Abstract
간질과 같은 인간의 많은 진보적 인 신경 학적 질환, 천천히 질병 과정의 다양한 단계에서의 간섭을 테스트하기 위해 질환이 전임상 동물 모델을 필요로한다. 이 동물 모델은 미성숙 설치류, 이러한 질환의 실험실 연구를위한 고전적인 모델 생물을에서 구현하는 것이 특히 어렵다. 발작 및 다른 신경 질환의 젊은 동물 모델에서 녹음 연속 뇌파 인해 작은 물리적 젊은 설치류의 크기와 댐에 대한 의존도 이유 이전에 기술적 인 문제를 제시한다. 따라서, 더 클리닉 번역 또한 미성숙 설치류 연속 EEG를 기록 할 수있는 새로운 디바이스에 대한 요구에 적합한 그러한 치료를 식별 전임상 연구를 개선하기위한 명확한 필요성뿐만있다. 여기서, 우리는 뒤에 기술을 설명하고 특히 O 미성숙 래트에 사용하기 위해 설계 신규 소형 원격 측정 시스템의 사용을 보여성인 동물에 사용하기에 효과적이다 R 마우스.
Introduction
오래된 - 여전히 가장 널리 사용 - 뇌 biopotentials를 기록하기위한 기술은 뇌파 (EEG)이다. 그것은 발작 감지 1, 발작 초점 2의 현지화 및 뇌진탕 3,4의 진단을 포함한 신경 학적 이상에 대해 임상 적으로 사용된다. 이 기술은 널리 수면의 메커니즘에 대한 기본 정보를 제공하고, 수면 장애 5,6-를 진단하기 위해 사용된다.
간질의 임상 진단에서와 같이, 뇌파는 모두 유전 인수 간질 동물 모델에서 중개 연구에 필수적이되었다. 현재의 연구 응용 프로그램에서 "유선"또는 "곁에"녹음 표준이며, 정기적으로 시간 7시에 주 동안 성인 설치류에서 수행됩니다. 그러나, 전기 노이즈, 이동 유물 및 케이블을 당겨 자신을 다치게합니다 동물을 닿는 위험이 긴 COMPR이이 실험을 omised. 따라서, 조건으로 실험 성공률을 향상시키기 위해, 우리는 동물 및 계측 간의 유선 인터페이스의 제거를 허용 할 새로운 기술을 개발해야한다. 개발의 가장 명백한 영역 설계 및 긴 수명을 유지하고 동물 피사체의 불편을 최소화하면서, 고품질의 기록이 가능 원격 측정 시스템의 구현이다. 이러한 장치의 물리적 크기를 줄이는 것은 신경 장애의 신생아 및 청소년 설치류 모델에서 병진 연구를 가능하게 할 것이다.
쥐의 낮은 채널 수의 뇌파 기록은 광범위하게 사용된다 인간에게 번역의 간질 발작이 가능한 억제하는 새로운 치료법을 개발하기 위해. 오랜 기간 동안 하나 이상의 사이트에서 녹음 중개 연구에서 간질의 쥐 모델을 사용하기위한 많은 가능성을 엽니 다. 이 분야에서 현대의 많은 연구는 만성 SEIZ의 발생을 차단하는 것을 목적으로연속적이지 EEG 모니터링 제안한 치료 8의 효과를 분석하는 경우 URES 또는 간질 (즉, epileptogenesis)의 개발 및 연구 노력은 광범위한 요구; 채널 당 0.1 내지 100 Hz의 사이에서 작동하는 하나, 두 개, 또는 네 개의 채널이 작고 단순한, 원격 측정 시스템은 강하게 병진 이러한 유형의 연구를 촉진 할 것이다. 전자 기록 발작은 종종 행동 발작을 기반으로 분석의 유용성을 제한 (확실히 경련없이) 최소한의 행동으로 발생합니다. EEG 기록 동시 비디오 모니터링을 조합의 전략은 하나마다 발작 캡처의 가능성을 허용한다; 나아가, 이러한 분석 방법은 "발작"(또는 발작) 이벤트 (9) 사이의 간질 뇌에서 발생하는 간기 스파이크의 정량적 평가를 허용 할 수있다. 또한, 연속 고품질 둘러 아티펙트 EEG 레코딩을 수득 할 수있는 능력이있는 무선 기술은 일반적우수한 크게 실험자의 부하를 줄이고, 특정 EEG 파형 (예를 들어, 세타, 감마),뿐만 아니라 발작의 자동 검출을 연구하기위한 컴퓨터 기반의 알고리즘의 사용의 개발을 허용한다.
뇌 손상 후 만성 간질 연구를위한 주요 전임상 모델은 만성 간질 뒤에 화학 - 경련 (즉, kainic 산 또는 필로 카르 핀) 또는 전기적으로 유발 된 간질 중첩증 (SE)를 통해 어느 성인 쥐 또는 마우스입니다. 이러한 조건에서, SE 또는 간질 동물의 후속 발작과 연관된 심한 경련은 동물 찢어 인한 부상 또는 밧줄을 당겨와 headcap의 부착을 유지 나사를 풀어 발생할 수 있습니다. 궁극적으로, 이것은 일반적으로이 실험을 종결이 문제 및 만성에 대한 새로운 치료법의 개발을 목표로 실험 장기 고해상도 EEG 기록을 아직 얻을 필요가간질은 매우 중요합니다. 또한, 하우징은, 모니터링, 및 장기 이식 동물로부터 데이터를 분석하는 것은 모두 직접 비용과 시간 조사자 상당한 투자이다; 따라서, 실험의 조기 종료는 연구자에게 상당한 비용을 초래할 수있다. 간질 진행이 모델로서, 발작은 일반적으로 단지 새로운 치료법의 개발에 대한 유용성으로, 동물 손상 될 가능성을 증가시키는, 더 자주 그리고 더 심한 10-12 최대가된다. 이 동물들은 일상적으로 자주 클러스터 (13)에서 발생, 하루에 경련 발작의 수십을 개발할 수 있습니다.
아마 바이오 메디컬 사이언스의 가장 중요한 개발 중의 하나는 마우스 모델에서 표적 유전자의 사용이었다. 이러한 접근은 허용하고 있으며, 허용 실제 인간 증후군 14-16 재현 유전 간질 동물 모델의 개발을 계속할 것이다. 유전자 조작 같이 수행 할 수있다원리 증명 요법 간질 발작을 억제하거나 심지어 뇌 손상 후 17-20 간질의 발달을 차단한다. 이러한 유형의 연구는 EEG의 높은 처리량 연속 기록을 수행하는 능력에서 이익을 극적 것이다. 현재, 그것은 어느 테더 또는 원격 측정 시스템과 마우스로부터 기록 할 수있다; 그러나, 고화질을 획득하는 문제는 아티팩트없는 녹화 쥐보다 실질적으로 더 어렵고, 종종 이것은 생쥐 계속 빼내 베낭의 다양한 형태를 요구한다. 따라서 스트레스 연구를 교란, 궁극적으로 실험 동물의 간질을 수정할 것이다 따라서 발작 중증도, 주파수 및 / 또는 지속 기간을 증가시키고 있었다. 소형, 경량, 박형 미니어쳐 텔레 메 트리 시스템은 인간 질병의 유전 마우스 모델에서 장기적 EEG의 기록을 용이하게 할 것이다.
상술 한 문제점에 더하여, 미성숙 설치류 모델에서 EEG 기록질병의 도전의 고유 한 집합이 있습니다. 미성숙 동물은 17g (P6 쥐)에 적은 6으로 G (P8 마우스)를 무게 수 있습니다. 이 댐에 의해 강아지의 자연 양육을 할 수 있도록 밧줄과 무능력의 증가로 인해 스트레스에 직렬 여러 날 닿는 뇌파 기록을 만들기 위해 사실상 불가능하다. 동물이 젖을 때까지 그들은 댐의 관리에 있어야합니다. 댐은 강아지 어떠한 구체화 커넥터 조립체를 파괴 강아지를 종료하는 경향이 있으며, 일부의 경우에 전체 쓰레기를 종료. 또한, 미성숙 쥐 두개골 어려운 기계적 무결성 두개골에 어떤 전극 받침대를 장착 할 수 있습니다. 미성숙 설치류 고유 이러한 과제는, 강력한 전자 기록 장기 녹화를 만들기위한 새로운 해결책이 필요하다. 1) 메신저 : 여기에서 우리는 소형 무선 원격 측정 시스템을 사용하는 예와 같은 새로운 소형 무선 송신기와 현재의 세 가지 원리 증명 실험을 사용하여 뇌파의 주입 및 녹음을 입증에 초점저산소증 - 허혈의 성숙한 쥐 강아지 모델, 2) 성인 마우스는 간질 중첩증 이후 자발적인 발작, 성인 마우스의 발작과 사망을 초래할 혈관 동굴 기형의 3) 유전 적 모델을 유도하기 위해 DFP 처리 하였다.
소형의 무선 원격 측정 시스템은 네 가지 주요 요구 조건을 충족하기 위해 설계되었다 : (1) 최소 침습 수술 이식; (2) 댐과 한배 새끼와 쥐 새끼의 주택에 대한 호환성; 따라서 수술 재 주입없이 지속적인 모니터링 개월 허용 부 (3) 낮은 전력 소모; (4) 최소한의 운동 능력 아티팩트 고품질 EEG 파형을 기록한다. 무선 송신기는 <0.6, 2.3, 4 g의 무게, 0.3 <0.8, 1.4 cm 3은 쉽게 두개골에 마운트 X 7 5의 풋 프린트, 7 × 9, 7 × 12 mm의 배터리에 따라 시아 노 아크릴 레이트 젤 동물의. 어떤 뼈 나사 앵커는 안전하게에 장치를 부착 할 필요 없다두개골과 수술시 천공해야 할 홀의 개수를 감소 두개골. 장치는 2 주 이상, 11 개월, 또는 이러한 구성에서 6 개월 등 해마 깊은 뇌 구조에서 EEG 또는 로컬 필드 전위의 두 개의 채널을, 증폭시킬 수있다. 무선 송신기의 작은 크기, 감염의 위험을 감소 동물의 이동성을 증가시키고, 궁극적으로 다른 실험에 필요한 동물의 시간, 돈, 그리고 수를 증가 이환율과 사망률을 감소시킨다. 전자 및 배터리 모두 다르게 장치가 작동하지 않을 수있는 송신기 씹는 댐 방지 장치는 방수 및 터프하게 의료용에 에폭시 포팅된다. 무선 - 주파수 송신기는 달리, 원격 측정 시스템은 송신기와 사용자가 표준 설치류 하우징 내에 동물을 유지 할 수 있도록, 동물 케이지 이하 앉는 수신기 안테나 사이의 용량 성 커플 링을 사용한다. recordi의 다중 채널NG는 심전도 및 뇌파 멀티 모달 biopotentials의 녹음 할 수 있습니다. 동반 질환의 동물 모델은 동작 중에 21-23 biopotentials를 기록하는 기능에 의해 유익 할 것이다. 뇌파 모니터링 동작을 결합하여 연구 및 전임상 연구를위한 더 나은 도구와 연구자를 제공 할 것입니다.
Protocol
수술 도구 살균을위한 동물 보호를위한 제도적 지침에 따라, 그리고 지침을 준수하고 기관의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 얻기 위해 필요한 프로토콜을 수정합니다.
1. 수술 준비
- 깨끗하고 안전한 무균 수술을 보장하기 위해 송신기를 준비합니다. 정전기 방지 포장에서 송신기와 하나 스프레이를 제거 또는 70 % 에탄올에 담가. 멸균면 스폰지 멸균 식염수에 담가 또는 멸균 생리 식염수에 빠져들 계속 사이의 멸균 생리 식염수와 장소 린스 송신기.
- 수집 및 수술에 필요한 도구를 소독; 살균 스팀 오토 클레이브. 수술 도구의 목록을 재료 및 시약의 표를 참조하십시오.
2. 수술 주입
- 동물을 마취 및 IACUC 승인 프로토콜에 따라 마취를 유지한다. 시작에서와 쉬르시GERY는 발가락 - 핀치 반사마다 15 분을 선택합니다. 응답의 부족은 마취의 충분한 수준을 나타냅니다.
- 새끼를 들어, O 2 (100 %)와 이소 플루 란 (4 %)으로 마취를 사용합니다. 성인을위한, 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)와 케타민 (100 ㎎ / ㎏)를 사용합니다.
- 정위 프레임의 위치를 수정합니다. 청각 (外耳道)에 귀 막대 끝을 놓습니다. 두개골이 젊은 쥐 새끼에 매우 부드럽고으로 과도하게 귀 막대를 조이지 마십시오. 마취 코 콘을 고정합니다.
- 37 ° C로 설정 가열 패드에 배치하여 수술 중 동물을 따뜻하게 유지합니다. 성인 동물에서, 동물의 눈 연고 윤활 적용.
- 절개 부위를 소독 및 멸균 수술 필드를 유지한다.
- 70 % 에탄올과 betadine의 교류 응용 프로그램과 두피를 닦아. 두피의 중심에서 시작하여 점점 더 넓은 동심원을합니다.
- 드레이프와 동물을 덮고 드리 워진 동물을 통해 수술을 실시하고 있습니다. steri 유지70 % 에탄올로 살균 커튼, 스프레이 장비와 수술 셋업을 안감으로 제작 수술 분야.
- 멸균 수술 장갑과 가운을 착용 (또는 기관에서 필요로하는 사양에 따라). 멸균 필드를 유지하려면, 수술 보조를 사용합니다.
- 약간 정중선을 따라 눈, 약 2cm 뒤에 동물의 두피에 절개를합니다. 두개골은 아직 젊은 쥐 새끼에 매우 부드럽고으로 메스를 삽입 할 때주의해야합니다. 절개가 적은 출혈, 빠른 치유 있도록 하나의 상처를 확인합니다.
- 두개골을 노출. 송신기와 두개골의 뼈 사이의 결합을 극대화하기 위해 깨끗하고 건조한 장소를 준비합니다. 두피를 파악 동맥류 클립을 사용합니다.
- 부드럽게 네 모서리에 떨어져 중간 선에서 두피를 잡아 당깁니다. 같은 두개골의 브레 그마 및 람다와 같은 해부학 적 랜드 마크를 찾아보십시오. 기억 두개골 뼈는이 나이에 동물에 융합되지 않습니다. 버 구멍의 정확한 위치를 찾을 정위 좌표의 Paxinos 아틀라스를 사용합니다.
- 버 형 드릴 비트와 드레 멜 형 도구를 사용합니다. 구멍의 직경보다 더 큰 300 μm의 존재와 원하는 녹화 위치에 두 개의 버 구멍을 만듭니다. 두개골의 람다 뒤에 소뇌를 통해 기준 전극에 대한 버 구멍을 배치합니다.
- 송신기에 와이어가 버 구멍과 정렬되어 있는지 확인합니다. 전극 와이어가 정렬되지 않은 경우, 전극의 접착제 오염 가능성, 불량 신호가 발생한다. 와이어를 정렬하려면, 송신기의 적합성을 확인하고 부드럽게 버 구멍의 의도 된 사이트를 통해 줄을 전극을 구부리십시오.
- 전극 리드를 낸다. 원하는 길이로 전극을 손질하는 수술 가위를 사용합니다. 전극의 깊이는 실험에 필요한 기록의 유형에 중요하다 (즉, 뇌파 기록에 대한 경질 위의 전극을 배치, 또는 정의 뇌 구조에 대한 정위 좌표를 사용한다).
- 자유롭게 송신기 T의 기초에 시아 노 아크릴 레이트를 적용오 전극을 코팅 않도록 확인하고 영역을 커버. 시아 노 아크릴 레이트 접착제없이 신호가 발생합니다 접착제 전극 오염, 전기 절연체입니다.
- 깊은 뇌 구조에서 녹화하는 경우, 캐 뉼러 홀더에 송신기를 탑재하고, Z 축 제어를위한 정위 아암에 배치. 깊이가 적절한 송신기 주위에 시아 노 아크릴 레이트 겔을 배치 정위 아암을 이용하여 송신기를 낮춘다.
- 강한 접착력을 보장하기 위해 송신기를 배치하기 전에 철저히 건조 두개골. 두개골에 시아 노 아크릴 레이트로 코팅 된 송신기를 적용합니다. 버 구멍을 대응하는 전극을 정렬주의하십시오.
- 손상의 주요 혈관 구조를 피하십시오. 일분에 대한 약간의 압력으로 장소에 송신기를 잡습니다. 송신기와 두개골 사이에 강한 결합을 형성하기 위해 약간의 압력을 사용합니다.
- 완전히 송신기 / 두개골 인터페이스를 밀봉 할만큼 추가 시아 노 아크릴 레이트를 적용합니다. AG를 보장하기 위해OOD 착용감과 강한 결합은, 그 접점 두개골 접착제의 표면적을 극대화. 모두 두개골과 송신기의 벽이 포함되어 있는지 확인하고, 송신기 주위에 원에서 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 적용합니다.
- 이식 송신기의 기지에서 시아 노 아크릴 레이트 주위에 주사기를 통해 화학 촉진제 (0.1 ml)에 적용합니다. 인접 조직에 적용 할 않도록주의하면서, 드물게 촉진제를 사용합니다.
주 : 시아 노 아크릴 레이트의 경화 화학 가속 송신기와 두개골 사이의 강한 결합이 빠르게 형성되는 것을 보장한다. 시아 노 아크릴 레이트 촉진제는 접착제의 속도 경화에 유용하지만, 필요하지 않습니다. - 멸균 식염수로 철저하게 지역을 세척하여 촉매제를 제거합니다. 절개의 영역에서 세척하지 않을 경우 시아 노 아크릴 레이트 가속기는 조직에 자극을 줄 수 있습니다. 지역을 세척하기 위해 멸균 식염수 1.0 ML의 주사기를 채우고 주사기 바늘을 통해 지역을 관개. 일반적으로 생리 식염수 0.5ml를 씻어 충분가속기.
- 송신기의베이스 주변 피부를 봉합되지만 송신기를 포함하지 않는다. 송신기의 최고 효율적으로 신경 신호를 전송하기 위해 피부 이상이어야합니다. 피부는 송신기와 기기 주변 접착제 주위에 합리적으로 단단히해야한다. Vicryl 또는 실크 봉합사 (소프트 스레드)를 사용하여; 미성숙 동물의 피부가 부드러운 촉감 봉합사가 사용되지 않는 경우에 쉽게 손상된다. 성인 동물의 경우, 모든 봉합 재료를 사용합니다.
- 고정대에서 동물을 제거하고 복구를 위해 가열 담요에 배치합니다.
- 동물 댐에 반환하기 전에 (37 ° C) 따뜻하고 외래 (즉, 완전히 복구)입니다 확인합니다. 동물은 동물의 뒷면에있는 피부 (동물이 탈수있는 경우, 피부가 변형 남아) 곤란에 의해 수화되어 있는지 확인합니다. 동물이 탈수의 경우, 락 테이트 링어의 버퍼의 서브 피부 주입을 관리 할 수 있습니다. 그것을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오흉골 드러 누움.
- 수술 후 통증 관리 및 주사 부위 주변에 0.1 ml의 부피 바카의 하위 피부 주입 동물 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏)을 관리합니다.
참고 : 시작은 전체 절차는이 세 (생후 6 일)의 동물 용 5 ~ 10 분에 완료되어야 완료에 이르기까지. 수술 시간은 오래된 동물이 오래 걸릴 수 있습니다.
- 수술 후 통증 관리 및 주사 부위 주변에 0.1 ml의 부피 바카의 하위 피부 주입 동물 프레 노르 핀 (0.05 ㎎ / ㎏)을 관리합니다.
3. 관리 및 주택
참고 : 일부 댐은 해당 장치와 함께 이식 새끼를 허용하지 않을 수 있습니다. 댐은 관대 한 사람을 선택해야 할 수도 있습니다. 댐은 송신기에 의해 그들을 선택하여 케이지 주위에 새끼를 이동하는 것이 허용됩니다.
- 동물 이유되면, 자신의 케이지 메이트에서 장치의 제거를 방지하기 위해이를 단독으로 사내.
- 고통의 흔적이 존재 (벨 항아리에) 치명적인 펜 토바 비탈의 용량 (25 ㎎ / ㎏) 또는 이소 플루 란으로 동물을 안락사.
- 와이어 삽입과 일부 동물 주택 케이지를 참고 할 수있다 간이식 송신기와 FERE. 동물 와이어 삽입의 '바'사이에 끼 송신기를 얻을 수 있는지 확인하기 위해 와이어 삽입의 높이를 확인하시기 바랍니다. 도움을 수의사에게 문의하십시오.
4. 녹음 뇌파
- 자체 또는하여 케이지에 동물을 배치 한배 새끼와 댐와 공동 보관. 그러나 장소는 하나 하나의 새장에 동물을 이식. 2 개 이상의 시간 동안 녹화 실에서 혼자 새끼를 두지 마십시오. 고통과 탈수의 징후 동물을 모니터링합니다.
- 수신기베이스에 제공되는 전원 공급 장치를 연결하고 전원 표시등이 켜져 있는지 확인합니다. (총검 닐 - Concelman) BNC 케이블을 이용하여 데이터 수집 시스템에 수신기베이스를 연결한다.
- 수신기베이스 (그림 2)의 상단에있는 동물 케이지를 놓습니다. "신호"빛은 송신기가 감지되었습니다 나타내는 조명한다. 데이터는 이제 기록 될 수있다.
- 티O 기록 데이터는, 아날로그 - 디지털 변환기 수신기베이스를 연결하고, 컴퓨터 (도 1)에 컨버터를 연결한다.
- 기록의 샘플링 레이트를 설정한다. 데이터를 확인하는 것은 제대로 샘플링된다. 기록을 위해 적어도 250 Hz의 샘플링 속도 (권장 500 Hz에서)를 선택 (송신기의 대역폭은 0.1 내지 100 Hz에서).
- 디지털화 된 데이터를 저장 및 matlab에 같은 신호 처리 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석 할 수 있습니다.
5. 뇌파 분석 - 일반
- 0-100 Hz의 주파수에서 시간 도메인으로 EEG 데이터 변환의 FFT (고속 푸리에 변환)를 수행한다.
- 10 X로 웰치 방법 및 정규화에 기초하여 256에서 Hann 윈도우 세그먼트를 사용 FFT로부터 전력 스펙트럼 밀도 (PSD를)의 추정값 (10) (PSD)을 로그를 수행한다. 전력 스펙트럼은 원하는 기간 동안 EEG 신호를 지배하는 특정 주파수를 나타낸다.
- 각 동물에서 PSD의 평균을 취함으로써 동물에서 그룹 데이터시간이 일치하는 치료를 통해. n은 동물의 수 (PSD 흔적을)은 1.96 X 평균 (PSD) / 제곱근 (N) 95 % 신뢰 구간을 만듭니다. 이러한 대조군 대 투여군과 비교로서 동물의 코호트 걸쳐 EEG의 전체 주파수 성분의 정량 보고서를 생성하기 위해 데이터의 평균 및 95 % 신뢰 구간을 그린다.
6. 주 산기 저산소증 - 허혈 (HI) 모델 프로토콜
- P6를 마취 - 7 쥐 강아지 (마취 기화기의 입력과 상자) 마취 상자에 동물을 배치하여 이소 플루 란 마취 (100 % O 2와 4 %)를 사용. 시작에서 수술 중에 발가락 핀치는 매 15 분 리플렉스 확인합니다. 응답의 부족은 마취의 충분한 수준을 나타냅니다.
- 그 뒷면에있는 강아지를 놓고 70 %의 에탄올과 10 % betadine의 교류 응용 프로그램과 목 스크럽을 노출. 에탄올 / betadine 스크럽 3 번 반복합니다.
- S와 목의 피부에 1cm의 절개를합니다목의 중간 선에서 cissors. 집게로 피부를 들어 올려 가위로 절단을합니다. 절개를 할 때 근육 조직을 절단하지 않도록주의하십시오.
- 경동맥 동맥을 노출 무딘 절개 기법을 사용합니다. , 무딘 절개를 수행 뭉툭한 코 집게 두 쌍을 사용합니다. 조직에 팁을 삽입하고 수술기구의 스프링 작용이 조직을 확산 할 수 있습니다. 경동맥이 노출 될 때까지 반복합니다. 밝은 붉은 색과 볼 수 펄스의 존재에 의해 경동맥을 확인합니다.
- 무딘 집게를 사용하여 미주 신경에서 별도의 경동맥. 동맥과 신경 사이의 무딘 팁 집게를 삽입합니다. 집게를 해제하고 도구의 스프링 작용이 미주 신경에서 경동맥을 분리 할 수 있습니다.
- 장소 동맥류는 경동맥에 떨어져 4-5mm 클램프. 빠른 동작을 피함으로써 클램프와 동맥을 손상하지 않도록주의하십시오.
- 동맥류 클램프 사이의 경동맥을 소작. 동맥 소작뜨거운 cauterizer 팁과 클램프 사이의 동맥을 터치합니다. 동맥이 절단 된 후, 양단이 제대로 출혈을 방지하기 위해 소작되도록.
- , 클램프를 제거 3 봉합와 목 절개를 닫습니다. 만 근육 조직을 봉합하지 않도록주의, 피부를 봉합.
- 동물이 1 시간 동안 복구 할 수 있습니다. 동물의 호흡을 모니터링하고 목에서 출혈. 출혈이있는 경우, HI (단계 6.10)에 동물을 가하지 않는다.
- 37 ℃에서 온도 조절 챔버에 동물을 넣고 2 시간 동안 연속적으로 챔버 내로 8 % O 구십이분의이 미드 1이 혼합물을 소개한다.
Representative Results
우리가 개발 한도 1에 도식화 한 성인 쥐에서 EEG 기록의 개념을 구현 IACUC 승인 프로세스를 들어, 설계가 아니라 기관 동물 시설을 기존에 통합한다.; 따라서, 시스템이 쉽게 추가 공간을 이용하지 않고 표준 동물 시설에 설치 될 수 있도록 설계되었다 : 동물 줄이고 통합 패러데이 케이지 수신기의 내부에 배치되는 일반적인 "동물 시설 발행"수납 케이스 내에 수납되고 전기 노이즈. 각각의 수신기의 기지국으로부터 신호를 컴퓨터 (도 1)에 접속된다 디지타이저에 와이어에 의해 수행된다. 단일 컴퓨터는 사용자의 데이터 수집 시스템의 능력에 따라서, 동시에 32 개까지 기록 된 동물로부터 데이터를 수집 할 필요가있다. 설정이 유형의 적은 전력을 소모하며, 작은 열, 기후 제어 동물 시설과 호환되는 기능을 생성합니다. 데이터가 될 수 있습니다외장형 하드 드라이브, 모니터에 실시간으로 표시되는 실험적 모니터링을 가능하게하고, 장기간 저장 (10 TB 기억 부).
댐에 의한 쓰레기 동료와 강아지 잠식에 의한 피해를 최소화하기 위해, 우리는 다양한 송신기 폼 팩터를 테스트했다. 최종 디자인은 돔형 실린더이었다; 쥐를 물고 손상 어려운 모양. 성인 쥐의 두개골에 대한 개별 송신기는도 2a에 도시되어 있고, 고밀도 (32 동물) 수신기 염기 및 표준 설치류 하우징이 배치 된 기록 릭 초기 버전은도 2b에 도시된다. 전력 효율은 매우 중요한 고려 사항이었다; 우리는 데이터 전송 프로토콜로의 용량 성 결합을 선택했다. 다음과 같은 설계는 배터리 용량 (그림 2A)에 따라 6 개월 이상 지속적으로 뇌파를 기록 할 수 있습니다. 생후 12 일 (P12, 그림 3A)로 젊은 마우스 및 P6 한 젊은 쥐 (FigurE 3B)는 매우 잘 견딜 송신기. 뇌파 데이터의 연속 수집을 유지하면서 시아 노 아크릴 레이트와 두개골에 송신기를 준수하는 것은, 동물 성인 (그림 3C)에 송신기와 함께 성장 할 수 있습니다.
송신기와 무선 인터페이스의 독특한 소형 폼 팩터는 신자유 및 주 산기 조건의 동물 모델 일을 빌려 준다. 도 4의 데이터는 P7의 Sprague-Dawley 계에서 저산소 허혈 (HI) 경색 (8 % O 2 혼합물과 저산소증 2 시간 뒤에 경동맥의 결찰) 다음 아 급성 발작의 EEG 기록의 두 채널들을 나타낸다 쥐 강아지 (13). HI 치료는 경동맥 결찰에 반구 동측에 큰 병변이 발생합니다. 여기에, 녹음 부상 뇌의 두 반구를 통해 일반화 된 두 발작의 클러스터를 보여줍니다. 검은 추적 병변에 반구의 반대편에 뇌파 활동을 보여,블루 추적 (병변의 영역에서 즉) 동측 반구에서 뇌파를 보여줍니다. 발작은 뇌의 두 반구에 존재하지만, ispilateral 반구 지속적인 뇌 손상 21 나타내는 EEG 배경 억제를 나타낸다.
간질 중첩증이 유기 인계, DFP 22,23으로 동물을 주입함으로써 성인 쥐에서 유도 될 수있다. 간질 지속 상태를 나타내는도이다도 5는 반복적 인 EEG 방전의 데이터는 (시간적 확장도 5a를 참조 B). 샘플 트레이스 아래에서 12 시간 이상 간질 지속 상태의 시간 과정은 시간이 지남에 따라 발작의 강도를 정량화 비선형 혼합 효과 모델을 이용하여 분석되었다. 간질 지속 상태의 심각도는 감마 밴드 (20-60 Hz) 단위 EEG 전력에 의해 정의된다. 여기서, 상기 전력은 12 동물에 걸쳐 평균 95 % 신뢰 구간과 함께 12 시간 동안 플롯 하였다. 목 전자 데이터는 동물들이 연속적으로 모니터링 하였다 동안 12 시간 동안 지속 DFP 처리의 제 시간 내에 감마 전력의 현저한 증가를 나타낸다. 분석의 다음과 같은 방법은 급성 간질 중첩증의 정도의 정량적 측정을 허용, 현상은 이전에 행동 조치를 주로 분석 하였다. 이 고전적인 EEG 대역에서 전력 계산을 이용한 광범위 실험실 24-26에서 항 경련제 약물의 효능을 테스트하기위한 임상 시험에서 사용 되었기 때문에 우리는, 예로서 이러한 분석 기술을 포함한다. 아마도 무선 원격 측정과 연속, 중단없는 무선 녹음을 만드는 가장 중요한 측면은 낮은 빈도로 발생하는 비정상적인 자발적인 이벤트를 기록 할 수있는 기능입니다. 이러한 유형의 데이터는 무선 송신기 시스템의 다양한 유틸리티를 보여준다.
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그림 1. 에포크 기록 시스템의 개략도 무선 기록 시스템은 두 요소로 구성 1) 생체 신호를 증폭하고, 2) 수용기 판 표준 설치류 하우징 아래에 배치 무선 두개골 탑재 송신기. 수신기 기반의 출력은 4 V 피크 - 피크의 최대 증폭 복조 이루어진 생체 신호의 아날로그 신호이다. 이 신호는 기록을위한 데이터 수집 시스템에 공급 될 수있다.
그림 2 :. 송신기와 수신기는이 특정 무선 송신기 (A)는 4g과 변위 <3 쉽게 쥐의 두개골에 장착 된 볼륨의 7 × 12 mm의 풋 프린트와 1.4 cm 무게. 배터리 드레인은 그 후에 송신기는 최대 6 개월 동안 biopotentials 2 채널을 증폭 할에디션. 큰 배터리는 긴 촬영 시간에 사용될 수있다. 동물 신기원 수신기 (B)의 상단에 표준 설치류 caging에 배치됩니다. 두 개의 기록 리그를 동시에 기록 리그의 각각의 상대적으로 작은 풋 프린트 (2 '× 4', 약 60cm X 120cm)를 보여 (16) 동물에서 기록 할 수있는 각각의 초기 예는 오른쪽에 보여진다.
그림 3 :. 쥐와 생쥐의 무선 송신기을 주입 송신기는 생후 12 일 (P12, 위)로 젊은 쥐에서 최대 6 개월 연속 뇌파 녹음을 할 수 있습니다. 중간 사진은 소형 송신기 이식 P7 쥐 강아지입니다. 동물이 성숙 송신기는 단단히 두개골에 부착 된 상태로 유지됩니다. 맨 아래에있는 동물은 P280과 연령 P7에서 가짜 송신기로 이식되었다. 시스템 simulta있게여러 동물 neous 연속 EEG 레코딩은 전임상, 장기간 모니터링 EEG 연구에 필요한 새끼의 수를 줄일 이유 통해 P7 세.
그림 4 : 원격 측정 시스템과 저산소증 - 허혈에 의한 발작을 기록 듀얼 채널 8 % O 2 처리 (저산소증) 동안 경동맥 결찰 (허혈) 후 P7 쥐 강아지의 무선 원격 측정과 비정상 뇌파의 듀얼 채널 녹음.. (A) 및 (B)는 파형의 뷰를 확장. 발작은 허혈성 경색 (파란색)와 반구에 존재하는 실질적인 뇌파 억제와 두 반구 (검정, 파랑)에 존재한다.
그림 5 : 상태 epilepti 기록응답 소형 무선 원격 측정 시스템과 기분이야 성인 쥐. 표면 뇌파 기록 (즉, 경막) 성인 쥐 (DFP) 치료를 디 이소 프로필합니다. 상단 추적 (A와 B)의 음영 기간은 아래의 흔적에 파형의 전망을 확장됩니다. 무선 송신기로 기록 데이터는 동물의 코호트 통계적 비교를 가능하게 주파수 영역에서 분석 될 수있다. (C) 데이터는 DFP의 투여 후 12 시간 이상의 DFP 유도 간질 중첩증 (N = 12) 다음 감마 대역 전력 (20-60 Hz에서)의 평균 및 95 % 신뢰 구간이다.
그림 6 :. 혈관 동굴 기형의 형질 전환 마우스 모델에서 뇌파에서 발작과 변화의 기록 여기, 우리가 형질 전환 마우스에서 기록 () 일AT는 발작을 겪고있다. 우선, 통상의 EEG 패턴은 존재 (1); 즉시 발작 전에 다섯 발작 (3)의 클러스터 뒤에 미리 발작 우울증 (2)의 기간이 존재한다. 발작에 이어, 비정상적인 발작 방전 신호 (4)에 존재한다. 제어 동물은 더 발작없이 비정상적인 뇌파 기능 (B)를이 없습니다.
Discussion
이는 질병의 작은 동물 모델에서 장기 전자 사진 촬영을 해 매우 비쌀 수있다. 간단한 전기 회로에 의존하고, 저전력 소비를 강조함으로써 장기간 모니터링 실험 비용을 감소 송신기 시스템 (도 1 및도 2)을 만들 수 있었다. 6 개월 모니터링 실험의 총 비용은 4백70달러 낮은 수, 플러스 동물 (~ 일당 $ 1.5 동물 200 달러 송신기)의 비용을 수 있습니다. 송신기의 작은 크기는 작은 동물에 연속 중단 전자 사진 기록, 테더 또는 무선 주파수 기반 무선 레코딩 시스템 (도 4)를 수득하는 것은 매우 어려운 인간 질병의 임상 전 모델을 허용한다. 마지막으로, 송신기의 두개골 장착 자연 달리 실험을 손상시킬 수 동물에서 수술 시간 및 스트레스를 감소시킨다. 여기서 우리는 세 DIFF에서 원리 증명 실험을 보여발작의 erent 실험 모델 : 주 산기 저산소증 - 허혈 (13), (27), 쥐 강아지 28 (그림 4), DFP에 의한 간질 중첩증 (그림 5)와 동굴 혈관 기형의 유전자 유도 모델에서 발작 (그림 6).
어쩌면 아티팩트없는 장기 전자 기록 레코딩을 얻기위한 가장 중요한 측면은 관심있는 피질 영역 (도 4-6)에 전극 자유로운 액세스를 검증하는 것이다. 이 공통 기준 / 접지 전극을 포함한다. 특히 중요 경막 EEG 애플리케이션의 두개골에 송신기를 연결한다. 이 과정에서, 상기 전극의 길이가 매우 짧은 주어진 시아 노 아크릴 레이트와 전극 팁 부주의 코팅 할 수있다. 시아 노 아크릴 레이트로 전극에 코팅하여 EEG 신호를 감쇠 또는 완전히 최악의 경우에 그것들을 분리 할 수있다. 양호한 전기적 접속 B의 유사 부족etween 공통 기준 / 접지와 전기적 "노이즈"신호 출력 결과 송신기에서 차동 증폭기의 올바른 동작을 방지 할 동물의 뇌. 종종, 수술 후, 좋은 품질의 신호는 두개골 버 홀을 둘러싸 인한 부종에 최대 48 시간 동안 노출 될 수있다. 부종이 가라 앉을 때, 신호는 일반적으로 개선. 이 버 홀을 만들지 않고 두개골 표면에 전극을 배치함으로써 방지 될 수있다. 이 프로세스의 결과는, 시아 노 아크릴 레이트로 코팅하는 전극 전위를 증가 고주파 활성 감소로 인해 두개골 뼈 저역 전기적 특성, 및 전위는 전기적 신호에 공통 기준 / 접지 렌더링 잡음을 분리한다. 전극 연습 정확한 배치는 마우스 또는 쥐의 두개골의 두께를 모방 목재 또는 베니어의 얇은 조각으로 이루어질 수있다. 이 논문에 제시된 결과는 ...로서 예시무선 원격 측정 기술을 사용하여 얻을 수있다 레코딩 품 질 문.
본원에 기재된 방법을 이용하여 외과 적 이식 수술의 복잡성에 따라, 적은 10 분 걸릴 수있다. 이러한 해마 CA1 영역 깊은 뇌 구조, 외과 액세스를 들어, 정위 프레임에 장착 미세 조작기에 송신기를 연결하는 것이 최상이다. 미세 조작기 마우스 (29)와 쥐 (30) 두뇌의지도 책의 출판 정위 좌표에 따라 송신기를 이식 정확하게 의사를 제공 할 것입니다. 이것은 단순히 시아 노 아크릴 레이트와 송신기에 피하 주사 바늘 튜브의 조각을 시침 한 후 미세 조작기에 피하 주사 바늘을 장착하여 수행 할 수 있습니다. 종래 피부 봉합 폐쇄로 두개골에 송신기를 장착 할 때, X, Y, Z 좌표의 미세 조작기 제어 추가적인 안정성을 제공 할 것이다. PE 주위 뼈 나사의 추가송신기 rimeter들은 필요하지 않지만, 두개골에 고정 송신기를 도울 수있다. 뼈 나사는 리튬 - 필로 카르 핀 처리 된 성인 쥐 같은 발작 및 간질의 특정 동물 모델에서, 그러나, 효과적 일 수있다. 이 동물은 발작 중 송신기가 손상 될 수 있습니다 강렬한 모터 활동과 자발적인 경련 발작을하는 경향이있다. 추가의 복잡성은 이러한 실험에 첨가 될 수있다. 예를 들어, 상기 송신기는 제어 된 피질 충격 31 외상성 뇌 손상의 많은 다른 모델과 호환된다. 송신기 장치의 내구성은 동물 시설에서 그들을 수용 다음 P7에서 송신기와 동물에 주입하고, 테스트 하였다. 12개월 후에 임플란트의 대부분은 두개골에 그대로 남아 있었다. 동물 안락사 때, 두개골이 정상으로 나타나 송신기는 압축을 해제 상당한 힘을 필요로 두개골 뼈에 포함되었다. 때 깊은 뇌 구조주의공부하다; 뇌가 증가하고, 전극 고정 남아, 전극의 최종 위치를 변경할 것으로 예상된다. 여기에 설명 된 기술의 경우, 전극은 일반적으로 원래의 위치에 남아 전극 뇌와 두개골 모두 성장시키고 경질 위와 위해 배치되었다. 송신기가 사용될 수있는 기간에 제한 요소가 배터리 크기 (즉, 배터리가 소진 할 때까지).
송신기의 하우징 (송신기가 하드 에폭시에 포함 즉) 자체에 포함 된 모 놀리 식 디자인은 댐과 한배 새끼와 함께 보관 미숙 새끼와 함께 사용할 빌려 준다. 종종, 공동 주택은 댐에 의해 이식 된 하드웨어 나 새끼의 잠식의 파괴에 유선 테더 결과에 동물을 이식. 송신기의 부드러운 벽의 형태는 사실상 하드웨어 오류 또는 잠식으로 인해 새끼의 손실을 주입 수 있습니다.
Disclosures
박사. Lehmkuhle와 두덱은 Epitel, Inc.의 신기원 무선 바이오 포텐셜 기록 시스템의 설계자에 재무 적 이해 관계를 가지고있다.
Acknowledgments
이 작품은 신경 질환의 국립 연구소와 스트로크 R43 / R44 NS064661를 통해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Powder Free Sterile Latex Surgical Glove |
| Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
| Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
| Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
| Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
| Fine burr | FST | 19007-07 | |
| Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
| Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
| Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
| Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
| Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
| Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
| Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
| Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
| Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
| Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
| Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
| Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
| PC-compatible computer |
References
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