Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.
Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm’s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.
Produção de frango global aumentou dez vezes nos últimos 50 anos, com o mundo em desenvolvimento hospedagem quase quatro vezes a expansão testemunhou no mundo desenvolvido (www.faostat.org) . Como a relevância da produção de frango para a segurança alimentar mundial cresceu assim também tem o perfil de patógenos que podem causar doença grave em galinhas. Um bom exemplo são as espécies de Eimeria, protozoários parasitas onipresentes que podem causar a coccidiose doença entérica 1. Onde quer que os frangos são criados um ou mais espécies de Eimeria são susceptíveis de ser comum 2-4. No mundo desenvolvido Eimeria são controladas principalmente por quimioprofilaxia, empregando programas de transporte ou de rotação para minimizar o impacto da resistência 5. As vacinas vivas também são usados em sistemas onde o valor pássaro é suficiente para justificar o custo (por exemplo, criação de gado, as camadas e alguns frangos 5). Como result destas medidas coccidiose clínica é muitas vezes bem controlados, embora a infecção sub-clínica é comum 5. No mundo em desenvolvimento, a vacinação é rara e aplicação de drogas freqüentemente menos bem informados. Como consequência da coccidiose sub-clínica e clínica é mais comum e exerce um impacto econômico significativo 3.
O diagnóstico da infecção eimerian tradicionalmente invocado lesão marcando post-mortem, embora até mesmo os autores do sistema de pontuação mais utilizado comentou que para algumas espécies "Parece duvidoso que um tal procedimento deve ser tentada em quaisquer mas moderadamente graves infecções" 6. Provas suplementares podem ser obtidas através de detecção microscópica do estágio do ciclo de vida de oocistos resistente do ambiente, em amostras de fezes ou maca, embora sobrepostos morfologia pode confundir tudo, mas o especialista 6,7. Alternativas Molecular com a reação em cadeia da polimerase (PCR), amplificatio aleatórian de polimorfismos de DNA PCR (RAPD-PCR) e as tecnologias de PCR quantitativo já estão disponíveis há até 20 anos 10/08, mas até agora eles não conseguiram se tornar popular. Despesa relativa e a exigência de equipamentos de laboratório especialista ou de transformação têm limitado a sua captação, apesar da natureza muitas vezes subjetiva e tecnicamente exigente do pathology- mais velho e com base em microscopia aproxima 10,11. Tais limitações podem ser exagerados em muitas das regiões mais pobres do mundo, como o Sudeste Asiático, onde o impacto da coccidiose sobre a pobreza pode ser proporcionalmente maiores de 12. Em resposta, há uma necessidade clara de novo simples e sensível, mas rentável, ensaios de diagnóstico espécie-específicos de Eimeria.
Amplificação isotérmica (LAMP) mediada por laço é um fácil de preparar ADN-polimerase dirigida técnica que é capaz de amplificar grandes quantidades de DNA. Mais importante ainda, LAMP utiliza um polymera ADN Bstse em vez da polimerase do ADN de Taq comumente utilizados em PCR, o que facilita a amplificação de ADN de uma única temperatura constante, sem a necessidade de ciclos térmicos 13,14. LAMP podem ser passíveis de aplicação no mesmo laboratório mais rudimentar ou no campo. Caracterizado por a resistência em relação a muitos inibidores de PCR, de alta sensibilidade e especificidade, ensaios de LAMP foram desenvolvidos para uma vasta gama de agentes patogénicos incluindo o vírus da doença bursal infecciosa, Clostridium perfringens e Cryptosporidium 15-17. Em resposta à demanda por novos diagnósticos específicos de espécies de Eimeria rentáveis um painel de ensaios LAMP específicas para cada uma das sete espécies de Eimeria que infectam frangos tem sido desenvolvidas 18. Os pedidos de novos ensaios incluem monitoramento ocorrência do parasita, um valor especial, dada a associação de espécies como Eimeria maxima ou Eimeria necatrix com má pe econômicarformance 3,4. Outras aplicações incluem a avaliação da eficácia da estratégia anticoccidial de uma fazenda, o diagnóstico da infecção subclínica ou doença clínica e avaliação de risco apresentado por Eimeria a uma fazenda.
The Eimeria species-specific LAMP assays described in this paper offer a new diagnostic tool kit in support of effective control of coccidia and the disease coccidiosis. The outcomes of eimerian infection can include severe economic loss as well as seriously compromised bird welfare and increased susceptibility to colonisation by zoonotic pathogens21. Opportunities to monitor flocks for the occurrence of some, or all Eimeria species can provide early warning of a breakdown in anticoccidial control efficacy. Key advantages of LAMP include robust target specificity, resulting from the requirement for six different DNA sequence targets, as well as high sensitivity, boosted by the inclusion of loop primers13, although the qualitative, not quantitative nature of LAMP may be considered a limitation. It is not currently possible to discriminate low level parasite escape from routine chemoprophylaxis or live vaccine replication from unchecked eimerian replication. Nonetheless, the technical ease of the protocol and definitive readout offers considerable improvement over the existing specialist and frequently subjective pathology- and morphology-led approaches6,7. Each assay may be completed at a cost of ~£0.75 per sample, independent of labour and equipment set up expenses. Thus, LAMP assays are also more cost effective than other molecular diagnostics such as PCR, since they require an isothermal incubation with no need for specialist equipment.
For many years access to Eimeria genomic DNA as template has limited the development and application of molecular field diagnostics. The oocyst is the most readily accessible phase of the eimerian lifecycle, but routine DNA extraction requires laboratory facilities22. Other, more labile intestinal lifecycle stages require purification prior to DNA preparation to prevent PCR inhibition and a consequent loss of sensitivity23,24. The ability to extract eimerian DNA of a quality suitable for LAMP using equipment no more specialised than a microcentrifuge and a water bath, supplemented by inhibitor adsorption using chelex resin, now promotes the wider use of molecular biology in eimerian diagnostics. Intriguingly, the reported detection of quantitative PCR-measurable Eimeria DNA in intestinal tissue 20 days after the initiation of parasite infection, 11 days after the last detectable oocyst output, raises the suggestion that LAMP may be used to detect resolved parasite exposure as well as ongoing infection, even after any visible lesions may have been resolved25.
The relatively low cost and low technical requirements of LAMP Eimeria diagnostics can promote their application in the developing world where other more established approaches may not be available or appropriate. For this to be applicable each assay must be capable of detecting all strains which may be circulating within each region. While understanding of the genetic diversity prevailing among Eimeria species is limited26, the use of target sequences previously validated for use in quantitative PCR with strains from Africa, Asia, Europe and South America provides some evidence of conservation, supporting the utility of these LAMP assays around the world10.
The authors have nothing to disclose.
The work carried out in this study was supported in part by the Royal Veterinary College through the student research projects fund, as well as the Biotechnology and Biological Sciences Research Council and the Department for International Development (grant number BB/H009337/2). This manuscript has been assigned the reference PPB_00795 by the RVC.
Name | Company | Catalogue number | Comments |
RNAlater | Ambion | AM7024 | |
Ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | Caution, highly flammable |
100 x Tris-EDTA (TE) buffer concentrate | Sigma-Aldrich | T9285 | |
Chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-1253 | |
Molecular grade water | Invitrogen | 10977035 | |
E. acervulina F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTAACATTTCGCTTCACGGAC |
E. acervulina B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATGAGCAAGTGGAACACCTTG |
E. acervulina FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT |
E. acervulina BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG |
E. acervulina LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TAAGGTTACACCCGTGGAGG |
E. acervulina LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCATGCACAAAGCGACTT |
E. brunetti F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GGCCATCAAGTTCCATGAGC |
E. brunetti B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCAACCTCCTGAGTGTGGTT |
E. brunetti FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT |
E. brunetti BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC |
E. brunetti LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAACGCTCGAACATGGC |
E. brunetti LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CTTCTCCACAGACCCAGAGGT |
E. maxima F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT |
E. maxima B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG |
E. maxima FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG |
E. maxima BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA |
E. maxima LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CAAGCCTACGCGGACATC |
E. maxima LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TTATGCAGCTGGGTCAACG |
E. mitis F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ACGATAGCCAAGACACGTAAGG |
E. mitis B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA |
E. mitis FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT |
E. mitis BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG |
E. mitis LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCCATGCATCCCCTTGTT |
E. mitis LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGTGGGCACAGATTGATTC |
E. necatrix F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TGGCTTTCCCGCGTACC |
E. necatrix B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGGCCCAACACAAAGACTG |
E. necatrix FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA |
E. necatrix BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC |
E. necatrix LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTCTGTAACTTGGGACGTTGT |
E. necatrix LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAACAGCCGGAGCCTCTC |
E. praecox F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT |
E. praecox B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCGCACGAATCTGAATCACAC |
E. praecox FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG |
E. praecox BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT |
E. praecox LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAATAGCATTGCCAGGTGG |
E. praecox LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC |
E. tenella F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTTGTGAAGGTCAGCGTG |
E. tenella B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTGAGTCCATACGTACTTCCT |
E. tenella FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT |
E. tenella BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT |
E. tenella LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCATGTGCAGTTGAAGACA |
E. tenella LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG |
10 x ThermoPol reaction buffer | New England Biolabs | B9004S | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
dNTPs | Promega | U1330 | |
Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich | B0300 | |
Bst polymerase | New England Biolabs | M0275S | |
Hydroxynaphthol blue | Sigma-Aldrich | 33936 | Dissolved in molecular grade water. |
UltraPure agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
10 x Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | Invitrogen | AM9863 | |
Blue/Orange DNA loading dye (x6) | Promega | G1881 | |
GeneRuler 1Kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
SafeView nucleic acid stain | NBS Biologicals | NBS-SV |