Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.
Mange progressive neurologiske sygdomme hos mennesker, såsom epilepsi, kræver prækliniske dyremodeller, der langsomt udvikler sygdommen for at teste interventioner på forskellige stadier af sygdommen proces. Disse dyremodeller er særligt vanskelige at gennemføre i umodne gnavere, en klassisk model organisme til laboratorieundersøgelse af disse lidelser. Optagelse kontinuerlig EEG hos unge dyremodeller af anfald og andre neurologiske lidelser udgør en teknisk udfordring på grund af den lille fysiske størrelse af unge gnavere og deres afhængighed af dæmningen før fravænning. Derfor er der ikke kun et klart behov for at forbedre præklinisk forskning, der bedre vil identificere disse behandlingsformer er egnede til oversættelse til klinikken, men også behov for nye enheder kan optage kontinuerlige EEG i umodne gnavere. Her beskriver vi teknologien bag og demonstrere brugen af en roman miniature telemetri-system, specielt udviklet til brug i umodne rotter or mus, hvilket også er effektive til anvendelse i voksne dyr.
Den ældste – og stadig den mest anvendte – teknik til optagelse biopotentialer i hjernen er elektroencefalografi (EEG). Det bruges klinisk til neurologiske abnormiteter, herunder beslaglæggelse afsløring 1, lokalisering af beslaglæggelse foci 2, og diagnosticering af hjernerystelse 3,4. Denne teknik er også almindeligt anvendt til at give grundlæggende information om mekanismerne i søvn og til at diagnosticere søvnforstyrrelser 5,6.
Som i den kliniske diagnose af epilepsi, er EEG blevet uundværlig for translationel forskning i dyremodeller af både genetiske og erhvervede epilepsi. I de nuværende forskningsansøgninger, "wired" eller "tøjrede" optagelser er standard, og rutinemæssigt udføres i voksne gnavere i ugevis ad gangen 7. Men elektrisk støj, bevægelse artefakter, og risikoen for, at tøjret dyr vil skade sig selv ved at trække i kablet har lange kompromised disse eksperimenter. Således at forbedre eksperimentelle betingelser og succesrater, er vi nødt til at udvikle nye teknologier, som vil give mulighed for eliminering af kablede grænseflade mellem dyret og instrumentering. Den mest oplagte udviklingsområde er design og implementering af telemetri-systemer, der giver mulighed for høj kvalitet optagelser, og samtidig opretholde en lang levetid og minimere ubehag for animalske emner. Reduktion den fysiske størrelse af disse enheder vil gøre det muligt translationel forskning i neonatale og unge gnavere modeller af neurologiske lidelser.
Lave kanal-count EEG optagelser i rotter er ansat i udstrakt grad til at udvikle nye behandlingsformer til at undertrykke epileptiske anfald i stand til oversættelse til mennesker. Optagelser fra et eller flere steder i en længere periode åbne mange muligheder for at anvende gnavermodeller for epilepsi i translationel forskning. Meget af den moderne forskning på dette område har til formål at blokere forekomsten af kronisk seizninger eller udvikling af epilepsi (dvs. epileptogenese), og sådanne forskningsindsats kræver omfattende hvis ikke kontinuerlig EEG overvågning for at analysere effektiviteten af den foreslåede terapi 8; en lille, enkel, telemetrisk system, med en, to eller fire kanaler opererer mellem 0,1-100 Hz per kanal vil kraftigt fremme denne form for translationel forskning. Elektrografiske anfald ofte forekomme med minimale adfærd (sikkert uden kramper), hvilket begrænser nytten af assays baseret på adfærdsmæssige anfald. Strategien med at kombinere EEG optagelse og samtidig videoovervågning tillader en mulighed for at indfange hver beslaglæggelse; og desuden kan disse analytiske tilgange tillader kvantitativ vurdering af interictal- pigge, som opstår i den epileptiske hjernen mellem "iktal" (eller beslaglæggelse) begivenheder 9. Endvidere evnen til at opnå kontinuerlig høj kvalitet, lave artefakt EEG optagelser, for hvilke den trådløse teknologi er genereltoverlegen, vil give mulighed for udvikling af brugen af edb-baserede algoritmer til at studere specifikke EEG-kurver (f.eks theta, gamma), såvel som automatisk registrering af anfald, en markant reduktion arbejdsbyrde forsøgslederen.
Den primære prækliniske model til undersøgelse af kronisk epilepsi efter hjerneskade er den voksne rotte eller mus, enten via en kemo-konvulsiv (dvs. kainsyre eller pilocarpin) eller elektrisk induceret status epilepticus (SE), som er efterfulgt af kronisk epilepsi. Under disse betingelser, kan de alvorlige kramper forbundet med SE eller de efterfølgende anfald hos de epileptiske dyr føre til skade fra dyret rive eller trække i tøjret og løsne skruerne, der opretholder fastgørelsen af headcap. I sidste ende, er det dette problem, der normalt ophæver disse eksperimenter, og alligevel er behov for at opnå langsigtede høj opløsning EEG registreringer for eksperimenter der sigter mod at udvikle nye behandlingsmetoder til kroniskeepilepsi er altafgørende. Derudover, bolig, overvågning og analyse af data fra en langsigtet implanterede dyr er en betydelig investering i både direkte omkostninger og investigator tid; Derfor kan for tidlig afslutning af forsøget resultere i betydelige omkostninger for forskerne. Da disse modeller for epilepsi fremskridt, som regel anfaldene bliver hyppigere og mere alvorlige 10-12, hvilket øger sandsynligheden for, at dyrene kommer til skade, ligesom deres anvendelighed til udvikling af nye behandlingsformer bliver størst. Disse dyr kan rutinemæssigt udvikle snesevis af krampeanfald om dagen, ofte forekommer i klynger 13.
Sandsynligvis en af de vigtigste udviklinger i biomedicinsk videnskab har været anvendelsen af gen-targeting i musemodeller. Denne fremgangsmåde har gjort, og vil fortsætte med at gøre det muligt, at udvikle dyremodeller af genetisk epilepsi, der gengiver faktiske menneskelige syndromer 14-16. Genetiske manipulationer kan gennemføres somproof-of-princippet behandlingsformer til at undertrykke epileptiske anfald eller endda blokere for udviklingen af epilepsi efter hjerneskade 17-20. Denne type forskning ville drage fordel dramatisk fra evnen til at udføre high-throughput kontinuerlig registrering af EEG. For tiden er det muligt at optage fra mus med enten tøjrede eller telemetrisystemer; Men udfordringerne for at opnå høj kvalitet, er artefakt-fri optagelser betydeligt vanskeligere end rotter, og ofte kræver forskellige former for rygsække at mus løbende prøve at fjerne. Stress kan øge alvoren af krampeanfald, frekvens og / eller varighed, og dermed i sidste ende ville modificere epilepsi af forsøgsdyr, således confounding undersøgelsen. En lille, letvægts, lav profil miniature telemetri-system vil lette optagelsen af langsigtede EEG fra genetiske musemodeller for human sygdom.
Ud over de ovenfor beskrevne problemer, optagelse EEG i umodne gnavermodels sygdom har sit eget unikke sæt af udfordringer. Umodne dyr kan veje så lidt som 6 g (P8 mus) til 17 g (P6 rotte). Det er næsten umuligt at gøre serielle multi-dages tøjrede EEG optagelser som følge af øget stress fra tøjr og manglende evne til at give naturlig opdræt af hvalpen ved dæmningen. Indtil dyrene er vænnet, skal de forblive i pleje af dæmningen. Dæmningen er tilbøjelig til at ødelægge enhver eksternaliseres stik forsamling på pup, lukke hvalpen, og i nogle tilfælde opsige hele kuldet. Endvidere umodne gnaver kraniet gør det vanskeligt at montere nogen elektrode piedestal til kraniet med mekanisk integritet. Disse udfordringer, unikke for umodne gnavere, kræver en ny løsning for at gøre robust, langsigtede elektrografiske optagelser. Her fokuserer vi på at demonstrere implantation og registrering af EEG ved hjælp af en roman miniature trådløs sender og nuværende tre proof-of-princippet eksperimenter som eksempler for brug af miniature trådløse telemetri-system: 1) immodne rotte pup model af hypoxi-iskæmi, 2) voksne mus behandlet med DFP for at inducere status epilepticus og efterfølgende spontane anfald, og 3) genetisk model af vaskulære kavernøse misdannelser, der resulterer i kramper og dødsfald hos voksne mus.
Den miniature trådløse telemetri-system er designet til at imødekomme fire hovedkrav: (1) minimalt invasiv kirurgisk implantation; (2) kompatibilitet for opstaldning af gnavere hvalpe med dæmningen og søskende; (3) lavt strømforbrug af enheden, hvilket giver mulighed for måneders kontinuerlig overvågning uden kirurgisk re-implantation; og (4) evnen til at optage høj kvalitet EEG-kurver med minimale bevægelse artefakter. Den trådløse sender vejer <0,6, 2,3 og 4 g og er <0,3, 0,8, og 1,4 cm3 afhængig af batteriet med et footprint på 5 x 7, 7 x 9 eller 7 x 12 mm, der let monteres til kraniet af dyret med cyanoacrylat gel. Ingen knogle skrue ankre er nødvendige for sikkert anbringe enheden tilkraniet, hvilket reducerer antallet af huller, der skal bores i kraniet og kirurgi tid. Indretningen er i stand til at amplificere to kanaler af EEG eller lokale feltpotentialer fra dybe hjernens strukturer, såsom hippocampus, i over 2 uger, 2 måneder eller 6 måneder i denne konfiguration. Den lille størrelse af den trådløse sender reducerer risikoen for infektion, øger animalsk mobilitet, og i sidste ende reducerer morbiditet og mortalitet, der ellers øger den tid, penge og antal dyr, der er nødvendige til et eksperiment. Alle elektronik og batteri er pottet i medicinsk-grade epoxy, der gør enheden vandtæt og hård, forhindre dæmningen fra tygge på senderen, der ellers kunne gøre enheden ubrugeligt. Modsætning radio-frekvens sendere, telemetrisystemet anvender kapacitiv kobling mellem sender og en modtager antenne, der sidder under dyret bur, så brugeren kan holde dyr i standard gnavere boliger. Flere kanaler med RECORDIng mulighed for optagelse af multimodale biopotentialer, såsom elektrokardiogram og elektroencefalogram. Dyremodeller for co-morbiditet vil drage fordel ved evnen til at optage biopotentialer under opførsel 21-23. Kombinere adfærd med EEG overvågning vil give forskerne et bedre værktøj til forskning og prækliniske studier.
Det kan være meget dyrt at foretage langsigtede elektrografiske optagelser i små dyremodeller for sygdomme. Ved at satse på simple elektriske kredsløb og understreger lavt strømforbrug, har vi været i stand til at skabe en sender-system (figur 1 og 2), der reducerer omkostningerne ved overvågning eksperimenter langsigtede. De samlede omkostninger til en 6 måneders overvågning eksperiment kunne være så lavt som $ 470 plus udgifterne til dyret (~ $ 1,5 dyr dagpenge, $ 200 sender). Den lille størrelse af senderen tillader kontinuerlig uafbrudt elektrografiske optagelser i små dyr, prækliniske modeller for human sygdom, som er meget vanskeligt at opnå med tøjret eller radio-frekvens-baserede trådløse registreringssystemer (Figur 4). Endelig kraniet monterede karakter af senderen reducerer kirurgi tid og stress på dyret, som ellers kan kompromittere et eksperiment. Her viser vi proof-of-princippet eksperimenter fra tre different forsøgsmodeller anfald: perinatal hypoxi-iskæmi 13, 27, 28 i en rotteunge (figur 4), DFP-induceret status epilepticus (figur 5) og anfald i en genetisk-induceret model af kavernøse vaskulære malformationer (figur 6).
Muligvis det mest kritiske aspekt for at opnå artefakt-fri, langsigtede elektrografiske optagelser er at kontrollere uhæmmet elektrode adgang til kortikale region af interesse (Figur 4-6). Dette omfatter den fælles reference / jordelektrode. Særligt kritisk er fastgørelse af senderen til kraniet for epidural EEG applikationer. Under denne proces er det muligt at uforvarende belægge spidsen af elektroderne med cyanoacrylat betragtning af den meget korte længde af elektroderne. Coating elektroderne i cyanoacrylat kan dæmpe EEG signaler eller helt at isolere dem i det værst tænkelige scenario. Tilsvarende mangel på god elektrisk forbindelse Between den fælles reference / jord og dyrets hjerne vil forhindre korrekt drift af differentialforstærkeren i senderen, hvilket resulterer i en elektrisk "støjende" signaludgang. Ofte, efter operation, god kvalitet signaler kan kompromitteres i op til 48 timer på grund af ødem omgiver burr huller i kraniet. Som ødem aftager, signaler generelt forbedre. Dette kan undgås ved at placere elektroderne på overfladen af kraniet uden at burr huller. Konsekvenserne af denne proces er øget potentiale til pels elektroderne med cyanoacrylat, nedsat højfrekvente aktivitet på grund af low-pass elektriske egenskaber kraniet, og potentialet for elektrisk isolere fælles reference / jord rendering støj i signalerne. Øve korrekt placering af elektroder kan gøres med et tyndt stykke træ eller finér, der efterligner tykkelsen af mus eller rotte kraniet. Resultaterne i dette manuskript illustrerer quaheden af optagelser, der kan opnås ved hjælp af trådløs telemetri-teknologi.
Kirurgisk implantation ved hjælp af den heri beskrevne fremgangsmåde kan tage så lidt som 10 minutter, afhængigt af kompleksiteten af kirurgien. Til kirurgisk adgang til dybe hjernens strukturer, såsom CA1-regionen af hippocampus, er det bedst at fastgøre senderen til en mikromanipulator monteret på en stereotaktisk ramme. Den mikromanipulator vil give kirurgen med nøjagtighed at implantere senderen i henhold til offentliggjorte stereotaksiske koordinater i atlas af mus 29 og rotter 30 hjerner. Dette kan gøres ved blot at krydse et stykke kanyle slangen til senderen med cyanoacrylat og derefter montere den hypodermiske nål i mikromanipulator. Mikromanipulator styring af x, y og z-koordinaterne vil give yderligere stabilitet ved montering senderen til kraniet før suturering huden lukket. Tilsætningen af knogleskruer omkring perimeter af senderen kan hjælpe forankre senderen til kraniet, selv om de ikke er nødvendige. Knogleskruer kunne dog være effektiv, i visse dyremodeller af anfald og epilepsi, såsom lithium-pilocarpin-behandlede voksne rotte. Disse dyr har en tendens til at have spontane krampeanfald med intens motorisk aktivitet, der kan skade senderen under anfaldet. Yderligere kompleksitet kunne føjes til disse eksperimenter. For eksempel senderen er kompatibel med mange forskellige modeller af traumatisk hjerneskade, såsom kontrolleret kortikal indvirkning 31. Holdbarheden af senderen indretning blev testet ved at implantere dyr med sendere ved P7, og derefter huser dem i dyret facilitet. Efter 12 måneder fleste af implantaterne forblev intakt på kraniet. Når dyr blev aflivet, kranierne syntes at være normal og senderen var indlejret i kraniet, hvilket kræver betydelig kraft til at pakke den ud. Vær forsigtig, når dybe hjernens strukturerer undersøgt; som hjernen vokser, og elektroderne forblive stationære, vil den endelige position af elektroderne forventes at ændre sig. For de teknikker der er beskrevet her, blev elektroderne typisk placeret over dura, som tillod både hjernen og kraniet at vokse og til elektroder til at forblive i deres oprindelige positioner. Den begrænsende faktor for, hvor længe senderen kan bruges, er batteriets størrelse (dvs. indtil batteriet løber ud).
En selvstændig monolitisk design (dvs. senderen er indlejret i hårdt epoxy) på senderens hus egner sig til brug med umodne unger opstaldet med dæmningen og deres søskende. Ofte bofællesskab implanterede dyr med ledningsforbundne bindsler resulterer i ødelæggelse af den implanterede hardware eller cannibalization af hvalpene ved dæmningen. Den glatvæggede form af senderen muliggør implantation med næsten ingen fejl eller tab af unger grund kannibalisering hardware.
<p class = "jove_content"> Den energibesparende kapacitiv-koblet transmission ordning i dette system egner sig godt til brug i mange forskellige eksperimentelle scenarier såsom placering i et temperaturkontrolleret inkubator eller endog til anvendelse med eksperimentelle apparater, såsom plethysmografi kamre. Ligeledes kan formen af modtagerantenne manipuleres til at passe i mange forskellige adfærdsmæssige miljøer, såsom den forhøjede T-maze.The for senderen er kun et par inches som transmitteren skal være i stand til at "drive" (kapacitivt par til) modtagerantennen og er afhængig af det dyr der skal rummes i standard gnavere bure eller egnet bur omfattet af modtagerantennen overfladeareal. Senderen fungerer som en pol af et elektrisk felt henviser kroppen af dyret fungerer som en anden pol. Feltet er således, at visse orienteringer, såsom 90 ° ude af fase med modtagerantenne, ikke vil kunne drive modtagerantenne resulterer i en "drop out". Dette er en temmelig sjælden begivenhed. Det fremtidige arbejde med denne teknologi vil gøre det muligt at optage fra flere dyr i samme bur, der vil reducere boarding omkostningerne og give mulighed for social interaktion. Yderligere udvikling vil indebære en forøgelse af antallet af kanaler, herunder temperatur og elektromyogram. Den nuværende udformning af enheden giver en båndbredde, der er optimeret til omkodning af klassiske EEG bands, som ikke er egnet til optagelse af hurtige krusninger eller højfrekvente svingninger. I fremtiden kan indretningen modificeres til at registrere de højfrekvente komponenter af signalet, men på bekostning af batteriets levetid. Forskellige typer af transducere vil omfatte blodtryk og tryk-volumen, og selv opførelse af en sender elektrodeindretning til bruger-specificerede dimensioner ifølge stereotaktiske koordinater for de ønskede hjernestrukturer.The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret gennem Statens Institut for Neurologiske og Stroke R43 / R44 NS064661.
Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Power Free Sterile Latex Surgical Glove |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
Fine burr | FST | 19007-07 | |
Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
PC-compatible computer |