Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.
Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm’s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.
La producción mundial de pollo se ha multiplicado por diez en los últimos 50 años, con el mundo en desarrollo al acoger a casi cuatro veces la expansión presenciado en el mundo desarrollado (www.faostat.org) . Como la importancia de la producción de pollo a la seguridad alimentaria mundial ha crecido también lo ha hecho el perfil de los agentes patógenos que pueden causar enfermedades graves en los pollos. Un buen ejemplo son las especies de Eimeria, parásitos protozoarios omnipresentes que pueden causar la coccidiosis enfermedad entérica 1. Dondequiera que se crían pollos son propensos a ser común 2-4 una o más especies de Eimeria. En el mundo desarrollado Eimeria son controlados principalmente por la quimioprofilaxis, empleando programas de transporte o de rotación para minimizar el impacto de la resistencia 5. Las vacunas vivas también se utilizan en sistemas en los que el valor de aves es suficiente para justificar el costo (por ejemplo, reproductores, capas y algunos pollos de engorde 5). Como result de estas medidas coccidiosis clínica a menudo se controla bien, aunque la infección subclínica es común 5. En el mundo en desarrollo la vacunación es rara y la aplicación del fármaco con frecuencia menos informados. Como consecuencia coccidiosis subclínica y clínica es más común y ejerce un impacto económico significativo 3.
El diagnóstico de infección Eimerian ha dependido tradicionalmente de lesión anotando post mortem, aunque incluso los autores del sistema de puntuación más utilizados comentaron que para algunas especies ", parece dudoso que tal procedimiento se debe intentar en ningún pero moderadamente graves infecciones" 6. Evidencia complementaria puede ser obtenida a través de detección microscópica de la etapa del ciclo de vida de ooquistes resistentes al medio ambiente en las muestras fecales o de basura, aunque la morfología de la superposición puede confundir a todos, pero el experto en 6,7. Alternativas moleculares utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificatio azarn de ADN polimórfico PCR (RAPD-PCR) y las tecnologías de PCR cuantitativa han estado disponibles por hasta 20 años 8-10, pero hasta la fecha no han llegado a ser populares. Gasto relativo y el requisito de que el equipo de laboratorio especializado o procesamiento han limitado su aceptación, a pesar de la naturaleza a menudo subjetiva y técnicamente exigente de la Patología mayor y microscopía basada aproxima a 10,11. Estas limitaciones pueden ser exagerados en muchas de las regiones más pobres del mundo, como el sudeste de Asia, donde el impacto de la coccidiosis en la pobreza puede ser proporcionalmente mayor 12. En respuesta hay una clara demanda de nuevo, los ensayos de diagnóstico específicos de las especies de Eimeria sencillo y sensible, pero rentable.
Loop mediada amplificación isotérmica (LAMP) es una técnica fácil de preparar polimerasa impulsado ADN que es capaz de amplificar grandes cantidades de ADN. Lo más importante, LAMP utiliza una Polymera DNA BstSE en lugar de la ADN polimerasa Taq comúnmente utilizado en la PCR, lo que facilita la amplificación de ADN a una única temperatura constante sin el requisito de ciclos térmicos 13,14. Lámpara puede ser susceptible de aplicación en el laboratorio incluso más rudimentario o en el campo. Caracterizado por resistencia relativa a muchos inhibidores de la PCR, una alta sensibilidad y especificidad, los ensayos de LAMP se han desarrollado para una amplia gama de patógenos, incluyendo virus de la enfermedad infecciosa de la bolsa, Clostridium perfringens y Cryptosporidium 15-17. En respuesta a la demanda de nuevos diagnósticos de cada especie de Eimeria rentables un panel de ensayos de LAMP específicas para cada una de las siete especies de Eimeria que infectan los pollos se ha desarrollado 18. Las solicitudes de los nuevos ensayos incluyen monitoreo aparición de parásitos, de especial valor dada la asociación de especies como máximos Eimeria o Eimeria necatrix con mala pe económicarformance 3,4. Otras aplicaciones incluyen la evaluación de la eficacia de la estrategia anticoccidial de una granja, el diagnóstico de la infección subclínica o enfermedad clínica y la evaluación de riesgo planteado por Eimeria a una granja.
The Eimeria species-specific LAMP assays described in this paper offer a new diagnostic tool kit in support of effective control of coccidia and the disease coccidiosis. The outcomes of eimerian infection can include severe economic loss as well as seriously compromised bird welfare and increased susceptibility to colonisation by zoonotic pathogens21. Opportunities to monitor flocks for the occurrence of some, or all Eimeria species can provide early warning of a breakdown in anticoccidial control efficacy. Key advantages of LAMP include robust target specificity, resulting from the requirement for six different DNA sequence targets, as well as high sensitivity, boosted by the inclusion of loop primers13, although the qualitative, not quantitative nature of LAMP may be considered a limitation. It is not currently possible to discriminate low level parasite escape from routine chemoprophylaxis or live vaccine replication from unchecked eimerian replication. Nonetheless, the technical ease of the protocol and definitive readout offers considerable improvement over the existing specialist and frequently subjective pathology- and morphology-led approaches6,7. Each assay may be completed at a cost of ~£0.75 per sample, independent of labour and equipment set up expenses. Thus, LAMP assays are also more cost effective than other molecular diagnostics such as PCR, since they require an isothermal incubation with no need for specialist equipment.
For many years access to Eimeria genomic DNA as template has limited the development and application of molecular field diagnostics. The oocyst is the most readily accessible phase of the eimerian lifecycle, but routine DNA extraction requires laboratory facilities22. Other, more labile intestinal lifecycle stages require purification prior to DNA preparation to prevent PCR inhibition and a consequent loss of sensitivity23,24. The ability to extract eimerian DNA of a quality suitable for LAMP using equipment no more specialised than a microcentrifuge and a water bath, supplemented by inhibitor adsorption using chelex resin, now promotes the wider use of molecular biology in eimerian diagnostics. Intriguingly, the reported detection of quantitative PCR-measurable Eimeria DNA in intestinal tissue 20 days after the initiation of parasite infection, 11 days after the last detectable oocyst output, raises the suggestion that LAMP may be used to detect resolved parasite exposure as well as ongoing infection, even after any visible lesions may have been resolved25.
The relatively low cost and low technical requirements of LAMP Eimeria diagnostics can promote their application in the developing world where other more established approaches may not be available or appropriate. For this to be applicable each assay must be capable of detecting all strains which may be circulating within each region. While understanding of the genetic diversity prevailing among Eimeria species is limited26, the use of target sequences previously validated for use in quantitative PCR with strains from Africa, Asia, Europe and South America provides some evidence of conservation, supporting the utility of these LAMP assays around the world10.
The authors have nothing to disclose.
The work carried out in this study was supported in part by the Royal Veterinary College through the student research projects fund, as well as the Biotechnology and Biological Sciences Research Council and the Department for International Development (grant number BB/H009337/2). This manuscript has been assigned the reference PPB_00795 by the RVC.
Name | Company | Catalogue number | Comments |
RNAlater | Ambion | AM7024 | |
Ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | Caution, highly flammable |
100 x Tris-EDTA (TE) buffer concentrate | Sigma-Aldrich | T9285 | |
Chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-1253 | |
Molecular grade water | Invitrogen | 10977035 | |
E. acervulina F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTAACATTTCGCTTCACGGAC |
E. acervulina B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATGAGCAAGTGGAACACCTTG |
E. acervulina FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT |
E. acervulina BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG |
E. acervulina LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TAAGGTTACACCCGTGGAGG |
E. acervulina LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCATGCACAAAGCGACTT |
E. brunetti F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GGCCATCAAGTTCCATGAGC |
E. brunetti B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCAACCTCCTGAGTGTGGTT |
E. brunetti FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT |
E. brunetti BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC |
E. brunetti LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAAACGCTCGAACATGGC |
E. brunetti LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CTTCTCCACAGACCCAGAGGT |
E. maxima F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT |
E. maxima B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG |
E. maxima FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAGTCACTGCTGATGTACCAAA AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG |
E. maxima BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA |
E. maxima LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CAAGCCTACGCGGACATC |
E. maxima LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TTATGCAGCTGGGTCAACG |
E. mitis F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ACGATAGCCAAGACACGTAAGG |
E. mitis B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA |
E. mitis FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT |
E. mitis BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG |
E. mitis LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TCCATGCATCCCCTTGTT |
E. mitis LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGTGGGCACAGATTGATTC |
E. necatrix F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *TGGCTTTCCCGCGTACC |
E. necatrix B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGGCCCAACACAAAGACTG |
E. necatrix FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA |
E. necatrix BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC |
E. necatrix LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTCTGTAACTTGGGACGTTGT |
E. necatrix LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAACAGCCGGAGCCTCTC |
E. praecox F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT |
E. praecox B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCGCACGAATCTGAATCACAC |
E. praecox FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG |
E. praecox BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT |
E. praecox LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GAATAGCATTGCCAGGTGG |
E. praecox LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTCCACTGTCATTAATATTGC TGC |
E. tenella F3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTTGTGAAGGTCAGCGTG |
E. tenella B3 | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCTGAGTCCATACGTACTTCCT |
E. tenella FIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GCCACTGCTATGGAAAGTCAC AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT |
E. tenella BIP | Sigma-Aldrich | VC00021 | *GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT |
E. tenella LB | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CGCATGTGCAGTTGAAGACA |
E. tenella LF | Sigma-Aldrich | VC00021 | *CCAAATGTATCTGCTAGTTATA TTAACAAG |
10 x ThermoPol reaction buffer | New England Biolabs | B9004S | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
dNTPs | Promega | U1330 | |
Betaine solution (5 M) | Sigma-Aldrich | B0300 | |
Bst polymerase | New England Biolabs | M0275S | |
Hydroxynaphthol blue | Sigma-Aldrich | 33936 | Dissolved in molecular grade water. |
UltraPure agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
10 x Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | Invitrogen | AM9863 | |
Blue/Orange DNA loading dye (x6) | Promega | G1881 | |
GeneRuler 1Kb DNA ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
SafeView nucleic acid stain | NBS Biologicals | NBS-SV |