Protocol
注：倫理声明：このプロトコルは、見直し、サイモン·フレーザー大学の動物実験委員会によって承認されている（UACC、許可証番号1037K-12と1060K-03）とアニマルケアに関するカナダの協議会に準拠している、のためのNIHガイド実験動物の管理と使用、およびEEC理事会指令。
1.特別な考慮事項
注：ブスルファンは、細胞傷害性である。ハンドルと安全データシートと制度ガイドラインに従って廃棄してください。
- 層流フード内で無菌的にすべての技術を実行する。
- このような剥離パッケージ、およびオートクレーブのような適切な包装材料で包むことによって、使用前に器具を滅菌する。
- 感染のリスクは、照射に比べブスルファン付きの下ですが、唯一の移植後最初の2週間は、層流フードで動物を扱う。
2.コンディショニングレシピエントマウス
- 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて溶液を3mg /にブスルファンを希釈する。
注：注射の毎日を使用直前にブスルファンの新鮮な希釈することが重要である。 - 毎日のIP注射を経由して、レシピエントマウスに希釈しブスルファンの20mg / kgのを管理します。
- 60-100 mgの総用量まで20mg / kgのブスルファンの毎日のIP注射を繰り返し/ kgの（ すなわち、80 mg / kgを総用量のために、4日間連続ブスルファンを20mg / kgで投与）送達された。
ドナー骨髄細胞の3.絶縁
注意：このプロトコルは正常に最大5ドナーマウスからのBM細胞を単離および調製するために使用されてきた。通常、マウス当たり細胞収量は、12-16レシピエントマウスに移植するのに十分である約30から40000000 BMDCを、である。以上のドナーマウスが必要な場合は、プロトコルに応じて調整する必要があるかもしれない。
- ブスルファンコンディショニングの最後の日に続いてeuthCO 2を使用した（一から六ヶ月）のGFPドナーマウスをanize（または機関に受け入れられ、他の安楽死法による）。移植の合併症を回避するために、受信者と同じ性別である同系ドナーを使用しています。
- 70％エタノールでマウススプレー。リフト腹部の皮膚と外科用ハサミを使用するには、足首に向かって腹腔まで足から皮膚を介して切開する。足を持ち、しっかりと脚組織を暴露腰に向かって足首から肌を引き出します。
- 股関節を露出するために大腿骨から筋肉及び脂肪組織を切り取る。
- 優しく足を拡張するために、足を引っ張っている間、股関節に対してハサミを押してください。ちょうど大腿骨自体をカットしないように注意しながら、大腿骨の頭の上にカット。
- 、無菌性を維持するのに役立ち足で足を保持し、オートクレーブ組織と骨表面をこすることにより骨から残りの組織をクリーニングするには。
- 膝関節を切断することにより、大腿骨と脛骨を分離滅菌PBSを含む培養皿に大腿骨を置く。氷上でインキュベートする。
- 腓骨は脛骨に接続している箇所で切断することにより、腓骨を取り外し、廃棄します。大腿骨との培養皿で脛骨を置き、氷上でインキュベートする。
- 繰り返して、他の足のために3.2から3.7を段階的に説明し、必要に応じて、追加のドナーマウス。骨を除去した後、ホットビーズ滅菌器で手術器具を滅菌するか、その後の工程のための無菌の新しいツールセットを使用します。
- 大腿骨の場合は、鉗子で大腿骨を保持し、慎重に手術用ハサミを使用して「剃る」は遠位骨をオフに終了します。 BM空洞を公開するために、必要に応じて骨のような少しを削除します。
- 滅菌PBS 3mlで注射器を記入し、23 Gの針を取り付けます。慎重にBM空洞に針を産んと無菌培養皿にBMをフラッシュする。すべての所望の細胞の除去を確実にするために、ニードルポイントで髄空洞をこすりしてください。抽出に続いて、赤いBMは表示されなくなりと骨が今白く見えることを確認してください。
- 繰り返しは、同じ培養皿にBMのすべてをプール、後続の大腿骨用3.9から3.10を繰り返します。
- 脛骨のために脛骨がBM空洞が露出するように膝に取り付けた最後を、鉗子で脛骨を保持し、慎重に「剃る」。可視赤色BMが終わる骨に沿って第2のカットを行います。
- 滅菌PBS 3mlで注射器を記入し、25 Gの針を取り付けます。静かに（膝に取り付けた端から）BM空洞の中に針を挿入し、大腿骨からBMを含む培養皿にBMをフラッシュする。すべての細胞を除去するために針でBMキャビティの壁をこすり。抽出に続いて、赤のBMが見えなくなると骨が今白表示されていることを確認していない。
- 繰り返しは、同じ培養皿にBMのすべてをプール、後続の脛骨のため3.12から3.13を繰り返します。
- 穏やかcと解離を1 mlピペットチップでBMを粉砕するのエル。
- 滅菌した50mLの遠心分離管に40μMバスケットフィルターを通して細胞懸濁液を渡す。残りの細胞を取得し、遠心管にフィルターを介してこれを転送するためにPBSでディッシュをすすぐ。
- 4℃で450×gで5分間遠心。上清を除去し、廃棄する。
- 再懸濁赤血球溶解緩衝液3ml中にペレットを再。 8.5分間氷上でインキュベートする。
- 溶解バッファをクエンチするの無菌PBS〜30ミリリットルを追加します。
- 4℃で450×gで5分間遠心。上清を除去し、廃棄する。
- 滅菌PBSの1ミリリットル中にペレットを再懸濁。氷の上に保管してください。
- 細胞ホモジネートの小アリコートを取り、PBSで希釈し（1：1マウス100; 1：2匹のマウス200等）の血球計数器を用いて細胞数を定量する。
- 8×10 6細胞/ mlの細胞懸濁液を希釈し、注射まで氷上でインキュベートする。
4.骨髄移植
- Fiのllの各マウスに希釈した細胞懸濁液を300μlと（28 Gインスリン針付き）が0.5 mlシリンジに注入する。注射器中に存在する任意の気泡を除去するようにしてください。
- 加熱パッドを条件とレシピエントマウスを含むマウスケージを置き、尾静脈を拡張することができます。
- 拘束装置において、レシピエントマウスと起こる。 70％エタノールを浸した外科ガーゼでテールを拭きます。
- しっかりと尾を保持し、ベベルを上にして、軽く外側尾静脈の1に針を挿入し、細胞懸濁液を注入する。
- 出血が新しいクリーンケージにマウスを導入する前に停止するまで注射部位に外科ガーゼを持ってください。
5. BMキメラ現象の程度を推定
NOTE：キメラ化レベルが1週間後BMTにおける末梢血中で一般的に可変であり、そのようキメリズムのレベルは、通常、少なくとも2週間後BMT推定される。チムのレベルerismはBMT後3〜4週間以内に末梢血中の> 80％のGFP +細胞に到達する必要があります。
- FACS緩衝液（PBS中の2mM EDTA + 2％ウシ胎児血清）を準備。
NOTE：FACSバッファは数週間4℃で保存することができる。 - 拘束チューブにマウスを置き、横伏在静脈を露出させるために後部脚に毛を剃る。
- 薄くコートワセリンとピアス25 G針で伏在静脈と足。
- ヘパリンコーティングされた毛細管血液の約50μlのを収集します。 FACS緩衝液1mlを含むマイクロ遠心チューブに血液を加える。反転によってチューブを混合し、氷上で保存する。
- 戻ってケージにマウスを返す前に停止し、出血するまで、注射部位に外科ガーゼを保持します。
- 遠心分離機900×gで5分間の血液サンプルは上清を除去し、廃棄する。
- 赤血球溶解緩衝液500μl中にペレットを再懸濁。 8.5分間氷上でインキュベートする。
- 溶解緩衝液をクエンチし、FACS緩衝液1mlを加える。
- 900×gで5分間、サンプルを遠心する。上清を除去し、廃棄する。
- 赤血球溶解緩衝液500μl中に第二溶解ステップを実行します。 8.5分間氷上でインキュベートする。
- 溶解緩衝液をクエンチし、FACS緩衝液1mlを加える。
- 900×gで5分間、サンプルを遠心する。上清を除去し、廃棄する。ペレットは今白であることを確認してください。
注：ペレットがまだ赤い表示される場合は、追加の溶解工程は、次のステップに進む前に必要になる場合があります。 - 再懸濁FACS緩衝液1ml中でペレット。 900×gで5分間、サンプルを遠心する。上清を除去し、廃棄する。
- FACS緩衝液300μl中にペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーを用いて、GFP +細胞を定量化する（注：この時点で、細胞の任意の免疫染色は、標準的な技術を使用して、行うことができる前にフローサイトメトリー分析する）。
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Representative Results
ブスルファンの60〜10mg / kgの投与は、一般的にマウスが許容される。しかし、動物は、一般的に、コンディショニング相（〜5から10までパーセント）の間に体重を減らすため、食事は、そのような食べることを奨励するために照射ヒマワリの種のような扱いで補充する必要があるかもしれません。末梢血中の> 80％のGFP +細胞のキメラ現象とBMのレベルは60〜100 mg / kgをブスルファン7を使用して、一貫して達成可能である必要があります。当研究室では、成功した末梢血とBM中の> 80％のGFP +細胞と100以上のキメラマウスを生成するには、このプロトコルを使用しています、と同系ドナーとレシピエントを使用した場合、当社のBMTの事実上すべてが成功している。 図1をキメリズムのレベルは毎週定量化を示し成功した同系BMTを受けた100mg / kgのブスルファンでコンディショニングしたマウスの末梢血中の（n = 3）の不成功同種BMTを受けた80 mg / kgをブスルファンでコンディショニングマウス（n = 3）。 > 80％のキメラ現象レベルがtypicallですyは3~4週間後BMTによって確立。 図2は、成功と失敗BMTを示す末梢血の代表的なFACSデータである。 図3は、このキメラ現象はBMで少なくとも1年間確立された（n = 3）、及びままであることを示している車両とその調節は、BMキメラ現象を誘導するのに十分ではない（n = 3）であった。 BMキメラのレベルに有意差は60〜100 mg / kgをブスルファンの用量を使用してそこに達成されていないが、GFP +細胞は用量依存的にCNS内に蓄積する。さらに、この蓄積が劇的ようALS 7のような神経変性疾患において増加する。 図4は、野生型（n> 20）ALSマウスモデル（nは> 20）で、脊髄の腰部領域内のGFP +細胞の蓄積を示している図 。
エアコン図1.レシピエントマウス同系のドナーからのブスルファンとGFP +骨髄細胞を移植して、血液中の持続的なキメラ現象の高いレベルを達成しています。毎週のフローサイトメトリーデータは同系続くブスルファンの100mg / kgのでコンディショニング成功裏に移植したマウスの末梢血中のGFP +キメラ現象を示す骨髄移植（黒）および失敗した移植されたマウスは、同種骨髄移植（灰色）、続いブスルファンの80 mg / kgを用いてコンディショニング。結果は、n = 3マウス/群からの平均であり、エラーバーはSEMを表す。
図3週間ブスルファンの100mg / kgのでコンディショニングしたマウスにおける骨髄移植後の末梢血中のGFP +細胞を示す。2.代表的なフローサイトメトリーデータ。ゲーティング戦略を示す（A）散布図、（B）不成功allogeneicは骨髄移植、及び（C）は、正常同系骨髄移植。結果は、N> 3匹のマウスからの代表的なものである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図1年、骨髄移植後の骨髄におけるGFP +細胞を示す。3.代表的なフローサイトメトリーデータ。ゲーティング戦略、（B）は 、車両空調マウスを示す（A）散布図、及び（C）100mg / kgのブスルファン付きマウス。結果は、n = 3のマウスからの代表的なものである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4.骨髄由来細胞は、骨髄移植与えブスルファン付きマウスのCNS 中に蓄積する。（A、C）は、野生型マウスおよび後期（B、D）から単離された脊髄の腰部切片の免疫組織化学分析を病期ALSマウス。 GFP +細胞は緑色で示されている。結果は、各モデルのn>は20匹のマウスからの代表的な画像である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ブスルファン調整は容易に検出された造血細胞を有するマウスにおける高レベルのBMキメラの生成を可能にする。この調整は、照射設備を必要とせずに行うことができる。また、このプロトコルで概説ブスルファンの用量の骨髄抑制はよく照射骨髄破壊用量によって引き起こされる有害な副作用を最小限に許容され、従って、よりあり、若い古い、または罹患したマウスにおけるBMキメラを生成するためのより適切な技術であってもよい骨髄破壊的照射の影響を受けやすい。ブスルファンで達成可能なものよりも低いキメリズムのレベルをもたらすことができる、いくつかのRICプロトコルは、有害な副作用を最小限に抑えるために全身照射の低い、非myleoablative用量を使用するが、これらのプロトコルはまだ照射量に応じて、照射設備を必要としエアコン13。最近では、トレオスルファンは、BMコンディショニング8,14のために使用されてきた。ブスルファンと同様に、トレオスルファンconditioningとBMTはBM 14におけるキメラ現象の高いマウスを生成することができる。しかし、トレオスルファン、北米で容易に達成されないが、ブスルファンコンディショニングキメリズムの匹敵するレベルを達成するのに必要トレオスルファンの用量は、ブスルファン（〜5〜10倍）14よりも有意に高い。さらに、これらの効果的な用量のトレオスルファンでブスルファン（K. Peake、J·マニング、及びC.クリーガー、未発表の観察）に比べて、マウスにおいて、より毒性の副作用を持っているように見えます。末梢血キメラ現象は、また外科的にドナーマウスにレシピエントマウスの循環をリンク含まれている、並体結合マウスの作製を通じて確立することができます。並体結合しか周囲に50％のドナー細胞〜もたらす技術的に困難な手順であるが、全BM移植とは異なり、並体結合は、循環中にBM-限定前駆細胞を導入することなく、より生理的な方法で確立される末梢血キメラ現象を可能にするレシピエントマウス15のpheral血。
ここで説明したプロトコルは、同じ性別であり、レシピエントとドナーのマウスを用いて、ならびに移植拒絶反応の可能性を最小限にするために、同系のレシピエントとドナーのマウス系統を使用して、依存している。多くの適切なドナーおよびレシピエント株は市販されているが、ミスマッチ同種異系マウスにおいてキメラ現象を確立する（ すなわち、MHCハプロタイプが有意に異なる）問題となり得る。同種のマウスが利用できる唯一の適切なマウスであるような場合には、予備的研究では、まず、ブスルファンコンディショニング安定キメラ現象の高度に導くことが可能であるかどうかを決定するために、マウスの小グループに行われるべきである。私たちは、C57BL / 6にC57BL / 6-GFPマウスから単離したドナーたBMDCを移植するいくつかの成功を収めている。SJLの受信者ではなく、すべての移植されたマウスは、持続的なキメラ現象（〜30％）を設立しましたけれども。シクロホスファミドのほか、多くの場合、強力な免疫抑制剤のu臨床的にブスルファン16と連動してsedの、同種移植の成功率を向上させるために使用することができる。しかし、C57BL / 6-GFP細胞を混合C57BL / 6に、アルツハイマー病のトリプルトランスジェニックマウスモデルに移植したとき、129遺伝的背景、ブスルファンおよびシクロホスファミドのコンディショニングは、安定生着のに対し、安定したBMキメラは（ 図2B）を生成するためには不十分であった致死照射後のことが可能であった。このように、同種移植が必要な状況では、照射は完全な骨髄破壊と起こる重度の免疫抑制のために、より適切なコンディショニングレジメン場合があります。
いくつかの追加的な措置は、このプロトコルのキメリズムと一貫性を最大化するために取られるべきである。ブスルファンの効力は、長期的に低減することが表示されることは、理想的には直前ブスルファン投与、ブスルファンの新鮮な希釈物を注射用に調製されることが重要であるストレージ。細胞を解離するためにBMを粉砕する際に加えて、それはBM細胞を損傷しないように静かにそうすることが重要である。これは完全に解離されない組織のいくつかの塊、結果的に若干低い収量になるかもしれないが、解離した細胞の全体的な健康と品質が良くなります。同様に、ペレットの再懸濁を必要とするすべてのステップも優しく行ってください。
キメリズムの高いレベルは一貫して達成することができる60、80および100mg /ブスルファン7 kgの用量（ 図1 - 3）。また、野生型8,9およびALSマウス7のCNS におけるGFP +細胞の蓄積の用量依存的増加がある。我々は、他にも、野生型マウスと比較して7,8,10神経変性のマウスモデルのCNS 内のGFP +細胞の蓄積数の増加を観察した。 GFP + BMのさらに大きな数の致死照射の結果DCは60〜100 mg / kgを投与量ブスルファン7の最近の研究は、脳内のGFP +細胞のより高い数のブスルファン（125ミリグラム/ kg）の結果、骨髄破壊用量は全身照射9と比較することを示唆しているが、比較した。証拠は、致死的に照射されたマウスのCNSへのBMDCエントリが血液脳関門（BBB）の破壊のために、少なくとも部分的に起因し得ることを示唆している。ブスルファンは、CNS 11内の血清タンパク質（アルブミン）の欠如に基づいてBBBを破壊するために表示されませんが、ブスルファンは、容易にBBB 17,18を横断することができ、したがって、ブスルファンコンディショニング内ニッチスペースを開くことが示唆されているその後BMDCを8で満たされているCNS。興味深いことに、ウィルキンソンらの所見は、致死的に照射したマウスにおけるGFP +細胞の蓄積がinflammatorに起因するように見えるしながら、GFP +細胞によるケモカインのリクルート機構にブスルファンエアコンマウスのCNS に蓄積することを示唆している照射自体9で生成されたYのメカニズム。トレオスルファンは、CNSを調節するように表示されず、その結果、少数のGFP +細胞は、トレオスルファン付きのマウス8のCNS 内で発見された。これは、ブスルファン、肝臓、肺、および腎臓6を標的とすることが知られているが、ブスルファンの異なる用量は、CNS以外の組織に及ぼす影響を決定されていない。新しい実験のためのブスルファンの用量を選択する際に、他の組織を条件付けることがブスルファンは考慮されるべきである。
このブスルファンコンディショニングプロトコルが実行するのが比較的簡単であるが、キメラBMによるマウスの生成は、造血細胞を調査するために使用することができる強力なツールである。遺伝子操作マウスおよびBMDCをする能力とともに市販のトランスジェニックマウスの広い範囲は、劇的にこのプロトコルの可能性を増大させる。 GFP発現は、に制限されている、例えば、種々のマウスモデルが存在するそのような骨髄系細胞において主に19を GFPを発現CX3CR1-GFPマウスのような特定の細胞型および系統。これらのマウスは、 インビボで特定の造血細胞集団の調査を可能にするドナーとして用いることができる。異なるフルオロフォアの数も、競合アッセイ20を採用することができる技術を移植二つ（またはそれ以上）の異なるドナーからのBMDCを監視するために使用することができるGFPに加えて、中に存在する。さらに、疾患の異なるトランスジェニックマウスモデルの数は、それは、種々の障害でのBMDCの役割を調査するためのレシピエントとして使用することができる存在する。移植後、ドナー細胞は、免疫組織化学を用いて分析することができる、またはFACSによって単離し、生化学的技術の範囲を使用して調査した。さらに、このような二光子顕微鏡などの高度なイメージング技術は、GFP 21と蛍光体のインビボ検出のライブのために実施することができる。最終的に、それたBMDCは、遺伝子操作されたとブスルファン付きエントにおけるそのようなCNSの組織を標的とする治療用分子を送達するために使用され得ることが想定される。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Busulfex | Otsuka Canada Pharmaceutical Inc. | DIN 02240602 | Dilute busulfan to 3 mg/mL with sterile PBS just prior to use. Busulfan is cytotoxic. Handle and dispose according to the MSDS and institutional guidelines. |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | Other lysis buffer could be substituted but incubation times may need to be adjusted accordingly |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12483-020 |
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