、 すなわち、化学ヒュームフードを使用し、白衣と手袋を着用）。
- およそ、冷凍庫からチミジンアナログを取り、RTにそれを持って来る。 21℃。 10 mgの秤量を追加または0.04 NのNaOH（BrdUおよびCldU用）滅菌生理食塩水（滅菌生理食塩水で、IDUのために）、渦。 50℃の水浴ボルテックスで15分毎に2 - - 粉末を溶解するために3分の少なくとも10のために置く。
注：-20℃で、室温で、数週間貯蔵最大24時間のために使用するソリューション。光（アルミホイルでカバー）からソリューションを保護します。常に沈殿物をチェックし、必要に応じて再溶解する。
- およそ、冷凍庫からチミジンアナログを取り、RTにそれを持って来る。 21℃。 10 mgの秤量を追加または0.04 NのNaOH（BrdUおよびCldU用）滅菌生理食塩水（滅菌生理食塩水で、IDUのために）、渦。 50℃の水浴ボルテックスで15分毎に2 - - 粉末を溶解するために3分の少なくとも10のために置く。
- 首筋によってマウスを拘束し、腹腔内に30 G針で細かい用量シリンジを使用して（室温で）原液の適切な、重量調整済みのボリュームを注入する。
注：場合CldUとIDUは、同じ動物内逐次的に投与されなければならない等モル濃度を注入するために検討して（ 例えば、50mg / kgのBrdUのに対応して42.5 mg / kgをCldUと57.5 mg / kgをIDU、）。したがって、それに応じて10mg / mlのストック溶液の注入量を調整する。
2.組織の準備
- Prepa灌流前日に0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）中の4％ホルムアルデヒドに再。 4℃で保存。
- 経心40ミリリットルの氷冷ホルムアルデヒド（流速5ml /分）、次いで10 mlの氷冷PBSで左心室を介して深く麻酔したマウス（3.5％イソフルラン）を灌流する。 4℃で24時間、同じ固定液で脳とポストフィックスを解剖。
- 連続して10％（4℃で24時間）、30％スクロース（脳シンクまでは、約48時間）に脳を転送します。気泡が組織から出なくなるまで凍結のために、ゆっくりと-25℃のイソペンタン中に凍結保護の脳を沈める。 -80℃で保管してください。
- 凍結ミクロトーム上で40μmの厚さの冠状切片カット（-25でブロック温度を-16℃）。 24ウェル細胞培養プレートのウェルを含む不凍液に順次転送部（ 図1参照）。 -20℃で保管してください。
図1. 24ウェルプレートにミクロトームスライスを転送する模式図。A6は、次の行Bに行くなどした後、A1から始まり、A列に後続のスライスを配置します。 D6に達すると、A1に戻って継続する。切片のこの配置は、脳全体のセクション全ての n 番目の定量を可能にする。新生児の細胞の定量化のために（1列の内容に相当）脳切片番目ごとに6を取る、免疫表現型検査のために（1列の2の交互の行の内容に相当）ごとに12 番目のセクションを取る。
3.免疫染色
注：セクションは、通常、キャリアプレートとメッシュインサートを装備した6ウェルプレート中で、自由に浮動して処理される。例外として、抗体インキュベーションおよびABC反応メッシュインサート（ワット当たり0.5〜1ミリリットルことなく、12または24ウェルプレートで行われるブロッキングエル）が染色されなければならないスライスの数に応じて、十分である。これらのステップの間に、細いブラシの助けを借りて、転送部は、（それぞれの新しいソリューションでリンス）。すべてのインキュベーションは、連続的に攪拌（最大150回転）で行われます。
- 免疫組織化学（ABC法）
- TBSへの不凍液から転送部と完全に不凍剤を除去するために（一度O / N 4℃で、10分間RTで5回ずつ）徹底的にすすぐ。
- 内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチするTBS-T中の1.5％H 2 O 2で30分間インキュベートする。必要に応じてバブリングし、再水没セクションに注意してください。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。
- オプション：一方37℃に加熱キャビネットと2NのHClを予熱。 DNAを変性させ、2N HCl中で37℃で30分間、切片をインキュベートする。ブラシの助けを借りて、静かに別々のセクション。
- オプション：0.1 Mホウ酸緩衝液中で10分間のセクションを中和する8.5、RT。転送中に、簡単に塩酸残り物を削除するにはペーパータオルの上のセクションを含むメッシュインサートを綿棒。 15分ごとにTBSで2回洗浄します。
- 組織を透過し、非特異的抗体結合部位を、室温で1時間ブロックするTBSplusでインキュベートする。
- 4℃でTBSplusで希釈した一次抗体、O / Nでインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。
- TBSplus、室温で3時間で希釈したビオチン化二次抗体でインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。一方で...
- 製造業者のプロトコル（TBS-T中1％A + 1％B）に従って、ABC複合体を準備する。使用前にRTで30分間放置する。室温で1時間のAB試薬中のセクションをインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。
- それぞれ、二等分し、ピペット4ミリリットルまたは2ミリリットルウェル当たりに分け、6員または12ウェルプレート当たりTBS-Tで50ミリリットル0.5 mg / mlのDABを準備します。 DAB溶液中にセクションを転送（ 注意！DABは有毒である。納入仕様に従ってくださいC すなわち、白衣と手袋を着用し、サプライヤーが提供するMSDSは、）、化学ヒュームフードを使用しています。
- ペルオキシダーゼ反応を開始するために、各ウェルに、上記のように、残りの25ミリリットルDAB溶液に、0.5ミリリットルの1％H 2 O 2を添加し、混合し、ピペット等量。 12分間インキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。
- ゼラチン中のスライドにマウントセクション、空気乾燥O / N。永久封入剤とカバーガラス。
- オプション：カバースリップを配置する前対比（3.5節を参照）。
注：信号対雑音比が高いため、バックグラウンドの低い場合には、AB試薬（ステップ3.1.8）とのインキュベーション後にH 2 O 2処理を繰り返す。
- 複数免疫蛍光
- 単一または複数の同時免疫蛍光
- TBSへの不凍液から転送部と完全に削除するには（一度O / N 4℃で、10分間RTで5回ずつ）よくすすぐtifreeze。
- オプション：ステップ3.1.3のように- 3.1.4。
- 組織を透過し、非特異的抗体結合部位をブロックし、室温で1時間するTBSplusでインキュベートする。
- TBSplus、Oで/ N 4℃で希釈した一次抗体カクテル（ 例えば、ラットα-BrdUを、α-DCXモルモット、ヤギα-GFP）でインキュベートする。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。
- 蛍光色素結合二次抗体のカクテルでインキュベート（ 例えば、ローダミンレッドα-ラット、アレクサ-647α-モルモット、アレクサ-488α-ヤギ、ロバに派生したすべての）TBSplusに希釈した、RTまたはO / Nで3時間4℃で。今から上の光からセクションを保護。 15分ごとにTBSで3回すすいでください。
- ゼラチン中のスライドにマウントセクション、空気乾燥O / N。水性マウント培地でカバースリップ。
- 同じ宿主種からの一次抗体を用いたシーケンシャル複数の免疫蛍光
- 3.2.1.3 - 3.2.1.1ステップとして。
- FIのインキュベート第一次抗体（ 例えば、ウサギα-抗原A）、O / Nで4℃で。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。
- 第一の蛍光色素結合二次抗体（ 例えば、ローダミンレッド-CONJ。ロバのα-ウサギ）、3時間RTにインキュベートする。今から上の光からセクションを保護。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。
- 最初の二次抗体にオープンパラトープを飽和させるために3時間RTのための一次抗体と同じホスト（ 例えば、ウサギ血清）から10％正常血清中でインキュベートします。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。
- でO / N、第二の二次抗体により認識され得るエピトープをカバーするために、一次抗体（ 例えば、αウサギIgG（H + L））のホストに向けられた、50μg/ mlの非抱合型の一価FabフラグメントとTBSplusでインキュベート4°C。
- TBS中で少なくとも3回洗浄し、一回TBS-Tで10分間ずつた。転送中に、簡単にSWAどんなのFab残り物を削除するにはペーパータオルの上のセクションを含むメッシュインサートB。
- 二次抗体（ 例えば、ウサギα-抗原B）において、O / Nで4℃でインキュベートする。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。
- 第二の蛍光色素結合二次抗体（ 例えば、アレクサ-488-CONJ。ロバのα-ウサギ）、3時間RTにインキュベートする。 、15分ごとにTBSで3回すすぎマウントし、上記のようにカバースリップ。
注：別のホスト種からの抗体と抗原をラベルには、3.2.2.2のステップにそれらを追加し、それぞれの二次抗体は、3.2.2.3に移行する。
- 一次抗体のいずれかと同じ種に由来する二次抗体の一つ
注：このプロトコルは、GFAP、ネスチンGFPとDCXと一緒にBrdUまたはKi67のに対して四重染色に適しています。- 3.2.1.5 - 厳密にプロトコルは3.2.1.1を手順に従ってください。この時点まではTBSplusで唯一のロバ血清を使用しています。
- T中でインキュベートRTで1時間3％ヤギ血清を含むBSplus。これは、α-ヤギ二次抗体上のオープンパラトープをカバーしています。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。
- AMCA-CONJでインキュベートする。 TBSplus、3時間RTまたはO / Nを4℃で希釈したヤギαウサギ。 、15分ごとにTBSで3回すすぎマウントし、上記のようにカバースリップ。
- CldU、IDU同時染色
- セクション3.2.1で説明したように（ - 3.2.1.2 3.2.1.1ステップ）のセクションをすすぎ、変性させ、中和する。
- TBSplus、室温で1時間でαマウスIgG（H + L）を20μg/ mlの非結合体のFab断片とインキュベートします。 TBSで4回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。
- （400;精製されたIgG2 1）およびマウスα-のBrdU（1：350）、ラットα-のBrdUを含有する一次抗体のカクテルでインキュベートTBSplus、O中/ N 4℃で希釈した。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。
- （1ビオチン化ロバのα-ラットを含む二次抗体カクテルでインキュベート：500）、およびFITC-CONJ。ロバαマウスFab断片（1：100）。 TBSで3回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ。
- ローダミンレッド-CONJでインキュベートする。ストレプトアビジン、RTで2時間。 、15分ごとにTBSで3回すすぎマウントし、上記のようにカバースリップ。
- ネスチンGFPマウスにおける蛍光シグナルの増幅
- ヤギα-GFPは、一次抗体カクテルに追加。
- （そのようなアレクサ488 CONJとして。α-ヤギロバ）をGFPに類似したスペクトル特性を持つ蛍光色素結合二次抗体を追加し、二次抗体カクテルに。
- 単一または複数の同時免疫蛍光
- エピトープ回復
- 不凍液を洗い流した後、エピトープ回復を行ってください。 99°C（約25分） - 0.1Mクエン酸緩衝液pH6.0〜95を含有する6員または12ウェルプレートと予熱蒸し器。
- （プラスチックリットルとしてアルミホイルでプレートを覆い、30分間ホットクエン酸緩衝液と蒸気にセクションを移すIDS）は、耐熱性ではありません。
- すぐに冷却する氷浴中にプレートを配置。これは、出生後の動物の脳切片を扱うときに特に重要である、組織形態を保護するのに役立つ。
- すすぎとクエン酸を中和し、染色を続けるために10分間TBSで3回ずつ洗浄します。
- マウス組織上のマウス抗体
- 第1ブロッキングステップ（ 例えば、ステップ3.1.5または3.2.1.3）に、αマウスIgG（二次抗体と同じホスト-種H + L）を20μg/ mlの一価のFab断片を追加します。
- TBSで4回すすぎ、一度TBS-Tで10分間ずつ、それぞれのプロトコルを進める。
- クレシルバイオレット対比
- （ガラス瓶）で60℃に予熱クレシルバイオレット溶液。 3分間の高温溶液中でスライドをインキュベートする。
- 水溶液中ですすいでください。 DEST。 70％、96％、100％イソプロパノールで1分間ずつ2回脱水する。 6キシレンで分または互換性のある永久封入媒体とのキシレン代替とカバースリップ - 5クリア。
4.データ解析
- 歯状回の全体吻側尾側範囲に沿ってすべての6 番目のセクションにペルオキシダーゼ染色新生児細胞を数える。 400Xの倍率で光学顕微鏡を使用してください。
- 新生児の細胞の総数の推定値を得るために交差間隔で得られた細胞数を掛け。
- 適切なレーザーおよびフィルターシステムを備えた共焦点レーザー顕微鏡で画像蛍光標識セクション。 400Xの倍率で歯状回の全範囲に沿ってランダムな位置で画像スタックを取り、他のマーカーとの同時標識のために半球あたりの関心の少なくとも50ランダムに選択された細胞を分析する。
- 絶対計算するために新生児の細胞の総数で同時標識された細胞（/ 100％）が得られた割合を乗算特定の新生児細胞集団の番号。
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Representative Results
我々は、上記の方法は、出生後および成体海馬における新生児の細胞を定量し、特徴付けるために適用される。したがって、我々は、野生型および神経発生欠損サイクリンD2は、神経新生の速度（ すなわち、富化環境、EE）13,14に影響を及ぼすことが知られている条件下で飼育（CCND2 KO）マウスをノックアウト使用。 Ki67に、BrdUを、CldUまたはIDUのいずれに対して免疫組織化学的DAB染色は常に野生型及びCCND2 KOマウス（ 図3）15の間の新生児の細胞数の違いを明らかにした。さらに、CldUとIDUの連続した等モルの注射で、我々はEE（ 図3C、D）の具体的な期間中に生まれた細胞集団を識別することができました。セクション3.2.4を採用することに成功し、それらの同時配信します（ 図4）の後に等しい信号強度とCldUとIDUの優れた重複を検出することができた。 BrdUのラベル新生児細胞はスタンで表現型することができ同時にBrdUおよびNeuNのを適用して、（ 図5）またはBrdUの、GFAP、ネスチンGFPとDCX抗体（ 図6B）のいずれかによるDARD免疫蛍光法。この技術は、単一の試料（ 図6B、D）内に成功した識別タイプ1、図2a、2bおよび3前駆細胞を可能にした。 Ki67およびGFAPに対する一次抗体はウサギで提起されたように前駆細胞マーカーとのKi67の同時標識を作製した。また、一次抗体の1（ヤギα-GFP）（セクション3.2.2に適用されます）抗体の順次適用を必要とした二次抗体の1（AMCA CONJ。ヤギαウサギ）と同一のホスト。の項では、ネスチンGFP抗体と一緒にKi67の中で最初にインキュベートし、第二にGFAP抗体ではなく、その逆（ 図6C）は 。 図2Bは、承認されたアプリケーションスキームをまとめたされた場合のセクション3.2.2と3.2.3の組み合わせが完璧に働いた。
図2.同じホスト種に由来する一次抗体を使用した順序複数の免疫蛍光。（A）模式図。（B）抗体の成功の組合せおよび免疫蛍光における彼らの年代順。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
歯状回における新生児の細胞の定量化のためのABC-免疫組織化学の図3.光学顕微鏡像。描かは100Xと400Xの倍率でWTの異なる増殖マーカーと神経新生欠損CCND2 KOマウスの比較である。（A） G>のKi67-DAB染色は歯状回（生後35日）の下帯における増殖細胞のクラスターを示しています。増殖細胞の数は、WTマウスと比較しCCND2 KOマウスでは減少している。（B）のBrdU投与（イメージ上記噴射方式）CCND2 KOマウスにおいて減少した増殖速度を確認した後28日目の新生児細胞（C）CldU投与EE（イメージ上記インジェクション方式）の6週の間にWTなくCCND2 KOマウスの歯状回における新生児の細胞数の増加を明らかにした。（D）IDU投与EEの第8週の間、同様の結果を示した。スケールバーは、50μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4.免疫蛍光等モル濃度の同時納入後CldUとIDUの共染色。CldU標識細胞の信号増幅はCldUとIDUの優れた重複をもたらした。スケールバーは20μmでを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
のNeuNおよびBrdUの図5.免疫蛍光同時標識。 （A）のBrdUは生後日目に14の動物を開始する2日間連続して6回8時間毎に投与した28日後に屠殺した。成熟したニューロンマーカーのNeuNで細胞を増殖中の（B）免疫蛍光同時標識が増殖数の減少を示しているCCND2 KOの細胞はWと比較T動物。スケールバーは50μmである。（C）（B）の拡大図は、両方の遺伝子型で共標識された細胞を示す表す。スケールバーは20μmである。歯状回におけるBrdU / NeuNの共同標識された細胞の（D）高倍率の例を表している。スケールバーは、10μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ネスチン-GFPマウスの歯状回において新生児顆粒細胞を表現型分類のためのGFAP、ネスチンGFPとDCXと異なる増殖マーカーの図6.トリプル免疫蛍光同時標識が。（A）のBrdUは、生後70日で3回ごとに2時間投与した。動物を2時間後に屠殺した。BrdUを、GFAPに対する共染色の（B）の代表的な画像をネスチンGFPおよびKi67、GFAP、ネスチンGFPとDCXのために四重免疫蛍光のDCX。（C）代表画像。（D）彼らの免疫蛍光標識に従って前駆細胞型の分類。異なるマーカーと4の異なる前駆細胞のサブタイプを識別できる標識された細胞の形態学的特徴の同時発現に基づき： - 、2A型（GFAP - 、ネスチン+、DCX 1型（GFAP +、ネスチン+、DCX） - ）、2B型（GFAP - 、ネスチン+、DCX +）とタイプ3（GFAP - 、ネスチン- 、DCX +）。スケールバーは20μmである。大人の海馬の神経新生の異なる段階の（E）概略図を表している。これは、4前駆細胞型、未成熟ニューロンおよび成熟顆粒細胞、マーカーのそれらの特徴的表現及びそれらの増殖能力を示している。 ML - 分子細胞層、GCL -顆粒細胞層、SGL - 。顆粒下細胞層この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7.、同じ種で育った抗体インキュベーションの配列に応じて、2つの一次抗体との正常と非成功したシーケンシャル染色の例。共焦点顕微鏡写真は、両方の一次抗体とKi67およびGFAPに対するシーケンシャル共染色の結果を示しているウサギから誘導。に（A）免疫組織化学は最初の二つの信号の顕著なオーバーラップをもたらしのKi67に対して染色しGFAPのために完了した。特に、Ki67の信号は、非定型であり、GFAP染色の信号に似ていた。（B）逆の結果を示しているKi67染色による染色シーケンスは、GFAPに対する最初とその後の染色を完了した。ここで、両抗原のための信号は、予想される発現パターンに類似していた：GFAP信号は主に下帯から生じる細胞プロセスに、cytoplasmatically発見された一方のKi67信号下帯内の核に限定されていた。スケールバーは20μmでを表します。 RHX -ローダミンX. この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
CldUとIDU。マウスを検出するために使用されるα-BrdUの抗体の特異性は、図8 CldUまたはIDU（非同時出願）のいずれかを注射した。 （A）CldU（A1）またはIDU（A2）の脳切片を注射したマウスではIMMUであった特にCldUにではなく、IDUに交差反応する精製ラットα-BrdU抗体を用いnostained。（B）CldU（B1）またはIDU（B2）からの脳を染色からの結果は、マウスα-BrdUを注射マウス示すIDUと交差反応ではなく、CldUに期待されている抗体。スケールバーは20μmでを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
新生児細胞の亜集団の定量および同定は、成人の神経発生研究の中心的な課題である。大人の神経発生の特定の段階の間に発現タンパク質に対する増殖マーカーおよび抗体を組み合わせることにより、これらの亜集団の免疫組織化学的検出を可能にする。抗体または抗体の組み合わせのいくつかは、特定の染色条件を必要とする。
合成チミジン類似体の分裂細胞の標識は、まだ大人の海馬の神経新生を研究するためのゴールドスタンダードです。これは、実験開始前に適切な注入プロトコルを考慮することが重要である。我々は通常、50mg / kgの（体重、腹腔内）のBrdUを投与したが、濃度は、実験的な要件（最大300ミリグラム/ボーラス注射用キロ）8,16によって異なる場合があります。 IDUとCldUは細胞集団の時間的な差別のために連続して注入される必要がある場合には、等モル濃度を（注入することが必須である
免疫染色のために、切片は、一般に、通常は別の溶液からのそれらの移動を簡素化するキャリアプレート及びメッシュインサートを装備した6ウェルプレート中で、自由に浮動して処理される。例外として、ブロックし、抗体インキュベーションおよびABC反応が行われている高価なソリューションを節約するために、メッシュを挿入せずに、12または24ウェルプレート中（ウェル当たり0.5〜1ミリリットルを染色する必要がスライスの数に応じて、十分である）。これらのステップの間に、ソリューションを変更するときにすすいする必要が細いブラシの助けを借りて、セクションを転送する。乾燥アウトからセクションを防ぎ、腐植化チャンバー内で> 1時間を取るのインキュベーションを行う。すべてのインキュベーションは、連続的に攪拌（最大150回転）で行われなければならない。常にテストし、それぞれの新しい抗体をたくさん滴定する。長い抗体インキュベーション時間（4℃で2日間まで）は染色を改善することができる。場合のみマウス抗体は、マウス組織では、α-マウス高濃縮一価のFab断片（セクション3.4）で内因性免疫グロブリンをブロックすることをお勧めし可視化するために必要な抗原に対して利用可能です。この技術を使用するたびに、次のすすぎ工程を延長する。それ以外の場合は、未結合のFab断片は、プライマリマウス抗体に結合することがあります。塩酸前処理とホウ酸中和のみチミジン類似体の検出のために必要とされる。 12分間ペルオキシダーゼ反応は、我々のプロトコルに適用される条件と抗体との最適な信号対雑音比をもたらす。任意の酵素反応と同様に、ペルオキシダーゼ反応の速度は、多くの要因に依存する（ 例えば、温度、pH、酵素及び基質の濃度）。したがって、反応時間は、新しい抗体のセットのために最適化される必要がある。 （ 例えば、CldU）非常に弱い背景DAB汚れで解剖学的構造を視覚化するために、切片を対比染色することができる。クレシルバイオレット法は、特定のDAB信号を損なわない非常にかすかな対比でセクション3.5の結果を説明した。
複数の免疫蛍光のために、異なる種または異なるアイソタイプの隆起された一次抗体を使用し、セクション3.2.1に従ってください。それ以外の場合は、複数の一次抗体を検出するために最適化されているシーケンシャル複数の免疫標識を行う同じ宿主種（;セクション3.2.2 すなわち、マウスまたはウサギ）から。この方法の基本原理は、ファーガソンに成功つのマウス一次抗体17と異なる筋マーカーを染色らによって発明された。ステップ3.2.2.5に遮断するために使用されるFab断片は、二次抗体と同一の宿主種から誘導されるべきである。セクション3.2.2に記載した濃度およびインキュベーション時間は、本明細書に記載される特定の抗体のために最適化され、任意の新しい抗体の組合せのために調整しなければならない。 （ 図7Aに示すように）一次抗体のインキュベーションのシーケンスが強く結果に影響を与える可能性があることに注意してください。どこに該当する、同じ種に由来する一次抗体によって検出された抗原は、不十分なブロッキングの検出を簡素化し、異なる発現パターンを示すべきである。抗体交差反応または偽陽性の可能性を排除するためには、エッセンであるTiAlのが適切なコントロール（ すなわち、唯一-二次抗体のコントロール、第二次抗体または単独の第二の二次抗体とのインキュベーションに続いて第一の抗原に対する完全な免疫組織化学）を含むように。18 図2Bは、私たちの手の中にうまくいった抗体の組み合わせを示します。複数の免疫蛍光のために、同じ種（ 例えば、ロバ）で飼育し、組織および他の種（ すなわち、予め吸着）からの血清タンパク質に対する最小の交差反応性を有する二次抗体を使用することも推奨される。それ以外の場合はセクション3.2.3は、予期しない種間の交差反応性を防ぐのに役立つことがあります。お使いの検出システム（ 例えば、AMCA、アレクサフルオロ488、ローダミンレッド、アレクサフルオロ647）に適切な最小限のスペクトルの重なりを持つ蛍光色素を選択します。核対比が必要な場合は、二次抗体カクテル（にDAPIまたはヘキスト33342（10μg/ mlの）を追加し、無近UVは、二次抗体は、私たちをことができますED）。組織はHClで前処理されている場合は、これらの核の対比染色は動作しません。同様に、HCl処理は、いくつかの抗原の検出を損なう可能性があり、したがって、個々の抗体の性能への影響をテストする必要がある。蛍光標識二次抗体たら光から保護するセクションを適用されている。
CldUとIDUはCldU（ラットα-BrdU）のまたはIDU（マウスα-BrdU）の9,19のいずれかと交差反応する二つの異なるBrdUの抗体を利用して可視化することができる。両方のチミジン類似体は、一匹の動物に注入されている場合は、非精製抗体は、IDUに交差反応するのでCldUを検出するために精製されたラットα-BrdU抗体を使用することが必要不可欠である。ベガらによって記載されるように、 図9 CldU信号は両方のチミジン類似体の同等の検出を達成するために、免疫蛍光同時標識のために増幅される必要がある。そのため、代わりに蛍光標識二次抗体の（α-セクション3.2.4）;ラット）を蛍光色素結合ストレプトアビジンは、ビオチン化二次抗体（α-ラットでのインキュベーション後に追加されます。交差反応は、IDUやCldUのいずれかを受けたマウスからの制御セクションを含む望ましくない抗体を除外するには（別途、 図8を参照）。同時にCldUとIDUの等モル量を注射した動物からのIDUとCldU使用セクションの同等の検出を確認するには（ 図4を参照）。
タイプ1を研究し、2前駆細胞を入力するために、我々はネスチン抗体が頻繁に満足な結果を提供しなかったとして、ネスチン-GFPトランスジェニックマウス12を使用することを好む。ネスチンGFPマウスは、確実に特定の発達段階でネスチン陽性前駆細胞およびそれらの形態学的特徴を視覚化するという利点を有する。 GFPシグナルは、α-GFP抗体を用いた間接免疫蛍光法によって増幅される必要がある。二次抗体はfluorochrに結合されるべきであるGFPと類似のスペクトル特性を持つOME。必要に応じて、ネスチンGFPマウスは、神経発生における特定の遺伝子の関与を調べるために他の変異マウス系統を交配することができる。今では、改善されたネスチン抗体は標識細胞体と同様の処理を供給され、（材料のリストを参照）のトランスジェニックアプローチの代替として使用することができる。
それはoverfixationを防ぐために、24時間の固定を遵守することが重要です。組織中のホルムアルデヒドの化学反応パートナーは、主にタンパク質であり、ホルムアルデヒド（メチレン架橋の形成による）は、隣接するアミノ酸の架橋をもたらす、それらの側鎖上の反応性ヒドロキシ基を生成する。これは、抗原エピトープと免疫反応性の喪失（ 物質一覧で特異的抗体へのコメントを参照）のマスキングを引き起こす可能性があります。失われた免疫反応性を回復するには、いくつかのエピトープ検索方法は、電子を通じて、そのブレークホルムアルデヒド誘発性タンパク質架橋を存在20を加熱するxposure。このプロトコルでは、クエン酸緩衝法は生後および成体海馬における神経新生の検出（セクション3.3）のために他の人よりも優れて動作します。非常に若い動物のスライス（<P21）は非常に壊れたり、歪んだりとなり、特別な取り扱いに注意する必要があるかもしれないことに注意してください。さらに、検索は、いくつかのエピトープは、したがって、個々の抗体のために有害であるエピトープは、それらがこの前処理を必要とする多重染色するのに適しているかどうかを試験すべきである。
要約すると、このプロトコルは、成人海馬神経発生の分析を容易にする基本と述べた技術の集合体である。これは、特に単一のセクションから増殖または出生デートマーカーと一緒にすべての海馬前駆細胞亜集団の明確な同定を可能にする。これらの技術はhippocamの発達および調節を研究するための抗体または他の種の任意の組み合わせに適合させることができる特定の刺激と特定の脳機能におけるそれらの関与に応じて、PAL前駆細胞。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24-well Cell culture multiwell plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3479 | pre-loaded in 6-well culture plates |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | for 24 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Vectastain Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| Rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
References
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