Here we demonstrate the use of a wireless enabling technology for electroencephalogram (EEG) in neonatal rodent models of human disease. With telemetry, there are no encumbering connections, thus allowing natural behaviors.
Muchas enfermedades neurológicas progresivas en los seres humanos, tales como la epilepsia, requieren modelos animales pre-clínicos que se desarrollan lentamente la enfermedad con el fin de probar las intervenciones en las distintas etapas del proceso de la enfermedad. Estos modelos animales son particularmente difíciles de implementar en los roedores inmaduros, un organismo modelo para el clásico estudio de laboratorio de estos trastornos. Grabación de EEG continua en modelos animales jóvenes de convulsiones y otros trastornos neurológicos presenta un desafío técnico debido al pequeño tamaño físico de los roedores jóvenes y su dependencia de la presa antes del destete. Por lo tanto, no sólo hay una clara necesidad de mejorar la investigación pre-clínica que mejor identifique esas terapias adecuadas para la traducción a la clínica, sino también una necesidad de nuevos dispositivos capaces de grabar continua EEG en roedores inmaduros. A continuación, describimos la tecnología detrás y demostrar el uso de un nuevo sistema de telemetría en miniatura, diseñados específicamente para el uso en ratas inmaduras oratones r, que también es eficaz para su uso en animales adultos.
El más antiguo – y sigue siendo el más utilizado – técnica para el registro de biopotenciales en el cerebro es el electroencefalograma (EEG). Se utiliza clínicamente para anormalidades neurológicas, incluyendo la detección de convulsión 1, la localización de convulsión focos 2, y el diagnóstico de conmoción cerebral 3,4. Esta técnica también se utiliza ampliamente para proporcionar información fundamental sobre los mecanismos de sueño y para diagnosticar trastornos del sueño 5,6.
Al igual que en el diagnóstico clínico de las epilepsias, el EEG se ha convertido en indispensable para la investigación traslacional en modelos animales de epilepsia tanto genética y adquirida. En las aplicaciones actuales de investigación, "por cable" o grabaciones "atados" son estándar, y se realizan rutinariamente en roedores adultos durante semanas a la vez 7. Sin embargo, el ruido eléctrico, artefactos de movimiento, y el riesgo de que los animales se ató lesionar a sí mismos tirando del cable tienen compr largasomised estos experimentos. Por lo tanto, para mejorar las condiciones y las tasas de éxito experimental, tenemos que desarrollar nuevas tecnologías que permitan la eliminación de la interfaz de cable entre el animal y la instrumentación. El área más obvia de desarrollo es el diseño e implementación de sistemas de telemetría que permite grabaciones de alta calidad, mientras que el mantenimiento de una vida larga útil y minimizar las molestias para los sujetos animales. La reducción del tamaño físico de estos dispositivos permitirá la investigación traslacional en modelos de roedores neonatales y juveniles de trastornos neurológicos.
Cuenta de canal grabaciones Low EEG en ratas se emplean ampliamente para desarrollar nuevas terapias para suprimir las convulsiones epilépticas capaz de traducción para los seres humanos. Las grabaciones de uno o más sitios para un período prolongado abren muchas posibilidades para el uso de modelos de roedores de epilepsia en investigación traslacional. Gran parte de la investigación contemporánea en este campo tiene como objetivo bloquear la aparición de SEIZ crónicaUres o el desarrollo de epilepsia (es decir, epileptogénesis), y tales esfuerzos de investigación requieren extensa si la monitorización EEG no continua para ensayar la eficacia de la terapia propuesta 8; un pequeño sistema telemétrico, simple, con uno, dos o cuatro canales que operan entre 0,1 a 100 Hz por canal promoverá enérgicamente este tipo de investigación traslacional. Convulsiones electroencefalográficas ocurren a menudo con comportamientos mínimos (ciertamente sin convulsiones), lo que limita la utilidad de los ensayos basados en las convulsiones de comportamiento. La estrategia de combinar la grabación de EEG y la supervisión simultánea de vídeo permite la posibilidad de capturar cada convulsiones; y, además, estos enfoques analíticos pueden permitir una evaluación cuantitativa de los picos interictales que se producen en el cerebro epiléptico entre eventos 9 "ictal" (o convulsiones). Además, la capacidad para obtener una alta calidad a bajo artefacto continua registros de EEG, para los que la tecnología inalámbrica es generalmentesuperior, permitirá el desarrollo de uso de algoritmos basados en ordenador para el estudio de las formas de onda de EEG específicas (por ejemplo, theta, gamma), así como detección automática de convulsiones, reduciendo significativamente la carga de trabajo del experimentador.
El modelo pre-clínico primario para el estudio de la epilepsia crónica después de la lesión cerebral es la rata o el ratón adulto, ya sea a través de una quimio-convulsivo (es decir, ácido kaínico o pilocarpina) o inducida eléctricamente estado epiléptico (SE), que es seguido por la epilepsia crónica. En estas condiciones, las convulsiones severas asociadas a SE o las convulsiones posteriores en los animales de epilepsia pueden conducir a lesiones por el desgarro animal o tirando de la correa de sujeción y el aflojamiento de los tornillos que mantienen la unión del casquete. En última instancia, es este problema que por lo general termina estos experimentos, y sin embargo, la necesidad de obtener los registros de EEG de alta resolución a largo plazo para los experimentos destinados a desarrollar nuevas terapias para la crónicaepilepsia es primordial. Además, la vivienda, el seguimiento y el análisis de los datos de animales a largo plazo implantados es una inversión considerable tanto en costes directos e investigador de tiempo; Por lo tanto, la terminación prematura del experimento puede resultar en costos significativos para los investigadores. A medida que estos modelos de progreso epilepsia, las convulsiones generalmente se hacen más frecuentes y más graves 10-12, aumentando la probabilidad de que los animales son heridos, al igual que su utilidad para el desarrollo de nuevas terapias se convierte mayor. Estos animales pueden desarrollar habitualmente decenas de ataques convulsivos por día, que se producen a menudo en grupos de 13.
Probablemente uno de los acontecimientos más importantes de la ciencia biomédica ha sido el uso de la orientación de genes en modelos de ratón. Este enfoque ha permitido, y continuará permitiendo el desarrollo de modelos animales de epilepsia genética que reproduce síndromes humanos reales 14-16. Manipulaciones genéticas pueden llevarse a cabo comoterapias de prueba de principio para suprimir las convulsiones epilépticas o incluso bloquear el desarrollo de la epilepsia después de una lesión cerebral 17-20. Este tipo de investigación se beneficiaría enormemente de la capacidad de realizar de alto rendimiento registro continuo de la EEG. En la actualidad, es posible grabar de ratones con cualquiera de los sistemas de atados o de telemetría; sin embargo, los retos de la obtención de alta calidad, grabaciones libres de artefactos son sustancialmente más difícil que las ratas, y, a menudo esto requiere diversas formas de mochilas que los ratones que intentan continuamente para eliminar. El estrés podría aumentar la severidad de las crisis, la frecuencia y / o duración, y por lo tanto en última instancia modificar la epilepsia de los animales experimentales, confundiendo así el estudio. Un peso ligero, de bajo perfil pequeño sistema, telemetría miniatura facilitarán la grabación de largo plazo EEG de los modelos genéticos de ratón de la enfermedad humana.
Además de los problemas descritos anteriormente, la grabación de EEG en el modelo de roedor inmaduros de la enfermedad tiene su propio conjunto único de desafíos. Animales inmaduros pueden pesar tan poco como 6 g (P8 ratón) a 17 g (rata P6). Es prácticamente imposible hacer multi-día registros de EEG atados de serie debido a un aumento del estrés de sujeción y la incapacidad para permitir que la cría natural de la pup por la presa. Hasta los animales se destetan, deben permanecer en el cuidado de la presa. La presa es propensa a destruir cualquier conjunto conector exteriorizado en el cachorro, terminar el cachorro, y en algunos casos terminan toda la camada. Además, el cráneo roedor inmaduro hace que sea difícil para montar cualquier pedestal electrodo al cráneo con integridad mecánica. Estos desafíos, únicos a los roedores inmaduros, requieren una solución novedosa para realizar grabaciones electroencefalográficas robusta, a largo plazo. Aquí nos centramos en la demostración de la implantación y el registro de EEG utilizando un nuevo transmisor inalámbrico en miniatura y presentan tres experimentos de prueba de principio como ejemplos para el uso de la miniatura sistema de telemetría inalámbrica: 1) la immaduro modelo de crías de rata de la hipoxia-isquemia, 2) los ratones adultos tratados con DFP para inducir el estado epiléptico y convulsiones espontáneas posteriores, y 3) el modelo genético de malformaciones cavernosas vasculares que dan lugar a convulsiones y la muerte en ratones adultos.
El sistema de telemetría inalámbrica miniatura fue diseñado para cumplir con cuatro requisitos principales: (1) la implantación quirúrgica mínimamente invasiva; (2) la compatibilidad para la vivienda de las crías de roedores con la presa y hermanos de camada; (3) bajo consumo de energía de la unidad, permitiendo así meses de seguimiento continuo sin quirúrgico re-implantación; y (4) la capacidad para registrar las formas de onda del EEG de alta calidad con los artefactos de movimiento mínimos. El transmisor inalámbrico pesa <0,6, 2,3, y 4 g y es <0,3, 0,8, y 1,4 cm 3 dependiendo de la batería con una huella de 5 x 7, 7 x 9, o 7 x 12 mm que se monta fácilmente en el cráneo del animal con gel de cianoacrilato. No se necesitan tornillos de anclaje óseo para fijar de forma segura el dispositivo parael cráneo, lo que reduce el número de agujeros que deben ser perforados en el cráneo y el tiempo de la cirugía. El dispositivo es capaz de amplificar dos canales de EEG o potenciales de campo locales de estructuras profundas del cerebro, tales como el hipocampo, durante más de 2 semanas, 2 meses, 6 meses o en esta configuración. El pequeño tamaño del transmisor inalámbrico reduce el riesgo de infección, aumenta la movilidad animal, y en última instancia, reduce la morbilidad y la mortalidad que aumenta de lo contrario el tiempo, dinero, y el número de animales necesarios para un experimento. Todos los componentes electrónicos y la batería están en maceta en epoxi de grado médico que hace el dispositivo a prueba de agua y resistente, la prevención de la presa de la masticación en el transmisor que podrían hacer que el dispositivo deje de funcionar. A diferencia de los transmisores de radiofrecuencia, el sistema de telemetría utiliza acoplamiento capacitivo entre el transmisor y una antena receptora que se encuentra debajo de la caja de los animales, lo que permite al usuario mantener los animales en una vivienda estándar de roedores. Múltiples canales de recording permite la grabación de biopotenciales multimodales, como electrocardiograma y electroencefalograma. Los modelos animales de comorbilidades se beneficiarán de la posibilidad de grabar durante biopotenciales comportamiento 21-23. Combinando el comportamiento con monitorización EEG será proporcionar a los investigadores una mejor herramienta para la investigación y los estudios preclínicos.
Puede ser muy caro para hacer grabaciones electroencefalográficas a largo plazo en modelos de pequeña animales de la enfermedad. Al confiar en los circuitos eléctricos sencillos y haciendo hincapié en el consumo de baja potencia, hemos sido capaces de crear un sistema transmisor (Figuras 1 y 2) que reduce el costo de los experimentos de seguimiento a largo plazo. El costo total de un experimento de monitorización de 6 meses podría ser tan bajo como $ 470, más el costo del animal (~ $ 1,5 animales viáticos, $ 200 transmisor). El pequeño tamaño del transmisor permite grabaciones electroencefalográficas ininterrumpidas continuas en pequeños animales, modelos pre-clínicos de la enfermedad humana, que son muy difíciles de obtener con los sistemas de grabación inalámbricas basadas-radio-frecuencia o tethered (Figura 4). Finalmente, la naturaleza cráneo-montada del transmisor reduce el tiempo de la cirugía y el estrés en el animal que de otra manera puede comprometer un experimento. Aquí, mostramos experimentos de prueba de principio entre tres diffErent modelos experimentales de convulsiones: hipoxia perinatal isquemia 13, 27, 28 en una cría de rata (Figura 4), epiléptico inducido por DFP estado (Figura 5) y las convulsiones en un modelo genéticamente inducida de malformaciones vasculares cavernosos (Figura 6).
Posiblemente el aspecto más crítico para la obtención de grabaciones electroencefalográficas libre de artefactos, a largo plazo es para verificar el acceso electrodo sin restricciones a la región cortical de interés (Figura 4-6). Esto incluye el electrodo de referencia / puntos en común. Especialmente crítico es fijar el transmisor en el cráneo para aplicaciones de EEG epidurales. Durante este proceso, es posible inadvertidamente recubrir la punta de los electrodos con cianoacrilato dada la muy corta longitud de los electrodos. El recubrimiento de los electrodos en cianoacrilato puede atenuar las señales de EEG o completamente aislarlos en el peor de los casos. Del mismo modo, la falta de una buena conexión eléctrica bntre la referencia / tierra común y el cerebro del animal impedirá el correcto funcionamiento del amplificador diferencial en el transmisor, lo que resulta en una salida de señal eléctricamente "ruidoso". A menudo, después de la cirugía, las señales de buena calidad pueden ser comprometidas durante un máximo de 48 horas debido a un edema que rodean los orificios de trepanación en el cráneo. A medida que el edema desaparece, señales generalmente mejoran. Esto puede evitarse mediante la colocación de los electrodos sobre la superficie del cráneo sin hacer orificios de trepanación. Las consecuencias de este proceso se incrementan el potencial para cubrir los electrodos con cianoacrilato, reducen la actividad de alta frecuencia debido a los bajos-pass características eléctricas del hueso del cráneo, y el potencial para aislar eléctricamente el ruido de la prestación de referencia / terreno común en las señales. La práctica de la colocación correcta de los electrodos se puede hacer con una pieza delgada de madera o de chapa que imita el espesor del ratón o rata cráneo. Los resultados presentados en este manuscrito ilustran la quadad de las grabaciones que se pueden obtener utilizando la tecnología de telemetría inalámbrica.
La implantación quirúrgica usando el método descrito en el presente documento puede tomar tan poco como 10 min, dependiendo de la complejidad de la cirugía. Para el acceso quirúrgico a las estructuras profundas del cerebro, tales como la región CA1 del hipocampo, lo mejor es conectar el transmisor a un micromanipulador montado en un marco estereotáxico. El micromanipulador proporcionará al cirujano con la precisión para implantar el transmisor de acuerdo con las coordenadas estereotáxicas publicados en el atlas de las 29 del ratón y la rata 30 cerebros. Esto puede hacerse simplemente viradas un trozo de tubo de aguja hipodérmica al transmisor con cianoacrilato y luego el montaje de la aguja hipodérmica en el micromanipulador. Micromanipulador de control de x, y, y z se coordenadas proporcionar estabilidad adicional al montar el transmisor en el cráneo antes de la sutura de la piel cerrada. La adición de tornillos de hueso alrededor de la peperimétrico del transmisor puede ayudar a anclar el transmisor al cráneo, a pesar de que no son necesarios. Los tornillos para huesos pueden ser eficaces, sin embargo, en ciertos modelos animales de epilepsia y convulsiones, tales como la rata adulta tratada con litio-pilocarpina. Estos animales tienden a tener convulsiones espontáneas con la actividad motora intensa que pueden dañar el transmisor durante la convulsión. Complejidad adicional podría añadirse a estos experimentos. Por ejemplo, el transmisor es compatible con muchos modelos diferentes de la lesión cerebral traumática, como impacto cortical controlado 31. La durabilidad del dispositivo transmisor se probó mediante la implantación de los animales con los transmisores en P7, y luego alojarlos en la instalación animal. Después de 12 meses, la mayoría de los implantes se mantuvo intacta en el cráneo. Cuando se sacrificaron los animales, los cráneos parecían ser normal y el transmisor se incrustan en el hueso del cráneo, lo que requiere una fuerza significativa para extraerlo. Tenga cuidado cuando las estructuras profundas del cerebroson estudiados; como el cerebro crece, y los electrodos permanecen estacionarios, se esperaría que la posición final de los electrodos a cambiar. Para las técnicas descritas aquí, los electrodos se colocan normalmente por encima de la duramadre, que permitió que tanto el cerebro y el cráneo para crecer y para electrodos de permanecer en sus posiciones originales. El factor limitante en cuanto tiempo se puede utilizar el transmisor es el tamaño de la batería (es decir, hasta que la batería se agote).
Un diseño monolítico autónomo (es decir, el transmisor está incrustado en epoxi duro) de la carcasa del transmisor se presta a utilizar con crías inmaduras alojados con la presa y sus compañeros de camada. A menudo, co-vivienda implantó animales con ataduras cableadas resultados en la destrucción del hardware o canibalización de los cachorros implantado por la presa. La forma de pared lisa del transmisor permite la implantación con prácticamente ningún fallo en el hardware o la pérdida de crías debido a la canibalización.
<p class = "jove_content"> El esquema de transmisión capacitiva acoplada bajo consumo de energía en este sistema se presta bien para su uso en muchos escenarios experimentales diferentes, tales como la colocación en una incubadora de temperatura controlada o incluso para su uso con aparatos experimentales, como las cámaras de pletismografía. Del mismo modo, la forma de la antena del receptor puede ser manipulada para encajar en muchos entornos diferentes de comportamiento, como la elevada gama T-maze.The del transmisor es solamente algunas pulgadas como el transmisor deben ser capaces de "unidad" (par capacitiva a) la antena del receptor y se basa en el animal a ser alojados en jaulas estándar para roedores o jaula adecuada cubierto por el área de superficie de la antena del receptor. El transmisor actúa como un polo de un campo eléctrico mientras que el cuerpo del animal actúa como otro polo. El campo es tal que ciertas orientaciones, como el 90 ° fuera de fase con la antena del receptor, no podrán conducir la antena del receptor resulta en un "abandono". Este es un hecho bastante raro. El trabajo futuro con esta tecnología permitirá grabar desde múltiples animales en la misma jaula que reducirá los costos de embarque y permitir la interacción social. Otros desarrollos implicarán aumentar el número de canales, incluyendo la temperatura, y el electromiograma. El diseño actual del dispositivo proporciona un ancho de banda que está optimizado para la recodificación de las bandas de EEG clásicos, que no es adecuado para la grabación de ondas rápidas u oscilaciones de alta frecuencia. En el futuro, el dispositivo puede modificarse para registrar los componentes de alta frecuencia de la señal, pero a costa de la vida de la batería. Los diferentes tipos de transductores incluirán la presión arterial y la presión-volumen, e incluso construcción de una disposición de electrodos transmisor a las dimensiones especificadas por el usuario de acuerdo a las coordenadas estereotácticas de las estructuras cerebrales deseados.The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares R43 / R44 NS064661.
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