Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.
Många progressiva neurologiska sjukdomar hos människor, såsom epilepsi, kräver prekliniska djurmodeller som långsamt utvecklar sjukdomen för att testa interventioner i olika skeden av sjukdomsprocessen. Dessa djurmodeller är särskilt svåra att genomföra i omogna gnagare, en klassisk modellorganism för laboratoriestudie av dessa sjukdomar. Inspelning kontinuerlig EEG i unga djurmodeller av anfall och andra neurologiska sjukdomar utgör en teknisk utmaning på grund av den lilla fysiska storleken av unga gnagare och deras beroende av dammen före avvänjning. Därför finns det inte bara ett tydligt behov av att förbättra preklinisk forskning som bättre kommer att identifiera de behandlingar som lämpar sig för översättning till kliniken, men också ett behov av nya apparater som kan spela in kontinuerligt EEG i omogna gnagare. Här beskriver vi tekniken bakom och demonstrera användningen av en ny miniatyr telemetrisystem, speciellt konstruerad för användning i omogna råttor or möss, som också är effektiva för användning hos vuxna djur.
Den äldsta – och fortfarande den mest använda – teknik för inspelning av biopotentialer i hjärnan är ett elektroencefalogram (EEG). Det används kliniskt för neurologiska abnormiteter, inklusive beslag detektering 1, lokalisering av anfalls foci två, och diagnos av hjärnskakning 3,4. Denna teknik används också ofta för att ge grundläggande information om mekanismerna för sömn och för att diagnostisera sömnstörningar 5,6.
Liksom i den kliniska diagnosen av epilepsier har EEG blivit en nödvändighet för translationell forskning i djurmodeller av både genetiska och förvärvade epilepsi. I nuvarande forskningsansökningar, "fast" eller "bundna" inspelningar är standard, och är rutinmässigt hos vuxna gnagare i flera veckor i taget 7. Men elektriskt brus, rörelse artefakter, och risken för att bundna djur ska skada sig genom att dra i kabeln har långa compromised dessa experiment. Således, för att förbättra experimentella betingelser och träffsäkerhet, måste vi utveckla ny teknik som gör det möjligt för eliminering av kabelgränssnitt mellan djuret och instrumentering. Den mest uppenbara utvecklingsområde är utformningen och genomförandet av telemetrisystem som möjliggör högkvalitativa inspelningar, samtidigt som en lång livslängd och minimera obehag för djur. Att minska den fysiska storleken på dessa enheter kommer att göra det möjligt för translationell forskning i neonatala och juvenila gnagarmodeller av neurologiska sjukdomar.
Låg kanal-count EEG inspelningar i råttor används i stor utsträckning för att utveckla nya behandlingar för att undertrycka epileptiska anfall kan översättningen till människor. Inspelningar från en eller flera platser för en längre period öppna många möjligheter för användning av gnagarmodeller av epilepsi i translationell forskning. Mycket av den samtida forskningen på detta område som mål att blockera uppkomsten av kronisk Seizgärder eller utveckling av epilepsi (dvs epileptogenes), och sådana forskningsinsatser kräver omfattande om inte kontinuerlig EEG-övervakning för att analysera effekten av den föreslagna terapin 8; en liten, enkel, telemetrisystem med en, två eller fyra kanaler som är verksamma mellan 0,1-100 Hz per kanal kommer starkt att främja denna typ av translationell forskning. Elektro anfall inträffar ofta med minimala beteenden (förvisso utan konvulsioner), vilket begränsar nyttan av analyser baserade på beteende anfall. Strategin att kombinera EEG inspelning och samtidig videoövervakning tillåter en möjlighet att fånga varje beslag; och dessutom kan dessa analytiska metoder kan kvantitativ bedömning av Interiktal spikar som förekommer i epileptisk hjärn mellan "ictal" (eller beslag) händelser 9. Dessutom, som den trådlösa tekniken är förmågan att få fortsatt hög kvalitet till låg artefakt EEG inspelningar i allmänhetöverlägsen, kommer att möjliggöra utveckling av användning av datorbaserade algoritmer för att studera specifika EEG-vågformer (t.ex. theta, gamma), samt automatisk detektering av anfall, vilket avsevärt minskar arbetsbördan för försöks.
Det primära preklinisk modell för att studera kronisk epilepsi efter hjärnskada är vuxen råtta eller mus, antingen genom en kemo-konvulsiv (dvs kaininsyra eller pilokarpin) eller elektriskt inducerad status epilepticus (SE), som följs av kronisk epilepsi. Under dessa förhållanden kan de svåra kramper i samband med SE eller senare anfall i epileptiska djur leda till skador från djur sönder eller dra tjudret och lossa skruvarna som håller fäst av headcap. I slutändan är det detta problem som oftast avslutar dessa experiment, och ändå behovet av att få långsiktiga högupplösta EEG poster för experiment som syftar till att utveckla nya behandlingar för kroniskepilepsi är av största vikt. Dessutom, bostäder, övervakning och analys av data från långtids implanterade djur är en stor investering i både direkta kostnader och utredare tid; Därför kan förtida uppsägning av experimentet leda till betydande kostnader för forskarna. Eftersom dessa modeller av epilepsi framsteg, anfallen blir oftast vanligare och allvarligare 10-12, vilket ökar sannolikheten för att djuren skadas, liksom deras användbarhet för att utveckla nya behandlingar blir störst. Dessa djur kan rutinmässigt utveckla dussintals krampanfall per dag, ofta förekommer i kluster 13.
Förmodligen en av de viktigaste utvecklingen inom biomedicinsk vetenskap har varit användningen av genmålsökning i musmodeller. Detta tillvägagångssätt har gjort det möjligt, och kommer att fortsätta att tillåta, utveckling av djurmodeller av genetisk epilepsi som återger verkliga mänskliga syndrom 14-16. Genetiska manipulationer kan utföras somproof-of-principen behandlingar för att undertrycka epileptiska anfall eller till och med blockera utvecklingen av epilepsi efter hjärnskada 17-20. Denna typ av forskning skulle gynnas dramatiskt från förmågan att utföra hög genomströmning kontinuerlig registrering av EEG. För närvarande är det möjligt att spela in från möss med antingen bundna eller telemetrisystem; Men utmaningarna att få hög kvalitet, artefakt fria inspelningar är betydligt svårare än råttor, och ofta detta kräver olika former av ryggsäckar att möss försöker ständigt att ta bort. Stress kan öka anfallen blir allvarligare, frekvens och / eller längd, och därmed skulle i slutändan ändra epilepsi av försöksdjuren, vilket confounding studien. En liten, lätt, låg profil miniatyr telemetrisystem kommer att underlätta inspelning av långsiktiga EEG från genetiska musmodeller av mänskliga sjukdomar.
Förutom de ovan beskrivna problemen, inspelning EEG i omogna gnagarmodells sjukdoms har sin egen unika uppsättning av utmaningar. Omogna djur kan väga så lite som 6 g (P8 mus) till 17 g (P6 råtta). Det är nästan omöjligt att göra serieflerdagars bundna EEG inspelningar på grund av ökad stress från tjuder och oförmåga att tillåta naturlig uppfödning av valpen av dammen. Tills djur är avvanda, måste de stanna kvar i vården av dammen. Dammen är benägna att förstöra alla externalisekopplingsanordningen på valpen, avsluta valpen, och i vissa fall avsluta hela kullen. Dessutom gör omogna gnagare skallen det svårt att montera någon elektrod piedestal till skallen med mekanisk integritet. Dessa utmaningar, som är unika för omogna gnagare, kräver en ny lösning för att göra robust, långsiktiga elektrografiska inspelningar. Här fokuserar vi på att visa implantation och registrering av EEG med hjälp av en ny miniatyr trådlös sändare och presentera tre proof-of-principen experiment som exempel för användning av miniatyr trådlösa telemetrisystem: 1) immogna råttungar modell av hypoxi-ischemi, 2) vuxna möss som behandlats med DFP för att inducera status epilepticus och efterföljande spontana anfall, och 3) genetisk modell av vaskulära cavernous missbildningar som resulterar i kramper och död hos vuxna möss.
Den miniatyr trådlösa telemetrisystem har utformats för att uppfylla fyra huvudkrav: (1) minimalinvasiv kirurgisk implantation; (2) kompatibilitet för bostäder av gnagare valpar med dammen och syskon; (3) låg strömförbrukning enhet, vilket möjliggör månader av kontinuerlig övervakning utan kirurgisk re-implantation; och (4) möjlighet att spela in högkvalitativa EEG-vågformer med minimala rörelseartefakter. Den trådlösa sändaren väger <0,6, 2,3 och 4 g och är <0,3, 0,8 och 1,4 cm 3 beroende på batteriet med ett fotavtryck av 5 x 7, 7 x 9, eller 7 x 12 mm som lätt monteras till skallen av djuret med cyanoakrylat gel. Inga ben skruv ankare behövs för att säkert fästa enheten tillskallen, att minska antalet hål som måste borras i skallen och operationstid. Enheten är kapabel att förstärka två kanaler EEG eller lokala fält potentialer från djupa hjärnstrukturer, såsom hippocampus, för över 2 veckor, 2 månader eller 6 månader i denna konfiguration. Den lilla storleken på den trådlösa sändaren minskar infektionsrisken ökar djurens rörlighet, och i slutändan minskar sjuklighet och dödlighet som annars ökar tid, pengar, och antalet djur som behövs för ett experiment. Samtliga elektroniken och batteriet är ingjuten i medicinsk kvalitet epoxi som gör enheten vattentät och tuff, förhindra dammen från att tugga på sändaren som annars skulle kunna göra enheten obrukbar. Radiofrekvenssändare Till skillnad, använder telemetrisystemet kapacitiv koppling mellan sändare och en mottagarantenn som sitter nedanför djurbur, så att användaren kan hålla djuren i standard gnagare huset. Flera kanaler för recording medger registrering av multimodala biopotentialer, såsom elektrokardiogram och elektroencefalogram. Djurmodeller av komorbiditeter kommer att gynnas av möjligheten att spela in biopotentialer under uppförande 21-23. Kombinera beteende med EEG-övervakning kommer att ge forskare med ett bättre verktyg för forskning och prekliniska studier.
Det kan vara mycket dyrt att göra långsiktiga elektrografiska inspelningar i små djurmodeller av sjukdomen. Genom att förlita sig på enkla elektriska kretsar och betonar låg strömförbrukning, har vi kunnat skapa ett sändarsystem (figur 1 och 2) som minskar kostnaderna för långsiktiga övervakningsexperiment. Den totala kostnaden för en 6 månaders övervakningsexperiment kan vara så lågt som $ 470, plus kostnaden för djuret (~ $ 1,5 djur per diem, $ 200 sändare). Den lilla storleken på sändaren medger kontinuerlig oavbruten elektrografiska inspelningar i små djur, prekliniska modeller av mänsklig sjukdom, vilket är mycket svårt att få med bunden eller radiofrekvensbaserade trådlösa registreringssystem (Figur 4). Slutligen minskar operationstiden och stress på djuret som annars kan äventyra ett experiment skallen monterade naturen hos sändaren. Här visar vi proof-of-principen experiment från tre difftekniker när experimentella modeller av anfall: perinatal hypoxi-ischemi 13, 27, 28 i en råttunge (Figur 4), DFP-inducerad status epilepticus (Figur 5) och kramper i en genetiskt inducerad modell av mullrande kärlmissbildningar (Figur 6).
Kanske den mest kritiska aspekten för att få artefakt-fria, långsiktiga elektrografiska inspelningar är att kontrollera ohämmad elektrod tillgång till kortikala regionen av intresse (Figur 4-6). Detta inkluderar den gemensamma referens / jordelektrod. Speciellt kritisk är att fästa sändaren till skallen för epidural EEG applikationer. Under denna process är det möjligt att oavsiktligt belägga spetsen på elektrod med cyanoakrylat med tanke på den mycket korta längden på elektroderna. Beläggning elektroderna i cyanoakrylat kan dämpa EEG-signaler eller helt isolera dem i värsta fall. På samma sätt, brist på god elektrisk anslutning Bindexets gemensamma referens / marken och djurets hjärna kommer att förhindra korrekt drift av differentialförstärkaren i sändaren, vilket resulterar i ett elektriskt "bullriga" utsignal. Ofta efter kirurgi, god kvalitet signaler kan äventyras i upp till 48 timmar på grund av ödem som omger Burr hål i skallen. Som ödem avtar, signaler förbättrar i allmänhet. Detta kan undvikas genom att placera elektroderna på ytan av skallen utan att göra burr hål. Konsekvenserna av denna process är ökad risk för att belägga elektroderna med cyanoakrylat, minskad högfrekventa aktivitet på grund av de låga passerar elektriska egenskaperna hos skallbenet, och möjligheten att elektriskt isolera den gemensamma referens / marken gör brus i signalerna. Praktiserande korrekt placering av elektroder kan göras med en tunn bit av trä eller faner som härmar tjockleken hos mus eller råtta skallen. Resultaten som presenteras i detta manuskript illustrerar quatets inspelningar som kan erhållas med hjälp av trådlös telemetri teknik.
Kirurgisk implantation med användning av metoden som beskrivs häri kan ta så lite som 10 min, beroende på komplexiteten i operationen. För kirurgisk åtkomst till djupa hjärnstrukturer, såsom CA1-regionen av hippocampus, är det bäst att sätta fast sändaren till en mikromanipulator monterad på en stereotaktisk ram. Den mikromanipulator kommer att ge kirurgen med noggrannhet att implantera sändaren enligt publicerade stereotaktiska koordinater i atlas över musen 29 och råtta 30 hjärnor. Detta kan göras genom att helt enkelt tacking ett stycke injektionsnål slang till sändaren med cyanoakrylat och sedan montering av injektionsnålen i mikromanipulator. Mikromanipulator kontroll av x, y och z-koordinater kommer att ge ytterligare stabilitet vid montering av sändaren till skallen före suturering huden stängd. Tillsatsen av benskruvar runt perimeter hos sändaren kan hjälpa till att förankra sändaren till skallen, även om de inte är nödvändiga. Benskruvar kan vara effektiv, men i vissa djurmodeller av krampanfall och epilepsi, såsom litium-pilokarpin-behandlade vuxen råtta. Dessa djur tenderar att ha spontana konvulsiva anfall med intensiv motorisk aktivitet som kan skada sändaren under anfall. Ytterligare komplexitet kunde läggas till dessa försök. Till exempel, är sändaren kompatibel med många olika modeller av traumatisk hjärnskada, såsom kontrollerad kortikal påverkan 31. Hållbarheten sändaranordningen testades genom att implantera djur med sändare på P7, och sedan inhysta i djuranläggningen. Efter 12 månader, mest av implantaten förblev intakt på skallen. När djuren avlivades, verkade skallar att vara normal och sändaren var inbäddad i skallbenet, vilket kräver betydande kraft för att extrahera den. Var försiktig när djupa hjärnstrukturerstuderas; som hjärnan växer, och elektroderna stå stilla, förväntas den slutliga positionen av elektroderna att ändra. För de metoder som beskrivs här, har elektroderna typiskt placerad ovanför dura, vilket gjorde både hjärnan och skallen att växa och för elektroder att stanna kvar i sina ursprungliga positioner. Den begränsande faktorn för hur länge sändaren kan användas är batteristorleken (dvs. tills batteriet tar slut).
En fristående monolitisk konstruktion (dvs sändaren är inbäddad i hård epoxy) av sändarens huset lämpar sig för användning med omogna valpar som hålls med dammen och deras syskon. Ofta sam-hölje implanterade djur med trådbundna tjuder resulterar i förstörelsen av den implanterade hårdvara eller cannibalization av valparna av dammen. Den släta väggar form av sändaren möjliggör implantation med praktiskt taget ingen hårdvarufel eller förlust av ungar på grund av cannibalization.
<p class = "jove_content"> Den låg effekt kapacitiv kopplade transmissionssystemet i detta system lämpar sig väl för användning i många olika experimentella scenarier såsom placering i en temperaturkontrollerad inkubator eller ens för användning med experimentella apparater, såsom pletysmografi kammare. På samma sätt kan formen på mottagarantennen manipuleras för att passa i många olika beteendemässiga miljöer, såsom den förhöjda T-maze.The sändarens räckvidd är endast ett fåtal inches som sändaren måste kunna "enhet" (kapacitivt koppla till) mottagarens antenn och förlitar sig på det djur som skall inhysas i standard gnagare placering i bur eller lämplig bur som omfattas av mottagarantennen ytarea. Sändaren fungerar som en pol av ett elektriskt fält under det att kroppen hos djuret fungerar som en annan pol. Fältet är sådan att vissa orienteringar, såsom 90 ° ur fas med mottagarantennen, kommer att misslyckas att driva mottagarens antenn vilket resulterar i en "drop out". Detta är en ganska sällsynt företeelse. Framtida arbete med denna teknik gör det möjligt att spela in från flera djur i samma bur som kommer att minska ombordstigning kostnader och möjliggöra social interaktion. Den fortsatta utvecklingen kommer att innebära en ökning av antalet kanaler, inklusive temperatur och elektromyogram. Den nuvarande utformningen av enheten ger en bandbredd som är optimerad för omkodning av klassiska EEG band, vilket inte är lämpligt för inspelning av snabba krusningar eller högfrekventa svängningar. I framtiden kan anordningen modifieras för att spela in de högfrekventa komponenterna av signalen, men på bekostnad av batteritid. Olika typer av givare kommer att omfatta blodtryck och tryck volym, och även byggandet av en sändare elektrodarrangemang till användardefinierade dimensioner enligt stereotaktiska koordinaterna för de önskade hjärnstrukturer.The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats genom det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke R43 / R44 NS064661.
Sterile Surgical Gloves | Protective Industrial Products | 100-3201 PF | Power Free Sterile Latex Surgical Glove |
Scalpel Handle | FST | 10003-12 | |
Scalpel Blade #15 | FST | 10015-00 | |
Fine Scissors | FST | 14090-09 | |
Burr tool | Ram Products, Inc. | Microtorque II | |
Fine burr | FST | 19007-07 | |
Aneurism clip | ROBOZ | RS-5422 | |
Toothed Forceps | FST | 11022-14 | |
Cotton-Tipped applicators | McKesson | 24-103 | |
Needle Driver | WPI | 521725 | Olsen-Hegar Needle Holder |
Cyanoacrylate gel | Henkel | Loctite 4541 | |
Cyanoacrylate accelerant | Henkel | Loctite 7452 | |
Suture | Ethicon | Vicryl RB-1 J304 | |
Elecrocautery disposable | Bovie | AA01 | Fine Tip |
Surgical Tray | FST | 20311-21 | |
Epitel Receiver Base | Epitel Inc | N/A | |
Epitel wireless transmitter | Epitel Inc | N/A | |
Biopac digitizer | Biopac | MP-150 | |
PC-compatible computer |