Abstract
Нейрогенез является строго регулируется, многоступенчатый процесс, в котором новые нейроны генерируются из активированного нервной стволовой клетки с помощью более совершенных промежуточных подтипов предшественников. Каждый из этих подтипов выражает набор конкретных молекулярных маркеров, которые, вместе с конкретными морфологических критериев, могут быть использованы для их идентификации. Как правило, иммунофлуоресцентные методы применяются с участием подтипов специфических антител в сочетании с экзо- или эндогенных маркеров пролиферации. Здесь мы опишем иммунного методы для обнаружения и количественного определения всех этапах взрослого гиппокампа нейрогенеза. Они включают в себя применение тимидина аналогов, transcardial перфузии, обработки ткани, тепло-индуцированной поисковых эпитоп, ABC иммуногистохимических, рассеянный непрямой иммунофлюоресценции, конфокальной микроскопии и сотовый количественной оценке. Кроме того, мы представляем очередную несколько протоколов иммунофлюоресценции, которая обходит проблемы ˙Usually, вытекающие из необходимости использования первичных антител, поднятые в одних и тех же видов хозяев. Это позволяет точно идентифицировать все гиппокампа подтипов предшественников вместе с маркером пролиферации в пределах одного раздела. Эти методы являются мощным инструментом для изучения регуляции различных подтипов предшественников параллельно, их участие в патологий головного мозга и их роль в специфических функций головного мозга.
Introduction
Две области мозга конструктивно генерировать новые нейроны на протяжении всей жизни, субвентрикулярная зона боковых желудочков и субгранулярной зона (SGZ) в зубчатой извилине гиппокампа (ГД). Новорожденные нейроны происходят из нервных клеток-предшественников и пройти через различные этапы морфологического и физиологического развития до достижения зрелости 1,2. С медленно деления радиальной глии, как стволовые клетки (тип 1) последовательных стадий переходные делящиеся клетки-предшественники промежуточных возникает. Более недифференцированные подтипов (тип 2a и 2b типа) имеют неправильную форму с короткими, касательных процессов. Они генерируют нейробласты (тип 3), которые постепенно выйти из клеточного цикла, чтобы стать незрелые нейроны (с дендриты распространялась и на молекулярном слое) и, наконец, интегрироваться в гиппокампе сети, зрелые зернистых клеток. Из-за их особых физиологических особенностей эти клетки обеспечивают схемы с улучшенными пластичность 3 suggesка уникальную роль в гиппокампе функции. На самом деле, исследования последнего десятилетия вызвал значительный доказательства того, что нейрогенез вносит свой вклад в пространственной памяти, разделение образов и эмоционального поведения 4,5.
Нейрогенез может быть изучено с использованием различных подходов. Аналоги тимидина включить в ДНК во время S-фазы клеточного цикла и позволяют рождение знакомств, количественного и судьба анализ новорожденных клеток 6-8. Последовательное применение различных аналогов тимидина (например, CldU, EDU или ПИН) могут быть использованы для изучения обновление клеток или клеточных популяций, родившихся в различные моменты времени в ходе эксперимента 9. Альтернативный, эндогенный маркер клеточной пролиферации является Ki67. Это выражается в делящихся клетках на всех этапах клеточного цикла (G1, S, G2, M), за исключением фазы покоя (G0) и в начале G1 10,11. Для анализа фенотипа новорожденных клеточных популяций у взрослых dentatе извилины несколько сценических конкретных молекулярных маркеров может быть использован, например, GFAP, нестина, DCX и NeuN 1,6. GFAP является маркером зрелых астроцитов, но также выражается в радиальной глии-подобные клетки во взрослом переднего мозга. Нестин представляет собой промежуточный нити, характерные для радиальных глиальных клеток, как и в начале промежуточных клеток-предшественников. DCX является ассоциированный с микротрубочками белок экспрессируется в промежуточных предшественников, нейробластов и незрелых нейронов. На основании (со) выражения этих трех маркеров и морфологических особенностей меченых клеток четыре различных подтипов клеток-предшественников можно выделить: тип 1 (GFAP +, нестин +, DCX -), тип 2а (GFAP -, нестин + , DCX -), тип 2б (GFAP -, нестин +, DCX +) и 3 (GFAP -, нестин -, DCX +) 1. Co-маркировка DCX вместе с NeuN, которая выражается в постмитотических нейронов, позволяет дифференцировать immaturе (DCX +, NeuN +) и зрелых (DCX -, NeuN +) гранул нейроны.
Указанные выше маркеры часто используются для иммунофлуоресцентным сотрудничества маркировки и последующего конфокальной микроскопии, чтобы проанализировать количество и личности новорожденных клеток. Это обычно требует антител из различных видов хозяев, чтобы предотвратить нежелательное антител перекрестной реактивности. Тем не менее, большинство первичных антител, пригодных для исследования нейрогенеза поднимаются либо у кроликов или мышей (например, мыши α-BrdU, мыши α-NeuN, кролика α-Ki67, кролика α-GFAP). Это приводит к серьезным ограничениям в количестве и комбинации антигенов, которые могут быть оценены в одной секции. Это, в свою очередь, не только увеличивает усилие окрашивания, а несколько окрашивание должны быть выполнены, но также может поставить под угрозу достоверность результатов. Кроме того, некоторые антигены, восприимчивы к фиксации формалином индуцированных эпитопа маскировки (например, Ki67, Нестин). Здесь мы опишем изменения от классических протоколов единичного и множественного иммунноокрашивания (например, поиск эпитоп, несколько последовательный иммуноокрашивание, использование нестин-GFP трансгенных мышей 12), что преодолеть многие из этих проблем. В частности, протокол последовательного многократного иммунофлюоресценции позволяет окрашивание против до четырех различных антигенов, даже если часть антител, полученных из того же хоста. Это дает возможность одновременно регистрировать типа 1, типа 2а, 2b типа и клеток типа 3-предшественников, а также их пролиферативную активность в течение одной секции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры, связанные с живых животных были проведены в соответствии с директивой ЕС 86/609 / EEC руководящие принципы по уходу и использованию лабораторных животных и утвержденной местным комитетом по этике (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit унд Verbraucherschutz).
1. внутрибрюшинного введения тимидина аналогов
- Взвешивание животных день перед инъекцией. Рассчитайте количество аналога тимидина, необходимое для всех инъекций запланированных на следующий день, а также отдельных весовых поправкой объемов инъекции 10 мг / мл маточного раствора.
- Подготовка 10 мг / мл маточного раствора тимидина. (ВНИМАНИЕ! Аналогов тимидина являются токсичными. Следуйте конкретные Паспорта безопасности (MSDS), предоставленные поставщиками, т.е. носить халат и перчатки, использовании химических вытяжку).
- Возьмите аналог тимидина из морозильной камеры и довести его до комнатной температуры, ок. 21 ° С. Взвешивание 10 мг и добавитьстерильный физиологический раствор (для BrdU и CldU) или 0,04 N NaOH (в стерильном физиологическом растворе; для ПИН), вихревые. Место для по крайней мере 10 - 15 мин на водяной бане 50 ° и вихря каждые 2 - 3 мин для растворения порошка.
Примечание: использование решения для до 24 ч при хранении при комнатной температуре и в течение нескольких недель при -20 ° С. Защитите решения от света (крышки алюминиевой фольгой). Всегда проверяйте осадков и вновь растворяются, если необходимо.
- Возьмите аналог тимидина из морозильной камеры и довести его до комнатной температуры, ок. 21 ° С. Взвешивание 10 мг и добавитьстерильный физиологический раствор (для BrdU и CldU) или 0,04 N NaOH (в стерильном физиологическом растворе; для ПИН), вихревые. Место для по крайней мере 10 - 15 мин на водяной бане 50 ° и вихря каждые 2 - 3 мин для растворения порошка.
- Задержите курсор за шкирку и внутрибрюшинно вводят соответствующий, вес с поправкой на объем исходного раствора (при комнатной температуре) с помощью тонкой дозировки шприца с 30 G иглой.
Примечание: В случае CldU и ПИН должны быть введены последовательно в течение того же животного, считают вводят эквимолярные концентрации (например, 42,5 мг / кг CldU и 57,5 мг / кг ПИН, которые соответствуют 50 мг / кг BrdU). Таким образом, отрегулировать громкость инжекцион- 10 мг / мл исходных растворов соответственно.
2. Подготовка ткани
- ПреRe 4% формальдегида в 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4 в день перед перфузии. Хранить при 4 ° С.
- Транскардиальную заливать глубоко под наркозом мышей (3,5% изофлуран) через левый желудочек с помощью 10 мл охлажденного льдом PBS, а затем с 40 мл охлажденного льдом формальдегида (скорости потока 5 мл / мин). Рассеките мозг и пост-исправление в том же фиксаторе в течение 24 ч при 4 ° С.
- Передача мозги последовательно в 10% (24 ч при 4 ° С) и 30% сахарозы (до раковины мозга, прибл. 48 ч). Для замораживания, медленно погрузить криопротекции мозги в -25 ° C изопентан, пока не было пузырей появляются из ткани. Хранить при -80 ° С.
- Вырезать корональные разделы 40 мкм толщиной на морозный микротоме (температура блока при -25 до -16 ° C). Перевод Последовательно секций, в которых антифриза раствора, содержащего лунки для культивирования клеток пластины 24-а (рисунок 1). Хранить при -20 ° С.
Рисунок 1. Схематическое изображение передачи микротомных ломтики в 24-луночного планшета. Начало в А1 и поместите последующие ломтики в строке А, после A6 перейти к следующей строке Б и так далее. При достижении D6, вернуться к A1 и продолжить. Такое расположение ломтиками позволяет для количественного определения каждого п-го участка всего мозга. Для количественного новорожденных клеток принимать все 6-го отдела головного мозга (в эквиваленте к содержанию одного столбца), для иммунофлуоресценции фенотипирования принять все 12-го отдела (эквивалент содержания 2 чередующихся строк одного столбца).
3. Иммуноокрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: разделы обрабатываются свободное плавание, как правило, в 6-луночные планшеты оснащены несущей пластиной и сетчатыми вставками. В качестве исключения, блокирование, антител инкубации и реакция ABC сделаны в 12-ти или 24-луночных планшетах без сетчатыми вставками (от 0,5 до 1 мл на Wлокоть достаточно, в зависимости от числа срезов, которые должны быть окрашены). Во время этих шагов, трансфер разделы с помощью тонкой кистью (полоскания с каждым новым раствора). Все инкубации сделали при непрерывном перемешивании (макс 150 мин).
- Иммуногистохимия (метод АВС)
- Передача участков с антифризом в TBS и тщательно промыть (один раз O / N при 4 ° С, 5 раз при комнатной температуре в течение 10 мин каждый), чтобы полностью удалить антифриз.
- Выдержите в течение 30 мин в 1,5% H 2 O 2 в TBS-T, чтобы утолить активности эндогенной пероксидазы. Обратите внимание на спокойный и вновь погрузиться разделы, если необходимо. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
- Дополнительно: В то же время подогрева нагревательный шкаф и 2 N HCl до 37 ° C. Инкубировать срезы в течение 30 мин при 37 ° С в 2 N HCl к денатурации ДНК. Мягко отдельные разделы с помощью кисти.
- Дополнительно: Нейтрализовать секции в течение 10 мин в 0,1 М боратного буфера, рН8.5, RT. При перемещении кратко тампоном сетчатые вставки, содержащие разделы по бумажным полотенцем, чтобы удалить объедки HCl. Промойте 2 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
- Выдержите в TBSplus к проницаемыми ткани, а также заблокировать неспецифических сайтов связывания антител, 1 ч при комнатной температуре.
- Выдержите в первичных антител разводят в TBSplus, о / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
- Инкубируют в биотинилированного вторичного антитела, разбавленного в TBSplus, 3 ч при комнатной температуре. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый. Тем временем ...
- Подготовьте ABC комплекс в соответствии с протоколом производителя (1% + 1% B в TBS-T). Оставляют на 30 минут при комнатной температуре перед использованием. Инкубируйте разделы в АБ реагента в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
- Подготовка 50 мл 0,5 мг / мл DAB в TBS-T в 6- или 12-луночный планшет, разделен на две половины и пипетки 4 мл или 2 мл на лунку, соответственно. Передача части в DAB раствора (ВНИМАНИЕ! DAB токсичен. Последующие за УдельныйС MSDS, предоставляемые поставщиком, то есть носить халат и перчатки, использовать химическую вытяжку).
- Добавить 0,5 мл 1% H 2 O 2 в оставшихся 25 мл раствора DAB, перемешать и пипетку эквивалентные объемы, как описано выше в каждую лунку, чтобы начать реакцию с пероксидазой. Инкубировать в течение 12 мин. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
- Mount разделы к слайдам желатина, сухой воздух O / N. Покровное с постоянным монтажа среды.
- Дополнительно: контрастное до размещения покровное (см раздел 3.5).
Примечание: Если отношение сигнал-шум является низкой из-за высокого фона, повторите H 2 O 2 лечение после инкубации с АБ реагента (этап 3.1.8).
- Multiple-иммунофлюоресценции
- Одноместный или одновременно несколько иммунофлюоресценции
- Передача участков с антифризом в TBS и тщательно промыть (один раз O / N при 4 ° С, в 5 раз при КТ в течение 10 мин каждый), чтобы полностью удалитьtifreeze.
- Дополнительно: как шаги 3.1.3 - 3.1.4.
- Выдержите в TBSplus к проницаемыми ткани и блокировать неспецифические сайтов связывания антител, 1 ч при комнатной температуре.
- Инкубируют в коктейль первичного антитела (например, крысы α-BrdU, морской свинки α-DCX, коз α-GFP), разбавленного в TBSplus, O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
- Выдержите в коктейль флуорохромом-сопряженных вторичными антителами (например, родамин красный α-крыса, Alexa-647 α-морскую свинку, Alexa-488 α-коза, все происходит в осла), разбавленный в TBSplus, 3 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Отныне защитить разделы от света. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 минут каждый.
- Mount разделы к слайдам желатина, сухой воздух O / N. Покровное водным монтажной среды.
- Последовательное многократное иммунофлюоресценции с первичными антителами из того же вида-хозяина
- Как шаги 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
- Выдержите в Интернетпервый первичное антитело (например, кролика α-антиген), O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Выдержите в первом флюорохром-сопряженных вторичными антителами (например, родамин красный-Conj. Осел α-кролик), 3 ч РТ. Отныне защитить разделы от света. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Инкубируйте в 10% нормальной сывороткой же хосте, что первичными антителами (например, сыворотки кролика) в течение 3 ч, чтобы насытить RT открытые paratopes на первом вторичного антитела. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Инкубируют в TBSplus с 50 мкг / мл неконъюгированного одновалентные фрагменты Fab, направленные против множества первичных антител (например, α-кролика IgG (H + L)), чтобы покрыть эпитопы, которые могут быть признаны второй вторичными антителами, O / N в 4 ° С.
- Промыть по крайней мере 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 минут каждый. При перемещении кратко SWAб сетчатые вставки, содержащие разделы по бумажным полотенцем, чтобы удалить любые объедки Fab.
- Инкубируют на втором первичного антитела (например, кролика α-антиген B), O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Выдержите на втором флюорохром-сопряженных вторичными антителами (например, Alexa-488-Conj. Осел α-кролик), 3 ч РТ. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 мин каждый, монтировать и покровное, как описано выше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обозначения антигенов с антителами от различных видов хозяев, добавить их к шагу 3.2.2.2 и соответствующие вторичные антитела к шагу 3.2.2.3.
- Одним из вторичных антител из одного вида в качестве одного из первичных антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол подходит для четверного окрашивания с ВДУ или Ki67 вместе с GFAP, нестина-GFP и DCX.- Строго придерживайтесь шаги протокола 3.2.1.1 - 3.2.1.5. До этого момента не использовать только осла сыворотки в TBSplus.
- Выдержите в ТBSplus содержащий 3% козьей сыворотки в течение 1 ч при комнатной температуре. Это охватывает открытые paratopes на α-коза вторичного антитела. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Выдержите в AMCA-Conj. козы α-кролика разводили в TBSplus, 3 ч РТ или O / N 4 ° C. Промыть три раза в TBS в течение 15 мин каждый, монтировать и покровное, как описано выше.
- CldU, ПИН совместно окрашивание
- Промыть, денатурации и нейтрализации разделы, как описано в разделе 3.2.1 (шаги 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
- Инкубируют при 20 мкг / мл неконъюгированного Fab фрагментов α-мыши IgG (H + L) в TBSplus, 1 час при комнатной температуре. Промыть 4 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Инкубируют в коктейль первичного антитела, содержащего крысы α-BrdU (1: 400; очищают IgG2) и мышь α-BrdU (1: 350), разведенного в TBSplus, O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Выдержите в коктейль вторичного антитела, содержащий биотинилированные осла α-крыса (1: 500) и FITC-Conj. осла α-мыши Fab-фрагменты (1: 100). Промыть 3 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 мин каждый.
- Выдержите в Родамина Red-Conj. Стрептавидин, 2 ч при комнатной температуре. Промыть 3 раза в TBS в течение 15 мин каждый, монтировать и покровное, как описано выше.
- Усиление сигнала флуоресценции у мышей нестин-GFP
- Добавить коз α-GFP в коктейль первичных антител.
- Добавить Флуорохром сопряженную вторичного антитела со спектральными свойствами, аналогичными свойствам GFP (например, Alexa 488 Conj. Осел α-козла) коктейлю вторичного антитела.
- Одноместный или одновременно несколько иммунофлюоресценции
- Поиск Epitope
- Провести поиск эпитоп после смывания антифриз. Предварительный нагрев пароход с 6- или 12-луночные планшеты, содержащие 0,1 М цитратного буфера рН 6,0 в 95 - 99 ° С (приблизительно 25 мин).
- Передача участков в горячую цитратном буфере и пара в течение 30 мин (покрывать пластины с алюминиевой фольгой, как пластиковый лIDS не термостойких).
- Сразу же место пластины на бане со льдом, чтобы остыть. Это помогает защитить ткани морфологию, которая имеет особое значение при работе с срезах мозга постнатального животных.
- Промыть 3 раза в TBS в течение 10 минут каждый, чтобы промыть и обезвредить цитрат и продолжить окрашивание.
- Мышь антител на мыши ткани
- Добавить 20 мкг / мл одновалентные фрагменты Fab α-мышь IgG (H + L; те же хост-видов, чем вторичного антитела), чтобы на первом этапе блокирующим (например, шаг 3.1.5 или 3.2.1.3).
- Промойте 4 раза в TBS и один раз в TBS-T в течение 10 минут каждый, и заполните соответствующей протокола.
- Cresyl фиолетовый counterstaining
- Разогреть крезил фиолетовый раствор до 60 ° С (в стеклянной банке). Выдержите слайды в горячем растворе в течение 3 мин.
- Полоскание в н. Dest. и обезвоживают 2 раза по 1 мин каждый в 70%, 96% и 100% изопропанола. Ясно в течение 5 - 6 мин в ксилол или замены ксилола и покровного с совместимым постоянного крепления среды.
Анализ 4. Данные
- Количество пероксидазой окрашенных клеток новорожденных в каждой 6-й секции по всей рострокаудального степени зубчатой извилине. Используйте световой микроскоп в 400 раз увеличения.
- Умножьте полученные числа клеток с интервалом пересечения, чтобы получить оценку общего числа новорожденных клеток.
- Изображение флуоресценции помечены участки с конфокальной лазерной микроскоп оснащен соответствующими лазеров и систем фильтрации. Возьмите стеки в случайных позициях вдоль всей протяженности зубчатой извилине в 400 раз увеличения и анализировать, по крайней мере 50 случайно отобранных клеток, представляющих интерес в полушарии сотрудничества маркировки с другими маркерами.
- Умножьте полученные проценты СО-меченых клеток (% / 100) с общим числом новорожденных клеток для расчета абсолютнойчисло конкретных групп населения новорожденных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы применили методы, описанные выше, чтобы количественно определяет и характеризует новорожденных клеток в послеродовом и взрослых гиппокампа. Поэтому мы использовали дикого типа и нейрогенез с дефицитом циклин D2 выбить (Ccnd2 Ko) мышей содержали в условиях, известных влияют на скорость нейрогенеза (т.е. среде, обогащенной, EE) 13,14. Иммуногистохимическое окрашивание DAB против любой Ki67, ВДУ, CldU или ПИН последовательно выявлены различия в новорожденных числа клеток между дикого типа и Ccnd2 KO мышей (рис 3) 15. Кроме того, с последовательными эквимолярными инъекций CldU и ПИН мы были способны различать популяции клеток, родившихся в определенные периоды EE (рис 3C, D). Принятие раздел 3.2.4 мы могли успешно обнаруживать равные интенсивности сигнала и отличное перекрытие CldU и ПИН после их одновременной доставки (рисунок 4). BrdU помечены новорожденных клетки могут быть phenotyped с StanМетод Dard иммунофлюоресценции либо одновременно с применением BrdU и NeuN, (рис 5) или BrdU, GFAP, нестина-GFP и DCX антител (рис 6б). Этот метод позволил удачливый тип идентификации 1, 2а, 2b и 3 клетки-предшественники в течение одного образца (рис 6В, D). Co-маркировка Ki67 с маркерами предшественников требуется последовательное применение антител в качестве первичных антител против Ki67 и GFAP были подняты в кролика (применяется к разделу 3.2.2), причем один из первичных антител (козы α-GFP) был произведен в же хосте, что один из вторичных антител (AMCA Conj. козий α-кролика). Сочетание секций 3.2.2 и 3.2.3 прекрасно работает, если срезы инкубировали в первом Ki67 вместе с нестин-GFP антитела, а во-вторых, в GFAP антителом, но не наоборот (рис 6C). 2В приведены схемы, одобренные приложения.
Рисунок 2. Последовательное многократное иммунофлюоресценции с первичными антителами, полученными от тех же видов хозяев. () Схематическое изображение. (B) Успешные комбинации антител и их хронологической последовательности в иммунофлюоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3. световой микроскопии изображения ABC-иммуногистохимии для определения количества новорожденных клеток в зубчатой извилине. Изображен являются сравнение различных маркеров пролиферации в WT и нейрогенеза-дефицитных мышей KO Ccnd2 на 100X и 400X увеличении. (А) г> окрашивание Ki67-ДАБ показывает кластеры пролиферирующих клеток в зоне зернистым зубчатой извилине (постнатальный день 35). Количество пролиферирующих клеток уменьшается в Ccnd2 KO мышей по сравнению с мышами, мас. (B) Новорожденные клетки в 28 дней после BrdU-администрирования (схемы впрыска над образами), подтверждающего льготный тариф оружия у мышей Ccnd2 КО. (C) CldU введение в течение 6-й недели ЭО (схема впрыска картинке) показал увеличение числа новорожденных клеток в зубчатой извилине WT, но не Ccnd2 KO мышей. (D), ПИН-введение в течение восьмой недели EE показали сходные результаты. Масштабная линейка представляет 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
fig4.jpg "/>
Рисунок 4. Иммунофлуоресценции совместно окрашивание CldU и ПИН после одновременной доставки эквимолярных концентрациях. Сигнал усиления CldU меченых клеток в результате отличной перекрытия CldU и ПИН. Масштабная линейка представляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5. Иммунофлуоресценции совместно маркировка NeuN и ВДУ. (А) вводили BrdU 6 раз в 8 ч в течение 2 дней подряд, начиная с постнатальный день 14. Животных умерщвляли через 28 дней. (Б) иммунофлуоресценции совместно маркировка пролиферирующих клеток со зрелой нейронов маркер NeuN показывает уменьшенное количество пролиферирующих клетки в Ccnd2 нокаутом сравнению с WT животных. Шкала бар представляет 50 мкм. (С) Увеличенное изображение (B) показывает ко-меченых клеток в обоих генотипов. Шкала бар представляет 20 мкм. (D), например, высокий коэффициент увеличения из BrdU / NeuN совместно обозначены клетки в зубчатой извилине. Масштабная линейка представляет 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6. Четырехместный иммунофлюоресценции со-маркировки различных маркеров пролиферации с GFAP, нестин-GFP и DCX для новорожденных фенотипирование зернистых клеток в зубчатой извилине мышей нестин-GFP. (А) вводили BrdU 3 раза каждые 2 ч при 70 день постнатального . Животных умерщвляли 2 ч позже. (B) представитель образ совместным окрашиванием для ВДУ, GFAP,нестин-GFP и DCX. (C) представитель образ четверной иммунофлюоресценции Ki67, GFAP, нестина-GFP и DCX. (D) Классификация видов клеток-предшественников в соответствии с их иммунофлюоресценции маркировки. На основе совместной экспрессии различных маркеров и морфологических особенностей меченых клеток четыре различных подтипов клеток-предшественников можно выделить: тип 1 (GFAP + + нестин, DCX -), тип 2а (GFAP -, нестин +, DCX - ), тип 2б (GFAP -, нестин +, DCX +) и 3 (GFAP -, нестин -, DCX +). Масштабная линейка составляет 20 мкм. (E) схематический обзор различных этапах взрослого гиппокампа нейрогенеза. Это иллюстрирует типы 4 клеток-предшественников, незрелых нейронов и зрелых гранулярных клеток, их характеристика экспрессии маркеров и их способность к пролиферации. ML - молекулярный слой клеток, ВКТ -зернистый слой, SGL -. субгранулярной слой клеток Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7. Пример успешных и неуспешных последовательных окрашивания с двумя первичными антителами в тех же видов, в зависимости от последовательности антитела инкубации. Конфокальной микроскопа показывают результаты последовательной совместным окрашиванием против Ki67 и GFAP с первичными антителами и происходит от кролика. В (А) иммуногистохимии впервые завершены GFAP с последующим окрашиванием с Ki67 что привело к выраженному перекрытия двух сигналов. В частности сигнал Ki67 был атипичным и напоминал сигнал окрашивания GFAP. (В) показаны результаты с обратнойОкрашивание последовательность с окрашиванием Ki67 завершена первая и последующим окрашиванием против GFAP. Здесь сигналы для обоих антигенов напоминал ожидаемый характер экспрессии: сигнал Ki67 был ограничен ядрами в субгранулярной зоне в то время как сигнал GFAP был найден cytoplasmatically, в основном в клеточных процессах, вытекающих из субгранулярной зоне. Масштабная линейка составляет 20 мкм. RHX - родамин X. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 8. Специфичность антител α-BrdU, используемых для обнаружения CldU и ПИН. Мышам вводили либо с CldU или ПИН (не одновременном применении). В (А) срезах мозга CldU (A1) или (A2 ПИН) вводили мышам были IMMUnostained с использованием антитела Очищенный крысиный α-BrdU, которые должны специально перекрестную реакцию с CldU, но не ПИН. (В) показаны результаты окрашивания мозги от CldU (B1) или ПИН (В2) вводили мышам с помощью мыши α-BrdU антитело, которое, как ожидается, перекрестно реагируют с ПИН, но не CldU. Масштабная линейка представляет 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Количественная и идентификация субпопуляций новорожденных клеток является центральным вопросом во взрослой исследований нейрогенез. Сочетание распространения маркеров и антител против белков, высказанных в ходе определенных этапах взрослого нейрогенеза позволяет иммуногистохимическое выявление этих групп населения. Некоторые из антител или их комбинаций антител требуют особых условий окрашивания.
Маркировка деления клетки с синтетическими аналогами тимидина еще золотой стандарт для изучения взрослых гиппокампа нейрогенеза. Это важно рассмотреть соответствующий протокол впрыска до начала эксперимента. Как правило, мы администрирования 50 мг / кг (массы тела, внутрибрюшинно) BrdU, но концентрация может отличаться в зависимости от экспериментальных условий (до 300 мг / кг в течение болюсной инъекции) 8,16. Если ПИН и CldU должны быть введены последовательно для временного дискриминации клеточных популяций является обязательным для введения эквимолярных концентрациях (
Для иммунным, участки, как правило, обрабатываются в свободном обращении, как правило, в 6-луночных планшетах, оснащенных несущей пластины и сетки вставки что упрощает их переход от одного решения к другому. В качестве исключения, блокирование, антител инкубации и реакция ABC сделалив 12- или 24-луночные планшеты без сетки вставок экономить дорогие решения (от 0,5 до 1 мл на лунку достаточно, в зависимости от числа срезов, которые должны быть окрашены). Во время этих шагов, трансфер разделы с помощью тонкой кистью, которая должна быть промыта при смене решений. Предотвращение разделы из высыхания и выполнять инкубации, которые принимают> 1 час в гумифицированных камеры. Все инкубации должно быть сделано при непрерывном перемешивании (макс 150 оборотов в минуту). Всегда проверяйте и титруют каждый новый антител много. Более длительное время антитела инкубации (до 2 дней при 4 ° С) может улучшить окрашивание. В случае только антитела мыши доступны против антигенов, которые вы хотите визуализировать мыши ткани желательно, чтобы блокировать эндогенных иммуноглобулинов с высокой концентрацией одновалентных Fab фрагментов α-мыши (раздел 3.4). Всякий раз, когда с помощью этой техники распространить следующие шаги полоскания. В противном случае, несвязанные Fab-фрагменты могут связываться с вашей основной мышиного антитела. Предварительная обработка HCl и боратнейтрализация требуется только для обнаружения аналогов тимидина. Реакционную пероксидазой 12 мин приводит к оптимальным соотношением сигнал-шум с условиями и антител, используемых в нашем протоколе. Как и в любом ферментативной реакции, скорость реакции пероксидазы зависит от многих факторов (например, температуры, рН, концентрации фермента и субстрата). Следовательно, время реакции должны быть оптимизированы для любого нового набора антител. Для визуализации анатомических структур в пятен DAB с очень слабым фоном (например, CldU), срезы могут быть контрастным. Метод крезил фиолетовый описано в разделе 3.5 результаты в очень слабой контрастирующая, чтобы не скомпрометировать конкретный сигнал DAB.
Для многократного иммунофлюоресценции, используйте первичных антител, которые подняты в различных видов или разных изотипов и следуйте раздел 3.2.1. В противном случае, выполнить последовательный несколько иммунноокрашивания которая оптимизирована для обнаружения нескольких первичных антителиз тех же видов хозяев (например, мыши или кролика, а в разделе 3.2.2). Основной принцип этого метода была изобретена Фергюсон и коллег, которые успешно окрашенных различные маркеры мышц с двух мышей первичных антител 17. ФАБ фрагменты, используемые для блокировки в шаге 3.2.2.5, должны быть получены из одних и тех же видов хозяев в качестве вторичного антитела. Концентрации и время инкубации, описанных в разделе 3.2.2 оптимизированы для специфических антител, описанных здесь, и должны быть скорректированы для любой новой комбинации антител. Помните, что последовательность первичного инкубации антитела могут сильно повлиять на исход (как показано на рис 7А). Везде, где это применимо, антигены, обнаруженные первичными антителами, которые получены из одних и тех же видов должны показать другой характер экспрессии, который упрощает обнаружение недостаточной блокировки. Для устранения любой возможности антител кросс-реакции или ложных срабатываний это Эссентомобиля включать соответствующие элементы управления (то есть только вторичным антителом контроля; полный иммуногистохимии для первого антигена с последующей инкубацией со вторым первичным антителом или только второй вторичным антителом). 18 Рисунок 2B показывает антител комбинации, которые хорошо зарекомендовали себя в наших руках. Для многократного иммунофлюоресценции целесообразно также использовать вторичные антитела, которые выращиваются в тех же видов (например, осел) и имеют минимальный перекрестную реактивность к вашей ткани и сывороточных белков из других видов (например, предварительно адсорбированных). В противном случае раздел 3.2.3 может помочь предотвратить любые неожиданные межвидовой перекрестной реактивности. Выберите флуорохромии с минимальным спектральной перекрытия, подходящий для вашей системы обнаружения (например, AMCA, Alexa Fluor 488, родамин красный, Alexa Fluor 647). Если ядерный контрастное требуется добавить DAPI или Hoechst 33342 (10 мкг / мл) в коктейле вторичным антителом (то, без ближней УФ-вторичное антитело может быть намиред). Эти ядерные counterstains не работают, если ткань была предварительно обработана с HCl. Кроме того, лечение HCl может поставить под угрозу обнаружение некоторых антигенов и, следовательно, его влияние на индивидуальной работы антител должна быть проверена. После того, конъюгированное с флуорохромом вторичными антителами были применены их охраны секции от света.
CldU и ПИН могут быть визуализированы с помощью двух различных антител BrdU, которые перекрестно реагируют как с CldU (крысы α-BrdU) или ПИН (мышь α-BrdU) 9,19. Если оба аналоги тимидина были введены в одного животного абсолютно необходимо использовать очищенную крысы α-BrdU антител для обнаружения CldU, потому что неочищенных антител перекрестно реагирует с ПИН. Как описано Vega и др. 9 сигнал CldU должен быть усилен для иммунофлуоресцентного маркировке совместно для достижения эквивалентного обнаружение обеих аналоги тимидина. Таким образом, вместо того, чтобы флуорохромом-конъюгированного второго антитела (α-крыса) флуорохромом конъюгированный стрептавидин добавляют после инкубации в биотинилированного вторичного антитела (α-крыс; раздел 3.2.4). Чтобы исключить любые нежелательные антитела перекрестные реакции включают контроль разделы из мышей, получавших либо ПИН или CldU (отдельно, см рисунок 8). Чтобы проверить эквивалент обнаружения ПИН и CldU использования секций от животных, которые были одновременно вводили эквимолярные количества CldU и ПИН (Рисунок 4).
Для изучения типа 1 и типа 2 клетки-предшественники мы предпочитаем использовать нестин-GFP трансгенных мышей, 12 как нестин антитела часто не дает удовлетворительных результатов. Нестин-GFP мышей имеют преимущество надежно визуализации нестин-позитивные клетки-предшественники и их морфологические особенности на определенном этапе развития. GFP-сигнал должен быть усилен с помощью непрямой иммунофлуоресценции с α-GFP антитела. Вторичное антитело должен быть соединен с fluorochrOMe со спектральными свойствами, подобными GFP. Если требуется, нестин-GFP мышей можно скрещивании с другими мутантных линий мышей проверки причастности конкретных генов в нейрогенеза. К настоящему времени, улучшенные нестин антитела поставляются этикетке которого клеточных тел, а также процессы и может быть использован в качестве альтернативы трансгенного подхода (см список материалов).
Очень важно соблюдать фиксации 24 ч, чтобы предотвратить overfixation. В химической реакции партнеров формальдегида в ткани, прежде всего, белки и формальдегида генерирует реакционноспособные группы гидроксиметил на их боковых цепей, ведущих к сшиванию смежных аминокислот (с образованием метиленовых мостиков). Это может привести к маскирование антиген-эпитопов и потери иммунореактивности (см комментарии к специфических антител в список материалов). Для восстановления потерянных иммунореактивности, несколько методов извлечения эпитоп существуют, которые нарушают формальдегид, вызванных белка перекрестные связи через электроннуюXposure, чтобы нагреть 20. В этом протоколе, метод цитрат буфер работает лучше других для обнаружения нейрогенеза в послеродовом и взрослых гиппокампа (раздел 3.3). Обратите внимание, что кусочки очень молодых животных (<P21) может стать очень хрупкие и искажены и должны быть обработаны с особой тщательностью. Кроме того, поиск эпитоп может быть вредным для некоторых эпитопов и, следовательно, отдельные антитела, должны быть проверены, подходят ли они для многократного окрашивания, что этого требует предварительной обработки.
В целом, этот протокол совокупность основных и разработанных методик, которые облегчают анализ взрослого гиппокампа нейрогенеза. Он, в частности позволяет однозначно идентифицировать всех гиппокампа субпопуляций предшественников вместе с распространением или рождения знакомства маркера от одной секции. Эти методы могут быть адаптированы к любой комбинации антител или других видов, чтобы изучить развитие и регулирование hippocamPAL клетки-предшественники в ответ на специфические стимулы и их участия в конкретных функций мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thymidine analog administration | |||
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU | Sigma-Aldrich | B9285 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | Sigma-Aldrich | C6891 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU | MP Biomedicals | 2105478 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU | MP Biomedicals | 2100357 | toxic (mutagenic, teratogenic) |
| Tissue preparation | |||
| Isoflurane-Actavis | Piramal Healthcare | 700211 | |
| Paraformaldehyde powder (PFA) | Riedel-De Häen | 16005 | toxic, flammable |
| Perfusion pump PD5206 | Heidolph Instruments | 523-52060-00 | |
| Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm | Thermo Fischer Scientific | 06409-13 | |
| Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm | Agnthos | 1036 | |
| Freezing microtome Microm HM 400 | Thermo Fischer Scientific | ||
| 24-well Cell culture multiwell plates | Greiner Bio-One | 662160 | |
| Immunohistochemistry | |||
| Tefal vitacuisine steamer | Tefal | VS 4001 | |
| Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3479 | pre-loaded in 6-well culture plates |
| Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts | Corning | 3477 | pre-loaded in 12-well culture plates |
| Netwell plastic 6-well carrier kit | Corning | 3521 | for 24 mm polyester mesh membrane inserts |
| Netwell plastic 12-well carrier kit | Corning | 3520 | for 15 mm polyester mesh membrane inserts |
| Vectastain Elite ABC kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) | Sigma-Aldrich | D-5637 | carcinogenic, light sensitive |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Primary antibodies | |||
| Rabbit IgG1 α-Ki67 | Novocastra/ Leica Biosystems | NCL-L-Ki67MM1 | DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval |
| Rabbit α-GFAP, AS-3-GF | Synaptic Systems | 173 002 | 1:500 |
| Goat IgG (H+L) α-GFP | Acris Antibodies | R1091P | 1:300 |
| Mouse IgG1 α-nestin | Abcam | ab6142 | 1:200; requires epitope retrieval |
| Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin | Merck Millipore | AB2253 | 1:500 |
| Rat IgG2a α-BrdU (ascites) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030CX | for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400 |
| Rat IgG2a α-BrdU (purified) | AbD Serotec/ Bio-Rad | OBT0030 | for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400 |
| Mouse IgG1 α-NeuN | Merck Millipore | MAB377 | 1:500 |
| mouse IgG1κ α-BrdU | BD Biosciences | 347580 | For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350 |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 711-065-152 | 1:500 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 712-065-150 | 1:500 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin | Dianova | 715-065-151 | 1:500 |
| Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11006 | 1:250 |
| Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A11055 | 1:250 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment | Dianova | 715-097-003 | 1:100 |
| Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 715-605-151 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 | Dianova | 706-605-148 | 1:250 |
| Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 712-295-150 | 1:250 |
| Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 711-295-152 | 1:250 |
| Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X | Dianova | 706-296-148 | 1:250 |
| Streptavidin-rhodamine Red-X | Dianova | 016-290-084 | 1:500 |
| Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA | Dianova | 111-155-144 | 1:250, works only with rabbit α-GFAP |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H3570 | 1:1000 |
| DAPI | Molecular Probes | D1306 | 1:1000 |
| Blocking | |||
| Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) | Dianova | 715-007-003 | 1:20 |
| Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) | Dianova | 711-007-003 | 1:20 |
| Normal donkey serum | Merck Millipore | S30 | |
| Normal rabbit serum | Dianova | 011-000-010 | |
| Normal goat serum | Dianova | 005-000-001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Histology | |||
| Cresyl violet | Sigma-Aldrich | C5042 | |
| Neo-Clear | Merck Millipore | 109843 | non-toxic xylene substitute |
| Neo-Mount | Merck Millipore | 109016 | permanent mounting medium |
| Microscopy | |||
| Axioskop 2 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy | ||
References
- Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27 (8), 447-452 (2004).
- Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586 (16), 3759-3765 (2008).
- Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54 (4), 559-566 (2007).
- Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22 (3), 267-283 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 339-350 (2010).
- Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
- Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21 (3), 803-807 (2005).
- Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2 (3), 167-169 (2005).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182 (3), 311-322 (2000).
- Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40 (1), 2-11 (2002).
- Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11 (9), 1991-1996 (2000).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386 (6624), 493-495 (1997).
- Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384 (6608), 470-474 (1996).
- Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53 (1), 198-214 (2007).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
- Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8 (3), 228-235 (2000).
