Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.
Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm’s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.
Den globala kycklingproduktionen har ökat tiofaldigt under de senaste 50 åren med utvecklingsländerna värd nästan fyra gånger expansionen bevittnat i den utvecklade världen (www.faostat.org) . Som relevansen av kycklingproduktion till globala livsmedelsförsörjningen har ökat så har också den profil av patogener som kan orsaka allvarlig sjukdom hos kycklingar. Ett utmärkt exempel är de Eimeria-arter, ubiquitous protozoiska parasiter som kan orsaka den enter sjukdomen koccidios 1. Varhelst kycklingar föds upp en eller flera Eimeria arter kommer sannolikt att vara vanliga 2-4. I den utvecklade världen Eimeria främst styrs av kemoprofylax, anställa transporttjänster eller rotationsprogram för att minimera effekterna av motståndet 5. Levande vacciner används också i system där fågelvärdet är tillräcklig för att motivera kostnaden (t.ex. avelsdjur, lager och några broilers 5). Som Result av dessa åtgärder klinisk koccidios ofta väl kontrollerade, även subklinisk infektion är vanligt 5. I utvecklingsländerna vaccinering är sällsynt och drogansökan ofta mindre välinformerade. Som en konsekvens subklinisk och klinisk koccidios är vanligare och har ett betydande ekonomisk effekt 3.
Diagnos av eimerian infektion har traditionellt förlitat sig på lesion scoring efter slakt, men även författarna till den mest använda poängsystem kommenterade att för vissa arter "det verkar tveksamt om ett sådant förfarande bör försök i några men måttligt svåra infektioner" 6. Kompletterande bevis kan samlas in genom mikroskopisk detektering av miljötålig oocyst livscykel stadium i fekala eller strö prover, även om överlappande morfologi kan förbrylla alla utom experten 6,7. Molekylära alternativ använder polymerase chain reaction (PCR), slumpmässig amplification av polymorf DNA PCR (RAPD-PCR) och kvantitativa PCR-teknik har funnits i upp till 20 år 8-10, men hittills har de misslyckats med att bli populär. Relativ kostnad och kravet på specialistlaboratorieutrustning eller behandling har begränsat deras upptag, trots den ofta subjektiva och tekniskt krävande natur äldre pathology- och mikroskopi baserade strategier 10,11. Sådana begränsningar kan överdrivas i många av de fattigare regionerna i världen, såsom Sydostasien, där effekten av koccidios på fattigdom kan vara proportionellt större 12. Som svar finns det en tydlig efterfrågan på ny enkel och känslig, men kostnadseffektiva, Eimeria artspecifika diagnostiska analyser.
Loop-medierad isotermiska förstärkning (LAMP) är en lätt att förbereda DNA-polymeras driven teknik som kan förstärka stora mängder DNA. Viktigast använder LAMP en Bst DNA PolymeraSE istället för Taq-DNA-polymeras som vanligen användes i PCR, vilket underlättar DNA-amplifiering vid en enda konstant temperatur utan krav på termisk cykling 13,14. LAMP kan vara mottagliga för tillämpning i även de mest rudimentära laboratorium eller i fält. Kännetecknas av relativ resistens mot många PCR-inhibitorer, hög känslighet och specificitet, har LAMP analyser utvecklats för ett brett spektrum av patogener inklusive smitt bursasjukdom virus, Clostridium perfringens och Cryptosporidium 15-17. Som svar på efterfrågan på nya kostnadseffektiva Eimeria artspecifika diagnostik en panel av LAMP-analyser som är specifika för var och en av de sju Eimeria arter som infekterar kycklingar har utvecklats 18. Ansökningar om nya analyser inkluderar övervakning parasit förekomst, av särskilt värde med tanke på sammanslutning av arter som Eimeria maxima eller Eimeria necatrix med dålig ekonomisk performance 3,4. Andra tillämpningar inkluderar bedöma effekten av en gårdens anticoccidial strategi, diagnos av subklinisk infektion eller klinisk sjukdom och utvärdering av risk som Eimeria till en gård.
The Eimeria species-specific LAMP assays described in this paper offer a new diagnostic tool kit in support of effective control of coccidia and the disease coccidiosis. The outcomes of eimerian infection can include severe economic loss as well as seriously compromised bird welfare and increased susceptibility to colonisation by zoonotic pathogens21. Opportunities to monitor flocks for the occurrence of some, or all Eimeria species can provide early warning of a breakdown in anticoccidial control efficacy. Key advantages of LAMP include robust target specificity, resulting from the requirement for six different DNA sequence targets, as well as high sensitivity, boosted by the inclusion of loop primers13, although the qualitative, not quantitative nature of LAMP may be considered a limitation. It is not currently possible to discriminate low level parasite escape from routine chemoprophylaxis or live vaccine replication from unchecked eimerian replication. Nonetheless, the technical ease of the protocol and definitive readout offers considerable improvement over the existing specialist and frequently subjective pathology- and morphology-led approaches6,7. Each assay may be completed at a cost of ~£0.75 per sample, independent of labour and equipment set up expenses. Thus, LAMP assays are also more cost effective than other molecular diagnostics such as PCR, since they require an isothermal incubation with no need for specialist equipment.
For many years access to Eimeria genomic DNA as template has limited the development and application of molecular field diagnostics. The oocyst is the most readily accessible phase of the eimerian lifecycle, but routine DNA extraction requires laboratory facilities22. Other, more labile intestinal lifecycle stages require purification prior to DNA preparation to prevent PCR inhibition and a consequent loss of sensitivity23,24. The ability to extract eimerian DNA of a quality suitable for LAMP using equipment no more specialised than a microcentrifuge and a water bath, supplemented by inhibitor adsorption using chelex resin, now promotes the wider use of molecular biology in eimerian diagnostics. Intriguingly, the reported detection of quantitative PCR-measurable Eimeria DNA in intestinal tissue 20 days after the initiation of parasite infection, 11 days after the last detectable oocyst output, raises the suggestion that LAMP may be used to detect resolved parasite exposure as well as ongoing infection, even after any visible lesions may have been resolved25.
The relatively low cost and low technical requirements of LAMP Eimeria diagnostics can promote their application in the developing world where other more established approaches may not be available or appropriate. For this to be applicable each assay must be capable of detecting all strains which may be circulating within each region. While understanding of the genetic diversity prevailing among Eimeria species is limited26, the use of target sequences previously validated for use in quantitative PCR with strains from Africa, Asia, Europe and South America provides some evidence of conservation, supporting the utility of these LAMP assays around the world10.
The authors have nothing to disclose.
The work carried out in this study was supported in part by the Royal Veterinary College through the student research projects fund, as well as the Biotechnology and Biological Sciences Research Council and the Department for International Development (grant number BB/H009337/2). This manuscript has been assigned the reference PPB_00795 by the RVC.
Name | Company | Catalogue number | Comments |
RNAlater | Ambion | AM7024 | |
Ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | Caution, highly flammable |
100 x Tris-EDTA (TE) buffer concentrate | Sigma-Aldrich | T9285 | |
Chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-1253 | |
Molecular grade water | Invitrogen | 10977035 | |
E. acervulina F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTAACATTTCGCTTCACGGAC |
E. acervulina B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATGAGCAAGTGGAACACCTTG |
E. acervulina FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT |
E. acervulina BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG |
E. acervulina LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TAAGGTTACACCCGTGGAGG |
E. acervulina LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCATGCACAAAGCGACTT |
E. brunetti F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GGCCATCAAGTTCCATGAGC |
E. brunetti B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCAACCTCCTGAGTGTGGTT |
E. brunetti FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT |
E. brunetti BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC |
E. brunetti LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAACGCTCGAACATGGC |
E. brunetti LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CTTCTCCACAGACCCAGAGGT |
E. maxima F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT |
E. maxima B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG |
E. maxima FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG |
E. maxima BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA |
E. maxima LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CAAGCCTACGCGGACATC |
E. maxima LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TTATGCAGCTGGGTCAACG |
E. mitis F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ACGATAGCCAAGACACGTAAGG |
E. mitis B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA |
E. mitis FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT |
E. mitis BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG |
E. mitis LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCCATGCATCCCCTTGTT |
E. mitis LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGTGGGCACAGATTGATTC |
E. necatrix F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TGGCTTTCCCGCGTACC |
E. necatrix B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGGCCCAACACAAAGACTG |
E. necatrix FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA |
E. necatrix BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC |
E. necatrix LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTCTGTAACTTGGGACGTTGT |
E. necatrix LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAACAGCCGGAGCCTCTC |
E. praecox F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT |
E. praecox B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCGCACGAATCTGAATCACAC |
E. praecox FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG |
E. praecox BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT |
E. praecox LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAATAGCATTGCCAGGTGG |
E. praecox LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC |
E. tenella F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTTGTGAAGGTCAGCGTG |
E. tenella B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTGAGTCCATACGTACTTCCT |
E. tenella FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT |
E. tenella BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT |
E. tenella LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCATGTGCAGTTGAAGACA |
E. tenella LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG |
10 x ThermoPol reaction buffer | New England Biolabs | B9004S | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
dNTPs | Promega | U1330 | |
Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich | B0300 | |
Bst polymerase | New England Biolabs | M0275S | |
Hydroxynaphthol blue | Sigma-Aldrich | 33936 | Dissolved in molecular grade water. |
UltraPure agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
10 x Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | Invitrogen | AM9863 | |
Blue/Orange DNA loading dye (x6) | Promega | G1881 | |
GeneRuler 1Kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
SafeView nucleic acid stain | NBS Biologicals | NBS-SV |