Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.
Muitas doenças neurológicas progressivas em seres humanos, tais como a epilepsia, requerem modelos animais pré-clínicos que se desenvolvem lentamente a doença, a fim de testar as intervenções em vários estágios do processo da doença. Estes modelos animais são particularmente difíceis de implementar em roedores imaturos, um organismo modelo clássico para o estudo de laboratório desses transtornos. Gravação de EEG contínuo em modelos animais jovens de convulsões e outros distúrbios neurológicos apresenta um desafio técnico devido ao pequeno tamanho físico dos roedores jovens e sua dependência da barragem antes do desmame. Portanto, não existe apenas uma necessidade clara de melhorar a investigação pré-clínica que irá identificar melhor essas terapias adequadas para a tradução para a clínica, mas também uma necessidade de novos dispositivos capazes de gravação contínua EEG em roedores imaturos. Aqui, nós descrevemos a tecnologia atrás e demonstrar a utilização de um novo sistema de telemetria miniatura, especificamente para uso em ratos imaturos ocamundongos r, que também é eficaz para uso em animais adultos.
O mais antigo – e ainda o mais utilizado – técnica de gravação biopotenciais no cérebro é o eletroencefalograma (EEG). Ele é usado clinicamente para anormalidades neurológicas, incluindo a detecção apreensão 1, a localização de focos de apreensão 2, e diagnóstico de concussão 3,4. Essa técnica também é amplamente usado para fornecer informações fundamentais sobre os mecanismos do sono e para diagnosticar distúrbios do sono 5,6.
Como no diagnóstico clínico das epilepsias, o EEG se tornou indispensável para a investigação translacional em modelos animais de epilepsia tanto genética e adquirida. Em aplicações de investigação em curso, "wired" ou gravações "amarrados" são padrão, e são rotineiramente realizados em roedores adultos por semanas em um momento 7. No entanto, o ruído elétrico, artefatos de movimento, eo risco de que tethered animais vai ferir-se, puxando o cabo tem compr longosomised estes experimentos. Assim, para melhorar as condições e as taxas de sucesso experimental, precisamos desenvolver novas tecnologias que permitam a eliminação da interface com fio entre o animal e instrumentação. A área mais óbvia de desenvolvimento é o projeto e implementação de sistemas de telemetria que permite a gravações de alta qualidade, mantendo uma longa vida útil e minimizar o desconforto para os sujeitos animais. Reduzindo o tamanho físico destes dispositivos permitirá que a investigação translacional em modelos de roedores neonatais e juvenis de distúrbios neurológicos.
Gravações de baixo número de canais de EEG em ratos são empregados extensivamente para desenvolver novas terapias para suprimir crises epilépticas capaz de tradução para os seres humanos. Gravações de um ou mais locais por um período prolongado abrir muitas possibilidades para o uso de modelos de roedores de epilepsia na investigação translacional. Grande parte da investigação contemporânea neste campo tem como objectivo bloquear a ocorrência de Seiz crónicaas medidas ou o desenvolvimento de epilepsia (isto é, epileptog�ese), e tais esforços de investigação requerem extensa se EEG não contínua para ensaiar a eficácia da terapia 8 proposto; um sistema pequeno, simples, telemétrica com um, dois ou quatro canais que operam entre 0,1-100 Hz por canal irá promover fortemente esse tipo de investigação translacional. Eletrográficas apreensões ocorrem frequentemente com comportamentos mínimas (certamente sem convulsões), o que limita a utilidade de ensaios baseados em apreensões comportamentais. A estratégia de combinar a gravação de EEG e monitoramento de vídeo simultânea permite a possibilidade de capturar cada apreensão; e, além disso, estas abordagens analíticas podem permitir a avaliação quantitativa dos picos intercríticos que ocorrem no cérebro epiléptico entre os eventos 9 "ictal" (ou captura). Além disso, a capacidade de obter contínua de alta qualidade a baixo artefato gravações de EEG, para o qual a tecnologia sem fio é geralmentesuperior, vai permitir o desenvolvimento da utilização de algoritmos baseados em computador para estudar formas de onda de EEG específicas (por exemplo, teta, gama), bem como a detecção automática de convulsões, reduzindo de forma significativa a carga de trabalho do experimentador.
O modelo pré-clínico para estudar epilepsia primária crónica após lesão cerebral é o rato ou o rato, ou por meio de um quimio-convulsivante (por exemplo, ácido caínico ou pilocarpina) ou induzido electricamente o estado epiléptico (SE), que é seguido por epilepsia crónica. Sob estas condições, as convulsões severas associadas com SE ou as convulsões nos animais subsequentes epilépticos podem levar a lesão do animal ou rasgamento puxando a corda e desapertando os parafusos que mantêm a ligação do headcap. Em última análise, é esse problema que geralmente termina estas experiências, e ainda a necessidade de obter registros de EEG de alta resolução a longo prazo para experimentos que visam o desenvolvimento de novas terapias para a crônicaepilepsia é primordial. Além disso, a habitação, monitoramento e análise de dados provenientes de animais a longo prazo implantados é um investimento considerável em ambos os custos directos e tempo de investigador; portanto, a cessação prematura da experiência pode resultar em custos significativos para os pesquisadores. Como esses modelos de progresso epilepsia, as crises geralmente tornam-se mais freqüentes e mais graves 10-12, aumentando a probabilidade de que os animais são feridos, assim como a sua utilidade para o desenvolvimento de novas terapias torna-se maior. Estes animais podem desenvolver rotineiramente dezenas de crises convulsivas por dia, muitas vezes ocorrem em clusters 13.
Provavelmente um dos mais importantes desenvolvimentos da ciência biomédica tem sido o uso de gene alvo em modelos de ratos. Esta abordagem permitiu, e vai continuar a permitir que, o desenvolvimento de modelos animais de epilepsia genética que reproduzem síndromes humanos reais 14-16. Manipulações genéticas pode ser realizada comoterapias de prova de princípio para reprimir ataques epilépticos ou mesmo bloquear o desenvolvimento da epilepsia após uma lesão cerebral 17-20. Este tipo de pesquisa iria beneficiar muito a capacidade de executar high-throughput gravação contínua do EEG. Atualmente, é possível gravar a partir de ratos com ambos os sistemas de telemetria ou amarrados; No entanto, os desafios de obtenção de uma elevada qualidade, gravações, sem efeitos artificiais são substancialmente mais difíceis do que os ratos, e muitas vezes este requer várias formas de mochilas que ratinhos tentam continuamente para remover. Estresse pode aumentar gravidade das crises, frequência e / ou duração, e, assim, acabaria por modificar a epilepsia dos animais experimentais, confundindo assim o estudo. Um leve, baixo perfil pequeno sistema, telemetria miniatura irá facilitar a gravação de longo prazo EEG de modelos genéticos do rato da doença humana.
Em adição aos problemas acima descritos, o registo de EEG no modelo de roedor imaturos da doença tem seu próprio conjunto de desafios. Animais imaturos pode pesar tão pouco quanto 6 g (P8 mouse) para 17 g (P6 rato). É praticamente impossível fazer multi-dia EEG amarrados em série devido ao aumento do estresse de baraço e incapacidade para permitir criação natural do cachorro pela barragem. Até animais são desmamados, eles devem permanecer sob os cuidados da barragem. A barragem está propenso a destruir qualquer conjunto de conectores exteriorizado no filhote, terminar o filhote, e em alguns casos encerrar toda a ninhada. Além disso, o crânio roedor imaturo dificulta a montagem de pedestal qualquer eléctrodo ao crânio com integridade mecânica. Estes desafios, exclusivo para roedores imaturos, exigem uma solução inovadora para fazer gravações eletrográficas robusto e de longo prazo. Aqui vamos nos concentrar em demonstrar a implantação ea gravação de EEG usando um transmissor sem fio em miniatura romance e apresentam três experimentos de prova de princípio como exemplos de utilização do sistema de telemetria sem fio em miniatura: 1) a immadura modelo filhote de rato de hipóxia-isquemia, 2) ratos adultos tratados com DFP para induzir estado de mal epiléptico e crises espontâneas subsequentes, e 3) modelo genético de malformações cavernosas vasculares que resultam em convulsões e morte em ratos adultos.
O sistema de telemetria sem fio em miniatura foi projetado para atender quatro requisitos principais: (1) a implantação cirúrgica minimamente invasiva; (2) compatibilidade para a habitação de filhotes de roedores com a barragem e irmãos; (3) de baixo consumo de energia da unidade, permitindo assim a monitorização contínua de meses sem re-implantação cirúrgica; e (4) capacidade de gravar curvas EEG de alta qualidade com o mínimo de artefatos de movimento. O transmissor sem fios pesa <0,6, 2,3, e 4 g, e é <0,3, 0,8, e 1,4 cm3, dependendo da bateria com uma pegada de 5 x 7, 7 x 9, ou 7 x 12 mm que pode ser montada facilmente no crânio do animal com gel de cianoacrilato. Sem buchas osso são necessárias para afixar de forma segura o dispositivo parao crânio, a redução do número de furos que têm de ser perfurado no crânio e o tempo de cirurgia. O dispositivo é capaz de amplificar dois canais de EEG ou locais potenciais de campo de estruturas profundas do cérebro, tais como o hipocampo, por mais de 2 semanas, 2 meses, ou 6 meses nesta configuração. O pequeno tamanho do transmissor sem fios reduz o risco de infecção, aumenta a mobilidade dos animais, e em última análise, reduz a morbidade e mortalidade que de outra forma, aumenta o tempo, dinheiro, e número de animais necessários para uma experiência. Todos os produtos eletrônicos e bateria são envasadas em epóxi de grau médico que torna o dispositivo à prova d'água e resistente, impedindo a barragem de mascar sobre o transmissor que poderiam tornar o dispositivo inoperante. Ao contrário de transmissores de rádio-frequência, o sistema de telemetria utiliza acoplamento capacitivo entre o transmissor e uma antena de receptor que fica abaixo da gaiola animal, permitindo ao usuário manter os animais em habitação roedor padrão. Vários canais de recording permitir a gravação de biopotenciais multi-modais, como eletrocardiograma e eletroencefalograma. Modelos animais de co-morbidades, vai beneficiar a capacidade de gravar biopotenciais durante comportamento 21-23. Combinando comportamento com EEG irá fornecer aos pesquisadores uma melhor ferramenta para pesquisas e estudos pré-clínicos.
Pode ser muito caro para fazer gravações eletrográficas longo prazo em modelos pequenos animais da doença. Ao contar com circuitos elétricos simples e enfatizando baixo consumo de energia, temos sido capaz de criar um sistema transmissor (Figuras 1 e 2), que reduz o custo de experimentos de acompanhamento de longo prazo. O custo total de uma experiência de monitorização de 6 meses pode ser tão baixo quanto $ 470, mais o custo do animal (~ $ 1,5 animais por dia, US $ 200 transmissor). O pequeno tamanho do transmissor permite gravações ininterruptas contínuas eletrográficas em pequenos animais, modelos pré-clínicos de doença humana, que são muito difíceis de obter com os sistemas de gravação sem fio baseadas em rádio-frequência ou tethered (Figura 4). Finalmente, a natureza montado no crânio do transmissor reduz o tempo de cirurgia e estresse sobre o animal que pode comprometer de outra forma um experimento. Aqui, mostramos experimentos de prova de princípio de três different modelos experimentais de apreensões: perinatal hipóxia-isquemia 13, 27, 28, em um filhote de rato (Figura 4), epiléptico induzido por DFP status (Figura 5) e convulsões em um modelo induzidas geneticamente de malformações vasculares cavernoso (Figura 6).
Possivelmente, o aspecto mais crítico para a obtenção de gravações eletrográficas livre de artefato, a longo prazo é o de verificar o acesso eletrodo desinibida para a região cortical de interesse (Figura 4-6). Isso inclui o eletrodo comum de referência / chão. Especialmente importante é fixar o transmissor ao crânio para aplicações EEG epidural. Durante este processo, é possível inadvertidamente revestir a ponta dos eléctrodos com cianoacrilato dado o comprimento curto dos eléctrodos. Revestimento dos eletrodos em cianoacrilato pode atenuar os sinais de EEG ou isolá-los completamente no pior cenário. Da mesma forma, a falta de boa conexão elétrica bntre o comum de referência / chão e cérebro do animal irá impedir o funcionamento correcto do amplificador diferencial no transmissor, resultando em um "barulhento" saída de sinal electricamente. Muitas vezes, após a cirurgia, os sinais de boa qualidade pode ser comprometida por até 48 horas devido a edema em torno dos furos da rebarba no crânio. À medida que o edema diminui, em geral, melhorar os sinais. Isto pode ser evitado através da colocação dos eléctrodos na superfície do crânio sem fazer furos da rebarba. As conseqüências desse processo são o aumento potencial para revestir os eléctrodos com cianoacrilato, redução da atividade de alta frequência devido aos baixos pass-características elétricas do osso do crânio, eo potencial para isolar eletricamente o ruído comum tornando referência / terreno nos sinais. Praticando a colocação correcta de eléctrodos pode ser feito com um pequeno pedaço de madeira ou folheado que imita a espessura do rato ou do rato do crânio. Os resultados apresentados neste manuscrito ilustrar a qualidade de gravações que podem ser obtidos utilizando tecnologia de telemetria sem fios.
O implante cirúrgico, utilizando o método aqui descrito pode ter tão pouco como 10 minutos, dependendo da complexidade da cirurgia. Para o acesso cirúrgico para estruturas profundas do cérebro, tais como a região CA1 do hipocampo, é melhor para ligar o transmissor a um micromanipulador montado numa armação estereotáxica. O micromanipulador irá fornecer ao cirurgião com a precisão de implantar o transmissor de acordo com coordenadas estereotáxica publicado no Atlas do rato e rato 29 30 cérebros. Isto pode ser feito simplesmente por aderência de um pedaço de um tubo de agulha hipodérmica para o transmissor com cianoacrilato e, em seguida, a montagem da agulha hipodérmica no micromanipulador. Controlo micromanipulador de x, y, e z coordenadas vai proporcionar estabilidade adicional, quando a montagem do transmissor para o crânio antes da sutura da pele fechada. A adição de parafusos de osso em torno do perimeter do transmissor pode ajudar a ancorar o transmissor para o crânio, embora eles não sejam necessários. Os parafusos para ossos pode ser eficaz, no entanto, em certos modelos animais de epilepsia e convulsões, tais como o rato adulto tratado com lítio-pilocarpina. Estes animais tendem a ter crises convulsivas espontâneas com intensa atividade motora que podem danificar o transmissor durante a apreensão. Complexidade adicionais podem ser adicionados a estas experiências. Por exemplo, o transmissor é compatível com muitos modelos diferentes de lesão cerebral traumática, como o impacto cortical controlado 31. A durabilidade do dispositivo transmissor foi testada através da implantação de animais com transmissores em P7, e, em seguida, alojando-os na instalação para animais. Após 12 meses, a maioria dos implantes permaneceu intacto no crânio. Quando os animais foram sacrificados, os crânios parecia ser normal e o transmissor foi incorporado no osso do crânio, exigindo uma força significativa para o extrair. Tome cuidado quando as estruturas cerebrais profundassão estudados; como o cérebro cresce, e os eléctrodos de permanecer estacionário, a posição final dos eléctrodos é de esperar que altere. Para as técnicas descritas aqui, os eletrodos foram tipicamente posicionada acima da dura-máter, o que permitiu tanto o cérebro e do crânio para crescer e para eletrodos para permanecer em suas posições originais. O fator limitante em quanto tempo o transmissor pode ser usado é o tamanho da bateria (ou seja, até que a bateria se esgote).
Um design monolítico auto-suficiente (ou seja, o transmissor é incorporado em epóxi duro) de habitação do transmissor presta-se a ser usado com filhotes imaturos alojados com a barragem e seus irmãos. Muitas vezes, a co-habitação animais com amarras resultados fio implantado na destruição da ferragem implantada ou cannibalization dos filhotes por barragem. A forma de parede lisa do transmissor permite a implantação com praticamente nenhuma falha de hardware ou perda de filhotes devido a canibalização.
<p class = "jove_content"> O esquema de transmissão acoplados à capacitiva baixo consumo de energia neste sistema presta-se bem para o uso em muitos cenários experimentais diferentes, tais como a colocação em uma incubadora com temperatura controlada ou mesmo para uso com aparelhos experimentais, tais como câmaras de pletismografia. Da mesma forma, a forma da antena do receptor pode ser manipulado para caber em muitos ambientes diferentes, comportamentais, tais como o intervalo T elevado maze.The do transmissor é apenas algumas polegadas como o transmissor deve ser capaz de "carro" (par capacitivamente a) o receptor e antena baseia-se no animal a ser alojados em gaiolas padrão para roedores ou gaiola adequada coberta pela área de superfície do receptor de antena. O transmissor funciona como um pólo de um campo eléctrico ao passo que o corpo do animal actua como um outro pólo. O campo é de tal modo que determinadas linhas de orientação, tal como 90 ° fora-de-fase com a antena do receptor, vai falhar para dirigir a antena do receptor, resultando em uma "gota para fora". Esta é uma ocorrência bastante raro. Futuros trabalhos com esta tecnologia permitirá a gravação de vários animais na mesma gaiola que irá reduzir os custos de embarque e permitir a interação social. Outros desenvolvimentos irão envolver o aumento do número de canais, incluindo temperatura, e electromiograma. O design atual do dispositivo fornece uma largura de banda que é otimizado para recodificação de bandas clássicas de EEG, que não é adequada para gravação de ondulações rápidas ou oscilações de alta freqüência. No futuro, o dispositivo pode ser modificado para gravar os componentes do sinal de alta frequência, mas com o custo de vida útil da bateria. Diferentes tipos de transdutores incluirá a pressão arterial e pressão-volume, e até mesmo a construção de um arranjo de eletrodo transmissor para dimensões especificadas pelo usuário de acordo com coordenadas estereotáxicas das estruturas cerebrais desejados.The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame R43 / R44 NS064661.
Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Power Free Sterile Latex Surgical Glove |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
Fine burr | FST | 19007-07 | |
Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
PC-compatible computer |