Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.
Beaucoup de maladies neurologiques progressifs chez l'homme, tels que l'épilepsie, nécessitent des modèles animaux précliniques qui se développent lentement la maladie afin de tester des interventions à différents stades du processus de la maladie. Ces modèles animaux sont particulièrement difficiles à mettre en oeuvre chez les rongeurs immatures, un organisme modèle classique pour l'étude en laboratoire de ces troubles. Enregistrement EEG continue chez les jeunes des modèles animaux de convulsions et d'autres troubles neurologiques présente un défi technique en raison de la petite taille physique des jeunes rongeurs et leur dépendance sur le barrage avant le sevrage. Par conséquent, il est non seulement un besoin évident d'améliorer la recherche pré-clinique qui permettra de mieux identifier les thérapies appropriées pour la traduction à la clinique, mais aussi un besoin pour de nouveaux appareils capables d'enregistrer en continu EEG chez les rongeurs immatures. Ici, nous décrivons la technologie derrière et de démontrer l'utilisation d'un nouveau système de télémétrie miniature, spécialement conçu pour une utilisation chez les rats immatures or souris, ce qui est également efficace pour une utilisation chez les animaux adultes.
Le plus vieux – et toujours le plus largement utilisé – technique pour l'enregistrement biopotentiels dans le cerveau est l'électroencéphalogramme (EEG). Il est utilisé en clinique pour des anomalies neurologiques, y compris la détection de saisie 1, la localisation de la saisie foyers 2, et le diagnostic de commotion 3,4. Cette technique est aussi largement utilisé pour fournir des informations fondamentales sur les mécanismes du sommeil et de diagnostiquer les troubles du sommeil 5,6.
Comme dans le diagnostic clinique des épilepsies, de l'EEG est devenu indispensable pour la recherche translationnelle dans des modèles animaux de l'épilepsie à la fois génétique et acquise. Dans les applications de recherche en cours, "câblé" ou des enregistrements "captifs" sont standard, et sont régulièrement effectués chez les rongeurs adultes pendant des semaines à un moment 7. Cependant, le bruit électrique, des artefacts de mouvement, et le risque que les animaux attachés vont se blesser en tirant sur le câble ont de longues compromised ces expériences. Ainsi, pour améliorer les conditions et les taux de réussite expérimentale, nous avons besoin de développer de nouvelles technologies qui permettraient à l'élimination de l'interface filaire entre l'animal et l'instrumentation. La zone la plus évidente de développement est la conception et la mise en œuvre de systèmes de télémétrie qui permet des enregistrements de haute qualité, tout en maintenant une longue durée de vie utile et de minimiser l'inconfort pour les sujets animaux. Réduction de la taille physique de ces appareils permettra à la recherche translationnelle dans des modèles rongeurs néonatales et juvéniles de troubles neurologiques.
Enregistrements EEG nombre de voies faibles chez les rats sont employés intensivement pour développer de nouvelles thérapies pour supprimer les crises épileptiques capables de traduction pour les humains. Les enregistrements à partir d'un ou plusieurs sites pour une période prolongée ouvrent de nombreuses possibilités d'utilisation des modèles de rongeurs de l'épilepsie dans la recherche translationnelle. Une grande partie de la recherche contemporaine dans ce domaine vise à bloquer l'apparition de seiz chroniqueUres ou le développement de l'épilepsie (c.-à-épileptogénèse), et ces efforts de recherche exigent une vaste si la surveillance en continu de l'EEG pas de doser l'efficacité de la thérapie proposée 8; un petit système télémétrique, simple, avec un, deux ou quatre canaux opérant entre 0,1-100 Hz par canal sera fortement promouvoir ce type de recherche translationnelle. Crises électrographiques se produisent souvent à des comportements minimales (certainement sans convulsions), ce qui limite l'utilité des tests basés sur les saisies de comportement. La stratégie de combiner l'enregistrement EEG et la surveillance vidéo simultanée permet la possibilité de capturer toute saisie; et, en outre, ces approches analytiques peuvent permettre une évaluation quantitative des pointes intercritiques qui se produisent dans le cerveau épileptique entre les événements 9 "ictal" (ou la saisie). En outre, la capacité d'obtenir de haute qualité à faible artefacts continue les enregistrements EEG, pour lequel la technologie sans fil est généralementsupérieure, permettra le développement de l'utilisation d'algorithmes informatiques pour étudier des formes d'onde spécifiques de l'EEG (par exemple, thêta, gamma), ainsi que la détection automatique des saisies, réduisant de manière significative la charge de travail de l'expérimentateur.
Le modèle pré-clinique primaire pour l'étude de l'épilepsie chronique après une lésion cérébrale est le rat ou la souris adulte, soit par une chimio-convulsivant (par exemple, l'acide kaïnique ou la pilocarpine) ou induite électriquement état de mal épileptique (SE), qui est suivie par une épilepsie chronique. Dans ces conditions, les convulsions sévères associés à SE ou les crises subséquentes chez les animaux épileptiques peuvent conduire à des blessures de la déchirure des animaux ou en tirant sur la sangle et desserrer les vis qui maintiennent la fixation de la coiffe. En fin de compte, il est ce problème qui se termine habituellement ces expériences, et pourtant la nécessité d'obtenir de haute résolution enregistrements à long terme EEG pour des expériences visant à développer de nouvelles thérapies pour chroniqueépilepsie est primordiale. En outre, le logement, la surveillance et l'analyse des données provenant d'animaux à long terme implantés est un investissement considérable dans les coûts directs et le temps de recherche; par conséquent, la fin prématurée de l'expérience peut entraîner des coûts importants pour les chercheurs. Comme ces modèles de progrès épilepsie, les crises deviennent généralement plus fréquentes et plus sévères 10-12, augmentant la probabilité que les animaux sont blessés, de même que leur utilité pour le développement de nouvelles thérapies devient plus grand. Ces animaux peuvent développer régulièrement des dizaines de crises convulsives par jour, survenant souvent dans les grappes 13.
Probablement l'un des développements les plus importants en sciences biomédicales a été l'utilisation du ciblage génique dans des modèles murins. Cette approche a permis et continuera de permettre, le développement de modèles animaux d'épilepsie génétique qui reproduisent syndromes humains réels 14-16. Les manipulations génétiques peuvent être entreprises commethérapies de preuve de principe pour supprimer les crises d'épilepsie ou même bloquer le développement de l'épilepsie après lésion cérébrale 17-20. Ce type de recherche pourrait bénéficier considérablement de la capacité à effectuer à haut débit enregistrement continu de l'EEG. À l'heure actuelle, il est possible d'enregistrer à partir de souris avec soit des systèmes de télémétrie ou attachés; Cependant, les défis de l'obtention de haute qualité, les enregistrements sans artefact sont sensiblement plus difficile que les rats, et souvent cela nécessite diverses formes de sacs à dos que les souris tentent en permanence à enlever. Le stress pourrait accroître la gravité des crises, la fréquence et / ou la durée, et donc en fin de compte modifier le épilepsie des animaux de laboratoire, confondant ainsi l'étude. Un petit, léger, discret système de télémétrie miniature seront faciliter l'enregistrement de long terme EEG à partir de modèles de souris génétiques de maladies humaines.
En plus des problèmes décrits ci-dessus, l'enregistrement EEG dans le modèle de rongeur immatures de la maladie a son propre ensemble unique de défis. Les animaux immatures peuvent peser aussi peu que 6 g (P8 souris) à 17 g (P6 rat). Il est pratiquement impossible de faire en série de plusieurs jours enregistrements EEG captifs en raison de l'augmentation du stress et de l'incapacité de sangle pour permettre l'élevage naturel de le chiot par le barrage. Jusqu'à animaux sont sevrés, ils doivent rester à la charge du barrage. Le barrage est sujette à détruire tout ensemble connecteur externalisé sur le chiot, résilier le chiot, et dans certains cas, mettre fin à l'ensemble de la litière. En outre, le crâne de rongeur immature, il est difficile de monter sur les pieds de l'électrode sur le crâne avec intégrité mécanique. Ces défis, uniques aux rongeurs immatures, exigent une nouvelle solution pour réaliser des enregistrements électroencéphalographiques robuste, à long terme. Ici, nous nous concentrons sur la démonstration de l'implantation et de l'enregistrement de l'EEG utilisant un émetteur sans fil miniature roman et présents trois expériences de preuve de principe que des exemples d'utilisation du système de télémétrie sans fil miniature: 1) l'immaturité modèle de chiot de rat de l'hypoxie-ischémie, 2) des souris adultes traitée avec DFP pour induire état de mal épileptique et des crises spontanées ultérieures, et 3) modèle génétique des malformations vasculaires caverneux qui se traduisent par des convulsions et la mort chez les souris adultes.
Le système de télémétrie sans fil miniature a été conçu pour répondre à quatre exigences principales: (1) l'implantation chirurgicale minimalement invasive; (2) la compatibilité pour le logement de petits rongeurs avec le barrage et la même portée; (3) à faible consommation d'énergie de l'unité, ce qui permet une surveillance continue des mois sans ré-implantation chirurgicale; et (4) la capacité à enregistrer les formes d'ondes de l'EEG de haute qualité avec des artefacts de mouvement minimes. L'émetteur sans fil pèse <0,6, 2,3, et 4 g et est <0,3, 0,8, et 1,4 cm 3 en fonction de la batterie d'une superficie de 5 x 7, 7 x 9, ou 7 x 12 mm qui se monte facilement sur le crâne de l'animal avec du gel de cyanoacrylate. Aucun ancrage de vis à os sont nécessaires pour fixer solidement le dispositif àle crâne, ce qui réduit le nombre de trous qui doivent être percés dans le crâne et le temps de l'intervention chirurgicale. Le dispositif est capable d'amplifier deux canaux d'EEG ou potentiels de champ locaux des structures profondes du cerveau, telles que l'hippocampe, pendant plus de 2 semaines, 2 mois, ou 6 mois dans cette configuration. La petite taille de l'émetteur sans fil réduit le risque d'infection, accroît la mobilité des animaux, et finalement réduit la morbidité et la mortalité qui augmente sinon le temps, d'argent, et le nombre d'animaux nécessaires pour une expérience. Toute l'électronique et la batterie sont en pot dans époxy de qualité médicale qui rend l'appareil étanche et robuste, empêchant le barrage de mâcher sur l'émetteur qui, autrement, pourraient rendre le dispositif inutilisable. Contrairement aux émetteurs radiofréquences, le système de télémétrie utilise un couplage capacitif entre l'émetteur et une antenne de réception qui se trouve en dessous de la cage pour animaux, permettant à l'utilisateur de garder les animaux dans un logement standard pour rongeurs. Plusieurs canaux de recording permettre l'enregistrement de biopotentiels multi-modales, comme l'électrocardiogramme et l'électroencéphalogramme. Les modèles animaux de co-morbidités bénéficieront de la possibilité d'enregistrer biopotentiels pendant un comportement 21-23. Combinant le comportement de la surveillance EEG permettra aux chercheurs un meilleur outil pour la recherche et les études pré-cliniques.
Il peut être très coûteux de faire des enregistrements électroencéphalographiques à long terme dans des modèles de petits animaux de la maladie. En se fondant sur des circuits électriques simples et mettant l'accent sur la consommation de faible puissance, nous avons été en mesure de créer un système d'émetteur (figures 1 et 2) qui réduit le coût des expériences de suivi à long terme. Le coût total d'une expérience de suivi de 6 mois pourrait être aussi bas que $ 470, plus le coût de l'animal (~ $ 1,5 animal par diem, 200 $ émetteur). La petite taille de l'émetteur permet des enregistrements électroencéphalographiques ininterrompue dans de petits animaux, des modèles pré-cliniques de la maladie humaine, qui sont très difficiles à obtenir avec les systèmes d'enregistrement sans fil basés sur la radio-fréquence ou captif (Figure 4). Enfin, la nature du crâne monté de l'émetteur permet de réduire le temps de chirurgie et le stress de l'animal qui peut compromettre autrement une expérience. Ici, nous montrons des expériences de validation de principe de trois différents modèles expérimentaux de crises: périnatale hypoxie-ischémie 13, 27, 28 dans un chiot de rat (Figure 4), de mal épileptique DFP induite par le statut (Figure 5) et des convulsions dans un modèle génétiquement induite par des malformations vasculaires caverneux (figure 6).
Peut-être l'aspect le plus critique pour obtenir des enregistrements électroencéphalographiques sans artefact, à long terme est de vérifier l'accès sans restriction à l'électrode de la région corticale d'intérêt (figure 4-6). Cela comprend l'électrode de référence / terrain d'entente. Particulièrement critique est de fixer l'émetteur au crâne pour les applications EEG péridurale. Au cours de ce processus, il est possible de revêtir par inadvertance la pointe des électrodes avec cyanoacrylate compte tenu de la très courte longueur des électrodes. Le revêtement des électrodes dans cyanoacrylate peut atténuer les signaux EEG ou complètement les isoler dans le pire des cas. De même, le manque de bonne connexion électrique bntre la référence / terrain d'entente et le cerveau de l'animal va empêcher le fonctionnement correct de l'amplificateur différentiel dans l'émetteur, résultant en une sortie de signal électriquement "bruyant". Souvent, après la chirurgie, les signaux de bonne qualité peuvent être compromis pour un maximum de 48 heures en raison de l'oedème entourant les trous de bavures dans le crâne. Comme l'œdème disparaît, signaux améliorent généralement. Ceci peut être évité en plaçant les électrodes à la surface du crâne sans faire de trous de bavures. Les conséquences de ce processus sont un potentiel accru pour recouvrir les électrodes avec cyanoacrylate, une réduction des activités à haute fréquence en raison des passe-bas caractéristiques électriques de l'os du crâne, et le potentiel pour isoler électriquement la référence / sol bruit commun rendu dans les signaux. Pratiquer placement correct des électrodes peut être fait avec un mince morceau de bois ou de placage qui imite l'épaisseur du crâne de la souris ou le rat. Les résultats présentés dans ce manuscrit illustrent la qualité d'enregistrements qui peuvent être obtenus en utilisant la technologie de télémétrie sans fil.
Implantation chirurgicale en utilisant le procédé décrit ici peut prendre aussi peu que 10 minutes, en fonction de la complexité de l'opération. Pour accès chirurgical aux structures profondes du cerveau, telles que la région CA1 de l'hippocampe, il est préférable de fixer l'émetteur à un micromanipulateur monté sur un cadre stéréotaxique. Le micromanipulateur fournira le chirurgien avec la précision d'implanter l'émetteur selon coordonnées stéréotaxiques publiées dans l'Atlas des souris et le rat 29 30 cerveaux. Ceci peut être fait simplement en virant un morceau de tube d'aiguille hypodermique à l'émetteur de cyanoacrylate, puis le montage de l'aiguille hypodermique dans le micromanipulateur. Micromanipulateur de commande de x, y et z des coordonnées fournira une stabilité supplémentaire lors du montage de l'émetteur vers le crâne avant suture de la peau fermée. L'addition de vis à os autour de la perimeter de l'émetteur peut aider à ancrer l'émetteur sur le crâne, bien qu'ils ne sont pas nécessaires. Les vis à os peuvent être efficace, cependant, dans certains modèles animaux de convulsions et l'épilepsie, tels que le rat adulte lithium-pilocarpine traité. Ces animaux ont tendance à avoir des crises convulsives spontanées avec l'activité motrice intense pouvant endommager l'émetteur lors de la saisie. Complexité supplémentaire peut être ajouté à ces expériences. Par exemple, l'émetteur est compatible avec de nombreux modèles différents de lésions cérébrales traumatiques, tels que l'impact cortical contrôlée 31. La durabilité du dispositif de transmission est testée par implantation d'animaux avec des émetteurs à P7, puis les loger dans l'animalerie. Après 12 mois, la plupart des implants sont restés intacts sur le crâne. Lorsque les animaux ont été euthanasiés, les crânes semblent être normal et l'émetteur a été incorporé dans l'os du crâne, nécessitant une force importante pour l'extraire. Prenez soin lorsque les structures profondes du cerveausont étudiés; comme le cerveau se développe, et les électrodes reste stationnaire, serait la position finale attendue des électrodes à changer. Pour les techniques décrites ici, les électrodes étaient généralement placés au-dessus de la dure-mère, qui a permis à la fois le cerveau et le crâne de croître et pour les électrodes de rester dans leurs positions initiales. Le facteur limitant dans combien de temps le transmetteur peut être utilisé est la taille de la batterie (soit jusqu'à la batterie est épuisée).
Une conception monolithique autonome (c.-à l'émetteur est intégré dans époxy dur) du boîtier de l'émetteur se prête à utiliser avec chiots immatures hébergés avec le barrage et leurs frères et sœurs. Souvent, les animaux co-logement pour siège avec filaires résultats implanté dans la destruction du matériel implanté ou cannibalization des chiots par le barrage. La forme à paroi lisse de l'émetteur permet à l'implantation avec pratiquement pas de panne de matériel ou de perte de chiots en raison de la cannibalisation.
<p class = "jove_content"> Le système de transmission capacitif couplé de faible puissance à ce système se prête bien pour une utilisation dans de nombreux différents scénarios expérimentaux tels que le placement dans un incubateur à température contrôlée ou même pour une utilisation avec des appareils expérimentaux, tels que les chambres de Plethysmographie. De même, la forme de l'antenne du récepteur peut être manipulé pour tenir dans de nombreux environnements différents de comportement, tels que la gamme élevée T-maze.The de l'émetteur est à seulement quelques pouces que l'émetteur doit être en mesure de "drive" (couplage capacitif à) l'antenne de réception et repose sur l'animal pour être logés dans des cages standard pour rongeurs ou cage convenable couverte par la surface d'antenne réceptrice. L'émetteur agit en tant que l'un des pôles d'un champ électrique alors que le corps de l'animal agit comme un autre pôle. Le champ est telle que certaines orientations, par exemple 90 ° hors de phase avec l'antenne du récepteur, ne parviendront pas à conduire l'antenne du récepteur résultant en un "drop out". Ce phénomène est assez rare. Les travaux futurs de cette technologie permettra l'enregistrement à partir de plusieurs animaux dans la même cage qui permettra de réduire les frais d'internat et de permettre une interaction sociale. D'autres développements impliquera l'augmentation du nombre de canaux, notamment la température, et électromyogramme. La conception actuelle de l'appareil fournit une bande passante qui est optimisé pour recodage de bandes EEG classiques, qui ne convient pas pour l'enregistrement des ondulations rapides ou oscillations à haute fréquence. Dans l'avenir, le dispositif peut être modifié pour enregistrer les composantes à haute fréquence du signal, mais au prix d'une durée de vie de la batterie. Différents types de transducteurs comprennent la pression artérielle et pression-volume, et même la construction d'un agencement d'électrodes d'émetteur de dimensions spécifiées par l'utilisateur selon les coordonnées stéréotaxiques des structures cérébrales souhaités.The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies R43 / R44 NS064661.
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