Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Framåt Genetics skärmar Använda makrofager att identifiera Published: March 12, 2015 doi: 10.3791/52556
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, New York Medical College
* These authors contributed equally

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) är en obligat intracellulär, protozoer patogen. Det är den smittämnen av toxoplasmos, en hälsorisk med nedsatt immunförsvar. Det är också modellsystem för andra apicomplexan patogener som infekterar människor inklusive Cryptosporidium och Cyclospora. Toxoplasmos är oftast förvärvas genom intag av mat eller vatten förorenat med bradyzoite eller oocyst skede av parasiten. Vid förtäring, dessa stadier konvertera till tachyzoite stadiet av parasiten som replikerar i värdceller och sprider systemiskt. T-celler, IFN-γ och, i mindre utsträckning, kväveoxid 1-4, är viktiga för kontroll av infektion, men är inte i stånd att eliminera sjukdomen, som en andel av tachyzoiter konvertera till bradyzoite stadium som skyddas inom vävnadscystor vilket resulterar i en långlivad kronisk infektion. I själva verket finns det inga terapeutiska effektiva mot kronisk cysta stage av sjukdomen. Svår toxoplasmos är oftast på reaktivering av kvarstående infektion, med bradyzoite stadiet av parasiten konvertera tillbaka till snabbt repliker tachyzoite stadium karakteristisk för primär och akut infektion.

Tidigt överlevnad i ansiktet av det medfödda immunsvaret är viktigt att låta parasiten att nå tillräckligt parasitnummer, samt att nå distala platser, för att möjliggöra etablering av kronisk infektion. T. gondii har utvecklats strategier för att motverka värd försvarsmekanismer som sannolikt bidrar till dess förmåga att replikera och sprida tidigt infektion. Först, T. gondii bildar en unik PV under parasit invasion som är i stort sett åtskilda från endocytiska och exocytiska processer i värdcellen jämfört med andra intracellulära patogener 5-9. Också, liksom alla framgångsrika intracellulära patogener T. gondii modifierar sin värdcell för att skapa en tillåtande miljö feller tillväxt. Detta inkluderar omprogrammering värdcell genuttryck genom att förändra värdcellens transkriptionsfaktorer inklusive de viktiga för att reglera cellaktivering 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, GRA16 21 och GRA24 22 har alla visats vara viktigt för regleringen av transkriptionell respons och cellsignaleringskaskader av värdceller infekterade med T. gondii. Nya studier som använder genetiska korsningar mellan parasitstammar med olika fenotyper har varit mycket produktiv identifiera parasit gener som ligger bakom parasit genotyp beroende egenskaper inklusive försvårande av immunitetsrelaterade GTPaser (IRGs) 16,19,23-26. Hos möss, immunitetsrelaterade GTPaser (IRGs) är kritiska för kontroll av typ II och III genotyper av parasiten medan mycket virulent typ jag genotyper har utvecklats mekanismer för att kringgå murina IRGs. Men det är också klart att parasiten har utvecklat mekanismer för att undgå antimikrobiell mediertorer utöver de IRGs och att vissa av dessa mekanismer kan bevaras över parasit genotyper 27,28. Dessutom är mycket lite känt om de kritiska mediatorer av cell autonom immunitet mot T. gondii under mänsklig toxoplasmos. Parasit gener viktiga för resistens mot mediatorer för cell autonom immunitet kan också vara viktig för överlevnad under tachyzoite att bradyzoite konvertering som även kan utlösas av värdimmunsvar. Exempelvis kan kväveoxid vid höga nivåer trycka parasitreplikation i infekterade makrofager, men det kan också stimulera tachyzoite att bradyzoite omvandling resulterar i cysta produktion 30-32.

ToxoDB är en funktionell genomisk databas för T. gondii som fungerar som en kritisk resurs för området i fråga om att tillhandahålla sekvensinformation för parasiten genomet och tillgång till publicerade och opublicerade iska skala data inklusive samhällskommentarer, gen exp ression och proteomik uppgifter 33. Liknar många protozoiska patogener, majoriteten av genomet består av hypotetiska gener utan information som bygger på gen homologi att ge insikt i deras potentiella funktioner. Således är framåt genetik ett kraftfullt verktyg för att identifiera nya parasit gener som är viktiga för immun skatteflykt, cysta konvertering och andra funktioner som är kritiska för parasit patogenes samt för konvertering mellan olika utvecklingsstadier. En ytterligare styrka framåt genetik är att den kan användas som ett relativt icke-partisk syn att förhöra parasiten om de gener som är viktiga för specifika uppgifter i patogenes, inklusive immun skatteflykt och cystbildning. De senaste förbättringarna i nästa generations sekvense för mutations profilering har gjort det en metod för val för att identifiera de ansvariga parasit gener från terminskontrakt genetik studier med både kemiska och insertionsmutationer 34-37.

ntent "> Det är viktigt att identifiera sårbarheter i T. gondii som kan utnyttjas för att öka effektiviteten i cell autonoma immunmekanismer mot parasiten särskilt de som också kan vara verksamt mot resistenta cysta stadiet. Mot detta mål, ett in vitro murina makrofag infektion och aktivering modell utvecklades för att identifiera mutationer i parasit som specifikt försämra T. gondii kondition efter aktivering av infekterade makrofager men inte i naiva makrofager. Denna makrofag skärmen används för att förhöra ett bibliotek av T. gondii insättnings mutanter för att slutligen identifiera T. gondii-gener viktiga för resistens mot kväveoxid 27,28. Isoleringen av en panel av T. gondii-mutanter med försämrad beständighet mot aktivering av infekterade makrofager, i synnerhet en markant känslighet för kväveoxid, bevisade användbarheten av skärmen för att identifiera parasit gener viktiga för resistensmedlare av cell autonom immunitet annat än resistensmekanismer som beskrivs för de murina IRGs 28. Insertionsmutationer har fördelar jämfört kemiska mutagenes i termer av att generera ett begränsat antal slumpmässiga mutationer i varje parasit-klon och i teorin, enklare identifiering av platsen för mutationen. Emellertid identifiera den genomiska stället hos plasmid infogning i T. gondii insättnings mutanter, i praktiken, har varit överraskande svårt i många fall 37. Insättning av en plasmid i en gen är också sannolikt att störa funktionen av en gen i motsats till kemisk mutagenes som resulterar typiskt i enstaka nukleotidförändringar. Men kemisk mutagenes med antingen N-etyl-N-nitrosourea (ENU) eller etylmetansulfonat (EMS) kan erbjuda en ökad förmåga att analysera en större del av parasiten genomet, jämfört med insertionsmutationer, eftersom det skapar flera enstaka nukleotidpolymorfismer ( uppskattas till 10 -100) per mutant 34, 38. Dessutom har de senaste framstegen inom hela genomet profilering gjorde det möjligt att använda nästa generations sekvense att identifiera de mest sannolika kandidatgener som är ansvariga för den identifierade fenotypen av en muterad parasit 34,38. Oavsett vilken mutagenes tillvägagångssätt, bekräftelse av den roll av parasiten genen i resistens mot makrofagaktivering slutligen kräver gendeletion och komplemente att uppfylla molekylär Kochs postulat.

Förmågan att dissekera funktionen av en gen genom genetisk manipulering av både parasiten och makrofagen är viktigt eftersom många av de gener som identifierats via valuta genetik i T. gondii, samt andra patogener, kännetecknas fortfarande som hypotetiska gener med liten eller ingen sekvenshomologi till andra proteiner med kända funktioner. Den nuvarande pappers skisserar en allmän riktlinje som kan användas för att identifiera om den avbrutna genen i en mutant är viktigt för resistens mot en känd ellerokända förmedlare av cell autonom immunitet. Den inledande analysen av värdantimikrobiella faktorer utförs genom att utvärdera överlevnad vildtyp och muterade parasiter i makrofager från vildtypsmöss kontra de med specifika gen deletioner i inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS), gp-91 phox (NADPH-oxidas), och specifika immunitetsrelaterade GTPaser (IRGs). Detta kommer att avgöra om de identifierade parasit gener är viktiga för resistens mot kväveoxid, reaktiva syremellan eller immunitetsrelaterade GTPaser 28 respektive eller om en okänd immunmekanism är involverad. Aktivering av infekterade makrofager med både IFN-γ och LPS, som beskrivs i det nuvarande protokollet, resulterar primärt i isolering av parasit gener som är viktiga för resistens mot kväveoxid 28. Användningen av farmakologiska medel som inducerar kväveoxid i frånvaro av makrofagaktivering (kväveoxiddonatorer) bekräftade att de flesta av de gener som identifierats var viktiga för remotståndskraften vid kväveoxid stället kväveoxid i samförstånd med ytterligare medlare i samband med makrofagaktivering 28.

Steg ett och två beskriver en framåt genetik skärm utformad för att isolera parasit mutanter med fitness defekt efter aktivering av infekterade benmärgsmakrofager in vitro. Steg ett beskriver en dostitrering analys för att empiriskt bestämma en dos av IFN γ och LPS att använda för makrofagaktivering som minskar parasiten replikering men hämmar inte replikering av vildtyp T. fullt gondii moderstammen som används för skapandet av bibliotek av parasit mutanter. Steg två beskriver den främre genetiska screeningen av de mutanta kloner i makrofager i 96-brunnsplattor. Steg tre skisserar en strategi för att bekräfta fenotypen av varje mutant identifierats i skärmen av de 96 brunnar och att utvärdera om felet i varje mutant påverkar parasit överlevnad, replikering,eller cysta produktion som svar på makrofagaktivering. Steg fyra beskriver användningen av benmärgshärledda makrofager från möss med deletioner i specifika antimikrobiella vägar för att identifiera de immunmediatorer till vilken parasiten mutanten är specifikt känsliga. Steg fem skisserar en strategi för att avgöra om en parasit mutant också äventyras för in vivo patogenes som utvärderats av cysta produktionen i hjärnan hos infekterade möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla protokoll som innefattar användning av djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av New York Medical College Animal Care och användning kommittén.
OBS: Detaljerad protokoll för kemisk mutagenes 38, isolering av parasiter genom att begränsa utspädning 38, isolering av murina benmärg härledda makrofager 39, tillväxten av T. gondii i mänsklig förhudsfibroblast (HFF) celler och cysta produktion i makrofager och grundläggande immunofluorescensanalys (IFA) 32 refereras. Genomför allt cellodling vid 37 ° C i 5% CO2 i D10 media (Dulbeccos modifierade högglukos Eagle Medium kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin) . Håll alla reagenser sterila hela cell isoleringar och cellodling.

1. dostitrering av IFN-γ och LPS att bestämma Concentrheten att använda för att aktivera infekterade makrofagerna för Forward Genetics Screen

  1. Kultur murina härledd från benmärg makrofager O / N i åtta kammarglas vid en koncentration av 3 x 10 5 celler / ml i 250 l av D10 media per kammare. Använd makrofager 01:59 veckor efter isolering från benmärg.
    OBS: Kammar diabilder köps som har en tillväxthöjande RS tvätta.
  2. Använd en hemocytometer för att räkna vildtyp parasiter skördade från humana förhudsfibroblast (HFF) -celler odlade i en T25-vävnadsodlingskolv. Resuspendera parasiter vid en koncentration av 5 x 10 5 vildtyp parasiter per ml i D10 media. Denna koncentration kommer att resultera i en infektionsmultiplicitet av cirka 1: 1 som makrofagerna kommer frodats O / N. Använd polystyren eller PET-rör för alla manipulationer med parasiter som parasiten fastnar polypropylen.
  3. Ta bort D10 media i kammar diabilder och ersätta med 250 ul avsuspension av vildtyp parasiter. Försiktigt lägger parasiten suspensionen till varje kammare av bilden genom att låta den rinna ner insidan av varje kammare. Låt inte makrofager att torka ut när som helst under protokollet.
  4. Täck kammare diabilder infekterade med parasiter med kammarglidskyddet och placera i en inkubator vid 37 ° C i 5% CO2 under 4 h för att ge tid för parasiten att invadera och etablera en PV.
  5. Gör utspädningar av LPS och IFN-γ i 1 ml D10 medier i sterila rör för dostitreringar. För dostitreringar håller antingen LPS eller IFN koncentrationen konstant och varierar den andra stimulus 40.
    1. Till exempel hålla LPS konstant vid 10 ng LPS per ml och variera koncentrationen av IFN γ (0, 1 enhet / ml, 10 enheter / ml, 100 enheter / ml, 1000 enheter / ml). Håll IFN γ konstant vid 100 enheter / ml och variera koncentrationen av LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Kortfattat Sonikera LPS lager för 2 min utanupphettning i en badsonikator (inte med en spets sonikator) före utspädning.
      OBS: Sonikering rekommenderas att störa micelliknande aggregat bildas av LPS som kanske binder ordentligt till värdceller.
  6. 4 timmar efter initiering av samodling mellan parasiter och vidhäftande makrofager i kammaren slide, kassera D10 media i varje kammare och ersätta det med 300 pl lämpliga utspädningar av IFN γ och LPS i D10 media. Inkludera en kontroll med enbart D10 media att utvärdera parasit replikering i avsaknad av makrofagaktivering.
  7. Re-cover kammare diabilder med kammarglidskyddet och placera i en inkubator vid 37 ° C i 5% CO2 under 24 till 30 extra timmar.
    OBS: Inkubationstiden beror på fördubblingstiden för vildtyp parasit-stam som kan variera från 6 till 12 h beroende på parasitstam. En tidpunkt väljs före parasit lys av naiva makrofager men tillräckligt lång för att åtminstone 3-4 doubling gånger.
  8. Gör en 2,5% -ig formaldehydlösning i Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (PBS). Kassera medierna i kammaren sliden och ersätt med 300 pl av den formaldehydlösning 2,5%. Fix för 20 min vid RT.
  9. Skölj objektglaset (er) två gånger med 300 | il av PBS per kammare. För varje sköljning, kassera PBS i bilden och lägga till nya PBS försiktigt ner insidan av varje bild kammare för att undvika störningar makrofagerna fastnat på bild. Lägg 300 l PBS per kammaren och plats locket på kammar slide att förhindra diabilder från att torka ut före färgning.
    OBS: Objektglasen kan placeras vid 4 C i upp till 3 dagar vid denna punkt före färgning.
  10. Färgningsprotokollet för T. gondii detektion av immunofluorescensmikroskopi (IFA).
    1. Gör en 0,2% Triton X-100-lösning i PBS (permeabilization buffert). Placera lösningen i ett rör i en 37 ° C vattenbad och kort virvel den för att garantera Triton X-100 går i lösning. KasseraPBS i kammar diabilder och ersätta med 300 ul av permeabilization buffert. Lämna vid RT i 30 min.
    2. Gör en lösning av 10% getserum i PBS (blockeringslösning). Kasta permeabilization buffert i bilden och ersätta med 300 pl blockerande lösningen per kammare. Lämna vid RT i 30 min.
      OBS: Fetalt kalvserum kan användas i stället för getserum i alla färgningsprotokoll.
    3. För en ett steg IFA färgningsprotokollet, gör en 1: 1000 utspädning av en fluorescerande antikropp till T. gondii i blockeringslösning. Ta bort blockerande lösningen från bild och lägga 150 pl antikroppslösning per kammare. Byt locket på kammar slide att hindra cellerna från att torka ut. Inkubera i en timme vid RT.
      OBS: Antikropps koncentration måste bestämmas empiriskt beroende på källan. Antikropp köps direkt konjugerad till en fluorokrom eller konjugerad till en fluorokrom av användaren.
      1. För en tvåstegs IFA färgningprotokoll med en okonjugerad antikropp mot T. gondii och en fluorescerande konjugerad sekundär antikropp, fläck diabilder med 150 pl okonjugerad primär antikropp mot T. gondii i blockeringsbuffert under 1 h vid RT. Skölj 3x med 300 ul PBS plus 1% getserum (tvättbuffert).
      2. Lägg 150 pl fluorescerande-konjugerad sekundär antikropp specifika för arten ursprungsbeteckningar för den primära antikroppen. Byt locket på kammar slide att hindra cellerna från att torka ut. Inkubera i en timme vid RT.
    4. Skölj objektglasen 3x med PBS plus 1% getserum (tvättbuffert). För varje sköljning, ta bort lösningen i kammaren diabilder genom att dumpa ut dess innehåll och ersätta med 300 ul tvättbuffert.
    5. Skölj objektglasen 2x med 300 ul PBS.
    6. Ta kammaren från kammaren slide enligt tillverkarens anvisningar.
    7. Mount glider med montering media innehållande DAPI (4'6-diamidino-2-fenylindol, dilactate) och en 22 mm x 50 mm täckglas.
  11. Undersök diabilder som använder faskontrast och fluorescens mikroskopi. Bestäm det genomsnittliga antalet parasiter per vacuole genom att undersöka minst 100 PV per kammare väl. Den valda dosen av IFN-γ och LPS för skärmen måste vara tillräcklig för att undertrycka, men inte hindra, replikering av vildtyp parasiter (se figur 1).

2. Isolering av Parasite Mutants med gratis Defekt Efter Aktivering av infekterade makrofagerna

OBS: Ett bibliotek av slumpmässiga T. gondii mutanter krävs för framåt genetik skärmen. Slumpmässig mutagenes av T. gondii kan utföras genom kemisk (ENU / EMS) eller insertionsmutationer 27,28,38. Efter mutagenes, klon parasiter genom begränsande utspädning och växa enskilda kloner i 96-brunnsplattor innehållande vidhäftande HFF-celler i en volym av 200 | il av D10 media 32,38.Det är viktigt att 96-hålsplattor för screening av parasiter i makrofager genom mikroskopi har optiska bottnar för att möjliggöra mikroskopisk screening. Fas kontrast och fluorescensmikroskopi för screening färgade 96-hålsplattor kräver ett inverterat fluorescensmikroskop med faskontrast 4, 10, 20 eller 40X objektiv utrustade för långa arbetsavstånd. En 4X objektiv är användbart för att se hela brunnen men bättre upplösning av parasiterna uppnås med 20X objektiv.

  1. Överför 50 ul av tachyzoite mutanter odlas i konfluenta HFF-celler i 96-brunnars vävnadsodlingsplattor i två replikera 96-brunnsplattor innehållande murina benmärgshärledda makrofager (1-2 veckor efter isolering) i 100 pl av D10 media.
    OBS! Utför den initiala skärmen i 96-brunnars plattor av parasiten baserat på volymen av parasitkulturen att undvika att behöva räkna antalet parasiter som överförs per varje brunn. Således är det mikroskopi analysen i 2.6 kvalitativt utifrån whether parasiter har generellt replik eller inte replikeras. Steg 3 beskriver tillvägagångssätt för att bekräfta fenotypen av mutanterna i kammar diabilder använder lika många vildtyp eller muterade parasiter att infektera makrofager.
    1. Direkt lägga parasiter till D10 medierna redan i varje brunn. Infektera två brunnar med vildtyp tachyzoiter som en positiv kontroll för parasiten replikering.
  2. Placera de infekterade cellerna in i en inkubator (37 ° C och 5% CO2) under 4 h för att tillåta parasiter tid att invadera celler och skapa sin PV.
  3. Ta ut mediet från en tallrik genom dumpning innehållet i plattan. Använd en enda luckan av handleden för att dumpa medierna i plattan i en kasse bassäng innehåller en tvättmedelsdödande för parasiter.
    1. Lägg 100 pl "makrofagaktivering media" med en steril bassäng för media och en flerkanalspipett. Använd den optimala koncentrationen av LPS och IFN-γ bestäms från steg 1 för macrophage aktivering media. Likaså bort media från dubbletter kontrollplatta och ersätta med 100 pl D10 media.
  4. Placera de infekterade cellerna in i en inkubator (37 ° C och 5% CO2) under ytterligare 24-30 h.
  5. Färgningsprotokollet för 96-hålsplattor för IFA.
    1. Kasta medierna i plattan och ersätt med 100 pl 2,5% formaldehyd i PBS. Inkubera under 20 min vid RT. Använd en steril skål för formaldehyd och en flerkanalspipett.
    2. Kassera formaldehydlösningen i plattan och tillsätt 100 pl PBS för att skölja formaldehyd från plattan.
    3. Kassera lösningen i plattan och tillsätt 100 | il av permeabilization buffert (PBS med 0,2% Triton X-100) till varje brunn. Inkubera under 30 min vid RT.
    4. Kassera lösningen i plattan och tillsätt 100 | il blockeringslösning (PBS med 10% getserum) till varje brunn. Inkubera under 30 min vid RT.
    5. Kassera lösningen i psent. Lägg 50 ul / brunn av en fluorescens-konjugerad anti- T. gondii-antikropp utspädd 1: 1000 i PBS plus 1% getserum. Inkubera i 1 h vid RT med plåtlocket på och på en vippa.
      1. Alternativt kan du använda en okonjugerad primär antikropp mot T. gondii följt av färgning med en fluorescent-konjugerad sekundär antikropp, såsom beskrivs i 1.10.3.1.
    6. Kassera antikroppslösningen i plattan och ersätt med 100 pl / brunn av PBS plus 1% getserum. Utför denna skölj 3x följt av 2 extra sköljningar med PBS ensam. Lämna 200 l PBS i varje brunn och sätt tillbaka locket på 96 brunnar för att förhindra brunnarna torkar.
      OBS: Plattan med klädseln på kan vara insvept i parafilm och placerades vid 4 ° C i upp till 3 dagar före analys genom mikroskopi.
  6. Undersök celler under ett inverterat fluorescerande mikroskop med hjälp av en 20-40X mål. Välj mutanter som replikerar i na &# 239; ve makrofag platta men övervägande misslyckas med att replikera bortom en parasit / vacuole i "aktiverade makrofager" eller som verkar amorft eller ned i "aktiverade makrofager".
    OBS: Antalet vildtyp parasiter per vacuole beror på dosen av IFN-γ och LPS används men helst är cirka 4 parasiter per vacuole; ett nummer som reflekterar tillväxthämning, men inte fullständig inhibering av replikation genom aktivering stimulans.

3. Utvärdera Mutants här avgör om felet är i nivå med Parasit Överlevnad eller replikering Efter Aktivering av infekterade makrofagerna

  1. Överföring vald parasit mutanter från 96-hålsplattor (innehållet i hela väl) till T25s innehåller HFF-celler och tillåta replikering.
  2. Kultur benmärg härledda makrofager O / N i åtta kammarobjektglas vid en koncentration av 3 x 10 5 celler / ml i 250 | il av D10 media. Förbered en bild för att jämföra parasite replikering i naiva makrofager och ytterligare slide jämföra parasit replikering efter aktivering av infekterade makrofager.
  3. Harvest tachyzoite parasiter och räkna i en hemocytometer. Lägg 5 × 10 4 T. gondii parasiter till en kammare väl innehåller makrofager i D10 media och kultur under 4 timmar. Inkludera en brunn med vild typ föräldra parasiter som en kontroll. Ympa en identisk kopia slide med samma parasit klon som inte kommer att få aktiverings media för att övervaka replikering av parasiter i naiva makrofager.
  4. Kasta D10 media från 1 av likadana kammare diabilder och ersätta med 250 pl "aktiverings media". Kasta D10 media från andra replikera kammar slide och ersätta med 250 pl D10 media. Inkubera både den "aktiverade" och "naiv" makrofag slide med kammarglidskyddet på vid 37 ° C och 5% CO2 under en additional 24-30 tim.
  5. Fix, permeabilisering, och blockera diabilder för IFA-färgning och analys av parasiter, såsom beskrivits i Steg 1. Utför IFA färgning med kamrarna intakta.
    1. Co-fläck celler med en antikropp mot lysosomalt membran associerat 1 (LAMP1) eller Lysotracker och antikropp mot T. gondii att utvärdera om aktivering av infekterade makrofager utlöser fusion av de muterade PV med lysosomer (Figur 4).
    2. Använd antikroppar mot specifika fack / organeller inom parasiten / PV för färgning av IFA att identifiera förändringar i parasiten mutant som är uppenbara tidigt efter makrofagaktivering 28.
      OBS: Sådana förändringar kan ge insikt i den mekanism som ligger bakom den bristfälliga överlevnad / replikering av mutanten efter makrofagaktivering.
  6. Undersök diabilder med en 100X fas olja objektiv och fluorescensmikroskopi.
    1. Utvärdera parasit replikering genom att bestämmaantal parasiter per PV i 100 slump vakuoler. Utför minst två fall av 100 vakuoler vardera för statistisk analys.
    2. Utvärdera allmänna parasit morfologi med både fluorescensanalys samt faskontrastmikroskopi. Se parasiter enligt fas 100x mål. Friska parasiter har parasiter tätt innesluten i en åtsittande parasitofor vacuole. Parasiter som har amorfa rymliga vakuoler med fas täta fälgar eller amorfa parasiter tyder parasit döden snarare än bara en defekt i replikering (figur 1 och 3).

4. Utvärdera huruvida Känslighet för Mutant Parasiter till Aktivering av infekterade makrofagerna är förbundna med kända antimikrobiella Medlare

  1. Isolera benmärgsmakrofager från vild typ C57 / BL6 möss, iNOS - / -, gp91-phox - / - eller Irgm1 / Irgm3 - / - möss 32.
  2. Kultur respektive benmärg härledd macrophages O / N i åtta kammarobjektglas vid en koncentration av 3 x 10 5 celler / ml i 250 | il av D10 media.
  3. Fortsätt med parasit utmaning, IFA färgning, och analys som beskrivs i steg 3.
  4. Ta reda på om möjligheten för de muterade parasiter att överleva och reproducera efter aktivering av infekterade makrofagerna återställs i frånvaro av reaktiva syre eller kvävearter eller specifik immunitet relaterade GTPaser 28.
  5. Använd farmakologiska medel, såsom kväveoxid-donatorer, för att utvärdera om specifika antimikrobiella mediatorer är tillräckliga i sig själva för att försämra muterade parasiter i HFF-celler eller naiva makrofager, eller om de bara agerar i samförstånd med andra förmedlare av makrofager aktivering 28.

5. Utvärdera om defekten i Mutant Parasit Kompromisser kronisk infektion

  1. Isolera tachyzoiter från vildtyp, mutant eller riktade gen bort parasiter odlas i T25s containing HFF-celler. Parasiter måste färsk lyseras från HFF kulturer.
  2. Räkna parasiter med hjälp av en hemocytometer. Resuspendera parasiter i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) vid en koncentration per ml lämplig för en sub-letal dos av parasiten levereras i 200 pl genom intraperitoneal (IP) injektion.
  3. Använd en tuberkulinspruta 1 ml och 25 G nål för att injicera parasiter med 200 l volym intraperitonealt (IP). Dosen beror på vildtypstammen av parasiten och musen genotyp.
    OBS: Typ I genotyper av parasiten är dödliga för mössen under den akuta skedet av infektionen oavsett parasit dos och är inte lämpliga för studier av kronisk infektion i frånvaro av kemoterapi för T. gondii att undertrycka parasitreplikation.
  4. Trettio dagar efter parasit utmaning, offra möss genom inandning av CO2 från en trycktank i en trängsel kammare (en standardstorlek mus bur får inte innehålla mer än 5 mis) följt av cervikal dislokation.
  5. Isolera hjärnan från musen genom etablerade förfaranden 41-43.
    1. Placera musen på sin framsida. Spray huvudet med 70% etanol för att sterilisera området.
    2. Använd vass sax för att skära genom hjärnstammen. Använd dissekera sax för att göra ett grunt snitt i sidled runt höger och sedan vänster sida av skallen med start från basen på hjärnstammen. Använd pincett för att försiktigt dra tillbaka skallen att exponera hjärnan.
    3. Lyft försiktigt hjärnan och placera sax mellan hjärnan och basen av skallen för att skära luktnerven att frigöra hjärnan. Lyft ut hjärnan med steril pincett eller en spatel och placera i en bakteriologisk Petri skylt som innehåller 10 ml steril PBS.
  6. Skär hjärnan i hälften med en steril skalpell genom centrum mellan höger och vänster hjärnhalvorna.
  7. Tillsätt hälften av hjärnan till en liten mortel innehållande 1 ml PBS. Använd mortel tillgöra en fin vävnadssuspension av hjärnan som kan passera genom en bred borrning 20-200 mikroliter pipettspets.
    OBS: Den andra halvan av hjärnan bör fastställas i 2,5% formaldehyd i 1 timme om vävnadssnitt behövs för histopatologi.
  8. Placera 100 pl av hjärnan lysatet i en 1,7 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt 1 ml 2,5% formaldehyd i PBS i röret innehållande hjärnan lysatet att fixera hjärnan suspension för färgning. Inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter.
  9. Centrifugera lysatet vid 8000 xg under 5 min i en mikrocentrifug och försiktigt kassera supernatanten.
  10. Tillsätt 1 ml permeabilisering / blockeringsbuffert till lysatet (10% getserum, 0,2% Triton X-100 i PBS). Inkubera vid rumstemperatur under 30 minuter.
  11. Centrifugera lysatet vid 8000 xg under 5 min och avlägsna supernatanten.
  12. Tillsätt 200 pl FITC-konjugerad Dolichos biflorus agglutin (DBA). Använd en 1: 100 spädning av lektin i PBS plus 10% getserum. Försiktigt resuspendera lysatet genom pipettering. Inkuberaunder 1 h vid RT.
    OBS: DBA är en ligand som binder till CST1 på parasiten cysta väggen.
  13. Centrifugera lysatet vid 8000 xg under 5 min och kassera supernatanten. Tillsätt 1 ml PBS till pelleten. Inkubera vid RT i 5 min. Upprepa PBS tvätta 3x. Avlägsna supernatanten efter den slutliga tvätten med användning av en pipett.
  14. Använd en bred borrning 20-200 l pipettspets att utarbeta 5 ìl av färgade hjärn lysat och plats på ett objektglas. Montera bild med en 25 x 25 mm täckglas för att skapa en våt fäste av hjärnan lysat. Gör 3 likadana bilder med hjälp 5 pl hjärnan lysat vardera.
  15. Räkna antalet cystor per varje 5 pl alikvot genom fluorescensmikroskopi med hjälp av en 10X objektiv (Figur 6).
    OBS: Vissa cystor är stora (8 eller fler parasiter ungefär) medan vissa är mycket små (1-2 parasiter per cysta). Räkna totalt antal cystor per varje bild, men dokument antal stora kontra antal små cystor.
  16. Lägg antalet cystor Detsad i de tre olika 5 l alikvoter och multiplicera med den totala utspädningsfaktor x 2 (bara hälften av hjärnan gjordes till ett lysat) för att uppskatta det totala antalet cystor per hjärnan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Toxoplasma gondii replikerar fritt i naiva makrofager och har en fördubbling tid mellan 6-12 h beroende på den stam av parasiten. Figur 1 visar representativa parasiter i naiva kontra aktiverade benmärgshärledda makrofager. Figur 2 visar den allmänna morfologin hos parasiter i HFF värdceller vid 2, 4, 8, 16 och 32 parasiter / PV. I det nuvarande protokollet, är parasiten tillåts invadera naiva makrofager och etablera en begynnande parasitofor vacuole (PV) före leverans av en potent aktivering stimulans, LPS och IFN, till de infekterade makrofagerna. I denna modell är replikering av vildtyp parasiter avtagit, men parasiten replikering fortsätter fortfarande för cirka 24 timmar under vilken tid makrofagerna blivit allt mer skickliga på att hämma parasit replikering. Skärmen är avsedd att fungera som en modifierad konkurrensmodell mellan den tid som krävs för potent makrofag activation kontra den tid under vilken vildtypen parasit eller parasit mutant kan fortsätta att replikera inom dess PV. Det första steget i skärmen är att välja en dos av LPS och IFN γ som skall användas för aktivering av infekterade makrofager. Dosen bestäms empiriskt genom utvärdering parasiten replikering i makrofager aktiveras med antingen en konstant dos av IFN γ i kombination med en rad LPS koncentrationer eller en konstant dos av LPS med en rad IFN koncentrationer (steg 1). Dosen av aktiverings stimuli måste utvärderas för föräldra vildtyp parasiter som används för skapandet av parasiten mutanter genom kemisk eller insertionsmutationer. Idealt dosen av LPS och IFN γ tillåter parasit replikering till ett genomsnitt av 2-8 parasiter per PV 24-30 h efter aktivering jämfört med 8-16 parasiter per PV i naiva makrofager (fig 1 och 2).

När lämplig koncentration av LPS och IFN ^7; bestäms, är mutanterna screenas i 96-brunnars optisk bottnade vävnadsodlingsplattor. Den optiska botten i plattorna är viktigt eftersom oegentligheter i plast som används för traditionella vävnadsodlingsplattor gör det svårt att uppnå lämplig upplösning för att screena parasiterna genom fas kontrast och fluorescensmikroskopi. Faskontrast och fluorescensmikroskopi av de 96-brunnars plattor kräver också ett inverterat fluorescensmikroskop med faskontrast 4, 10, 20 eller 40x objektiv utrustad för långa arbetsavstånd. Mutanter screenas i likadana plattor innehållande murina benmärgshärledda makrofager. Efter utmaning med parasit mutanter, är infekterade makrofager i brunnarna i en platta aktiveras med LPS och IFN γ medan den andra plattan innehållande infekterade makrofager odlas i enbart D10 media. Plattorna inkuberas vid 37 ° C och 5% CO2 under 24-30 h efter tillsats av LPS och IFN γ. Efter inkubation celler är fiXED, färgades för parasiter och analyserades genom IFA med hjälp av både fluorescens och faskontrast mikroskopi. Mutanter väljs som har normala parasit nummer och replikering i naiva makrofager men färre parasiter eller mindre vakuoler med färre parasiter i infekterade makrofager som aktiveras. När mutanter väljs bör de skreenas i kammar diabilder (steg 3) i naiva och aktiverade makrofager i två oberoende experiment för att möjliggöra analys av parasit morfologi vid högre förstoringar (100X objektiv och olja) och för att bekräfta att de har normal replikering i naiva makrofager men en defekt i replikering / överlevnad efter makrofagaktivering.

De fenotyper av mutanter med defekter i resistens mot aktivering av infekterade makrofagerna faller vanligtvis i två kategorier: parasiter som visas morfologiskt intakta men inte kan replikera utöver en enda parasit per PV; och parasiter som verkar vara DegradEd och kan även vara i amorfa rymliga PV (fig 1 och 3). Morfologi och ultra av parasiten och PV ses bäst på bilder med hjälp en 100X objektiv och olja och genom faskontrastmikroskopi kombinerat med fluorescensanalys. Färgning av parasiter för IFA med en antikropp mot lysosomal associerat membranprotein-1 (LAMP1) är användbar för att avgöra om felet i mutanten är förknippad med en oförmåga av PV för att förhindra fusion med lysosomer. Visat i figur 4 är en parasit inom ett phagolysosome (LAMP1 positiv) kontra en parasit som är i en PV som är i stort sett åtskilda från den endocytiska systemet hos värdcellen (LAMP1 negativ). Den phagolysosome framgår av en sammanhängande fast kant LAMP1 spännare runt hela parasiten. I motsats härtill har en PV ofta lysosom organeller i närheten men ingen kontinuerlig kant LAMP1 färgning runt dess omkrets. Användningen av antikroppar mot definierade strukturer / organeller inom tHan parasiten och / eller PV är användbara i uppföljning IFA studier för att identifiera avvikelser i varje mutant i samband med aktivering av infekterade makrofager. Sådana förhör med antikroppar kan ge insikt i de mekanismer som ligger bakom den replikering / överlevnads defekt i en mutant. Till exempel, figur 5 visar T. gondii mitokondrien färgas med monoklonal antikropp 5F4 anti-F1 ATPas beta-subenhet (en slags gåva från Peter Bradley) 24 timmar efter aktivering av makrofager som infekterats med vildtyp parasiter eller parasit mutanter. T. gondii var co-färgas med en monoklonal anti- T. gondii-antikropp. Vildtyp T. gondii har en enda mitokondrien som sträcker sig runt omkretsen av parasiten. Parasiten enda mitokondrien i vild typ parasiter efter aktivering av infekterade makrofager var intakt jämfört med en splittrad mitokondrien i muterade parasiter. Mitokondrier fragmentering var tydligt inte bara i nedbruten / amorfparasiter men även hos parasiter som visas normal morfologi såsom utvärderats genom faskontrastmikroskopi. Detta tyder på att felet i parasiten mutanten kan öka känsligheten av parasiten mitokondrien som värd cellmediatorer induceras av makrofagaktivering.

Den nuvarande modellen använder en kombination av IFN-γ och LPS att aktivera infekterade makrofagerna. IFN γ stimulerar transkriptionsfaktor STAT1. LPS, liksom TNF-α, stimulerar transkriptionsfaktor NF-kB. Känd IFN γ -beroende antimikrobiella mediatorer viktiga i cell autonoma immunitet mot T. gondii inkluderar en matris med IFN γ -beroende immunitetsrelaterade GTPaser (IRGs, Gbps) och reaktiva kväve- och syrespecies utöver andra medel. För att avgöra om felet i varje mutant är specifikt förknippas med produktion av kända IFN γ -inducerbara antimikrobiella mediatorer, är härledd från benmärg makrofager isolerade fråniNOS - / -, gp 91 phOx - ​​/ - eller specifika IRG / GBP gen raderade möss och analyserades med avseende aktivitet mot de muterade parasiter. Kombinationen av IFN γ och LPS att aktivera infekterade makrofager leder företrädesvis i mutanter med förbättrad känslighet för kväveoxid jämfört med vildtypen parasiter 28.

Aktivering av infekterade makrofager kan inducera skede differentiering av parasiterna från tachyzoiter till bradyzoiter som finns i vävnadscystor. Sådana cystor är karakteristiska för kronisk infektion. Således kan parasit mutanter som är defekta för replikering / överlevnad efter aktivering av infekterade makrofager också vara defekt för konvertering till cystor under in vivo infektion. För att utvärdera cysta produktion under kronisk infektion, möss utmanas intraperitonealt (ip) med en icke-dödlig dos av föräldra parasiten stam eller mutant klon. Cystor i hjärnan varierar i storlek från mindre än 10 _6;. Mi diameter till mer än 50 um som visas i figur 6 Räkna antalet både stora och små cystor av IFA, men hålla räknas separat för att avgöra om parasiten mutanten är nedsatt för total cysta produktion eller bara för etablering och underhåll av stora cystor.

Figur 1
Figur 1. Naiva murina benmärgshärledda makrofager är permissiva för replikation av T. gondii men aktivering med IFN γ och LPS väsentligt hämmar replika. (A) En parasitofor vacuole (PV) av vildtyp T. gondii 24 timmar efter invasionen av naiva murina benmärgsmakrofager. (B) En PV av vildtyp T. gondii Parasiter bestående av fyra parasiter per vacuole 24 timmar efter aktivering av infekterade makrofager.(C) Ett exempel på en mutant parasit oförmögen att replikera och fortfarande på en parasit / PV 24 h efter aktivering av infekterade makrofager. (D) Ett exempel på en mutant parasit som visas bryts ned inom en amorf PV 24 h efter aktivering av infekterade makrofager . På översta raden redovisas fas bilder av parasiter och den nedersta raden visar fluorescerande bilder med hjälp av en polyklonala anti-serum mot T. gondii. Skalan stapel representerar 5 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Parasit replikering utvärderas av antalet parasiter per PV. Bilderna visar 2, 4, 8, 16 och 32 parasiter per PV i HFF-celler. Varje bild är en sammanslagna fas bild thpå visar polyklonala antikroppar färgning av parasiten i rött och HFF kärnan i blått (DAPI). Skalan stapel representerar 5 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Mutanter uppvisar en rad fenotyper efter aktivering av infekterade makrofagerna. Kolumnen till vänster är en fas bild av parasiten i makrofager, är centrum kolumnen en fluorescerande bild med hjälp av en antikropp mot T. gondii, och den högra kolumnen är en sammanslagning av fas och fluorescerande bild. Parasiten visas i grönt och makrofag kärnan i blått. Skalan stapel representerar 5 um. Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. LAMP1 färgning skiljer PV från phagolysomes-innehållande parasiter. Parasiter färgas med en polyklonal anti T. gondii antikropp (röd) och LAMP1 med mAb 1D4B (grön). En pil markerar en parasit PV som har smält med lysosomer. Parasiten utan pilen är i ett parasitofor vacuole (PV) som inte har smält med lysosomer. Skalan stapel representerar 5 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Vildtyp parasiter upprätthålla en intakt mitokondrien medan mitochondriPå bryts ner i parasit mutanter efter aktivering av infekterade makrofagerna. Mitochondrion (grön) i vildtyp parasiter (övre panelen) jämfört med tre olika mutant T. gondii parasiter i olika stadier av nedbrytning (botten tre paneler) 24 timmar efter aktivering av infekterade makrofager. Skalan stapel representerar 5 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Upptäckt av parasit cystor i hjärnan med hjälp av FITC-konjugerade Dolichos biflorus lektin. Den cysta väggen märkt med lektin visas i grönt. Skalan stapel representerar 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrivna protokollet ger en icke-partisk tillvägagångssätt som använder aktivering av murina benmärgsmakrofager och termins genetik att isolera T. gondii mutanter med en defekt i sin förmåga att överleva aktivering av infekterade makrofager. Fenotypen av mutanter efter makrofagaktivering faller vanligtvis in i två huvudkategorier: 1) Parasiterna verkar intakt men misslyckas med att replikera än 1 parasit per PV; 2) Parasiterna vara försämrade och kan vara i rymliga, amorfa PV. Det faktum att mutanterna har en fenotyp som vildtyp parasiter i naiva makrofager i frånvaro av aktiverings bevisar protokollet kan specifikt användas för att identifiera mutanter som specifikt är osäkra i sin förmåga att motstå makrofagaktivering. Användningen av primära benmärgshärledda makrofager rekommenderas kontra RAW 264.7 makrofagcellinje för skärmen eftersom morfologin för parasiter och parasitnummer per vacuole lättare visualiseras i benmärgsmakrofager.

Den beskrivna skärm kombinerat med framåt genetik ger ett mångsidigt verktyg för att dissekera parasit gener och slutligen genetiska vägar som är viktiga för resistens mot specifika mediatorer för cell autonom immunitet. Sådana framtids genetik studier är viktigt att identifiera parasit gener som kan följas som en sträng för att börja reda ut parasit vägar som är viktiga för att motstå specifika antimikrobiella medlare både in vitro och under patogenes. En tidigare svårighet med framåt genetiska metoder var att identifiera nyckel genen störd i varje mutant. Kosmidbibliotek komplettering i T. gondii har varit ganska effektiv för funktionell komplettering av celldelning mutanter. Emellertid, det faktum att replikation av vildtyp parasiter är också ned av IFN-γ och LPS bara i mindre utsträckning än de mutanter, gör funktionell komplettering svårare than för celldelnings mutanter. Hela genomet mutations profilering för både kemiska och insättnings mutanter i T. gondii har nyligen dykt upp som en produktiv, och även kostnadseffektiva, avenue att identifiera de gener som är ansvariga för fenotyper av mutanter i termins genetik skärmar 34,36,37,44. Följaktligen har hela genom mutations profilering använder nästa generations sekvense förstärkt de potentiella användningsområdena för kemisk mutagenes av T. gondii i termins genetiska studier för att identifiera gener som är viktiga för specifika funktioner. En sådan framåt genetik tillvägagångssätt som beskrivs i det nuvarande protokollet är viktiga eftersom de flesta av genomet hos T. gondii förblir hypotetisk med en majoritet av förutsedda gener har ingen homologi till andra gener eller funktionella domäner som kan hjälpa till att identifiera parasit kandidat gener som är viktiga för immun skatteflykt.

IFA-analys av 96 brunnar i allmänhet inte betraktas som en högkapacitetsscreening träffadehod. Enligt vår erfarenhet är det rimligt för en person att färga och skärm 10 96 brunnar i en dag eller cirka 960 mutanter. I artikeln av Skariah et al., Har cirka 8.000 mutanter analyseras och 14 oberoende mutanter isolerades som avsevärt skulle försämras för överlevnad / replikering i aktiverade men inte naiva makrofager 28. Den försämrade överlevnad av mutanterna var övervägande ett resultat av ökad mottaglighet för kväveoxid. Begränsningen i den totala metoden är i första hand på nivån för att erhålla enskilda kloner av parasiten snarare än screening genom mikroskopi som den initiala skärmen i 96 brunnars plattor är kvalitativ och någorlunda snabb. Bekräftelse av fenotypen av mutanter som identifierats i skärmen i 96 brunnars platta följs upp i steg 3 genom kvantitativ och kvalitativ analys med användning av makrofager i kammare diabilder och genom tillsats av lika antal av vildtyp eller mutanta parasiter. Användningen av andra analytiska screeningmetodersåsom fluorometri vid den totala befolkningen nivån parasiter, snarare än den enskilde parasiten nivå utvärderas genom mikroskopi, är problematiska i det nuvarande protokollet eftersom många av de skadade parasiter färgas med polyklonala antikroppar mot T. gondii så robust som vildtyp parasiter med skillnaden i mutanten är mer kvalitativ än kvantitativ på nivån av fluorescensintensitet. Även dosen av IFN-γ och LPS som krävs för att isolera mutanter med en defekt i motstånd mot aktivering av infekterade makrofager leder tryckt replikering av vildtyp parasiter än vid senare tidpunkter. Därför är mätning av totalt parasit nummer för framåt genetik skärmen inklusive användning av luminiscenta parasiter problematisk. Det är emellertid möjligt färgningsprotokollet kunde elimineras i gallringssteget om de parenparasit klonerna som används för kemisk eller insertionsmutationer uttryckte en konstitutiv eller inducerbar fluorescerande eller luciferase markör. Den beskrivna protokollet använder IFA och mikroskopi screening av makrofager i 96-hålsplattor möjliggör isolering av mutanter defekta för överlevnad / replikering i aktiverade makrofager, men det är också tydligt missar vissa potentiella mutanter på grund av den begränsade mikroskopisk upplösning uppnås med hjälp av 96-brunnar format vid denna resolution amorfa svullna vakuoler som färgas för parasitantigen kan misstas för friska repliker parasiter inom en normal PV. Substitution av 96 såväl täckglasplattor, istället för 96-brunnsplattor med en optisk yta, är sannolikt kommer att uppnå större upplösning under skärmen av infekterade makrofager i plattor med 96 brunnar.

De allra flesta av de mutanter som identifierats med hjälp av IFN-γ och LPS i den beskrivna protokollet för att aktivera makrofager efter parasit invasionen har en defekt i sin förmåga att skydda sig från kväveoxid 28. I detta avseende, skärmen trots avsedd att vara icke-förspänd,kan berika för isolering av parasit mutanter med ökad känslighet för specifika antimikrobiella medlare beroende på aktiveringsvillkor, typ och arter av makrofager och tidpunkten för parasiten invasionen relativt makrofagaktivering som väljs för skärmen. Således det medfödda immunceller som valts för skärmen och aktiverings stimuli tillämpas är kritiska parametrar som påverkar vilken typ av antimikrobiella medlare till vilka de resulterande parasit mutanter sannolikt är känsliga. Genotypen av parasiten är också en kritisk parameter som typ I genotyper av parasiten är relativt resistenta mot immunitetsrelaterade GTPaser (IRGs) inducerade som svar på IFN-γ medan typ II och III genotyper är mer mottagliga 26,45,46. I den beskrivna protokollet, är makrofager aktiveras efter parasit invasion. Fastän typ II genotypen, är mottaglig för verkan av immunitetsrelaterade GTPaser Prugnaud-stam, som användes i den beskrivna skärmen, enllowing parasiten att invadera makrofager möjliggör första replikering av vildtyp parasiter innan full induktion av IRGs. Dessutom är det inte klart att IRGs är effektiva mot parasiten om de induceras i makrofager efterföljande att parasitinvasion och initiering av replikation.

Den beskrivna protokollet använder makrofager att identifiera parasit gener som är viktiga för resistens mot IFN-γ-beroende mediatorer för cell autonom immunitet, särskilt kväveoxid. Isoleringen av en pool av parasit mutanter som delar en markant mottaglighet för kväveoxid samt en gemensam fenotyp av kväveoxid beroende mitokondriella fragmentering ger en unik uppsättning verktyg för att identifiera parasit gener och vägar som är viktiga för resistens mot kväveoxid och för att förstå verkan av kväveoxid bredare mot T. gondii och andra eukaryota pathogens.The beskrivna protokoll med mindre modifieringar kan användas för framåt genetik studies för att identifiera parasit gener viktiga för resistens mot olika mediatorer av cell autonom immunitet. Potentiella modifieringar inkluderar förändra typen av värdcell infekterad, aktiverings stimuli, eller tidpunkten för aktiverings relativt parasit invasion. Till exempel skulle föraktivering av murina makrofager med IFN-γ före tillsats av parasiter resultera i aktivering av immunitetsrelaterade GTPaser. En sådan modell skulle kunna användas för att identifiera parasit gener i typ I genotyper av T. gondii som kan bidra till motstånds medierad av ROP18 och ROP5 för immunitetsrelaterade GTPaser 24,25. Förmedlare av cell autonom immunitet mot T. gondii i humana medfödda immunceller är inte lika väl definierad som i gnagare. Således, användning av humana perifera blodmonocyter screena kemiska mutanter av T. gondii kan identifiera både parasit gener som är viktiga för överlevnad under mänsklig infektion i medfödda immunceller samt mekanismer viktiga i människor for antimikrobiell resistens mot T. gondii. Parasit gener viktiga för resistens mot specifika antimikrobiella medlare kan identifieras genom att isolera mutanter som inte kan överleva exponering av infekterade värdceller till farmakologiska medel såsom reaktiva syre eller kväve arter. Likaså protokollet kan modifieras för att isolera parasit mutanter med ökad mottaglighet för inflammasome aktivering 47-49 eller ATP stimulering av makrofager purinerga receptorerna 50.

Sammantaget protokollen beskriver en metod att använda framåt genetik och medfödda immunceller att isolera parasit mutanter viktiga för T. gondii motstånd mot IFN-γ beroende cell autonom immunitet. Viktigt satte tillvägagångssätt fram är mångsidig och kan lätt modifieras för att isolera parasitgener viktiga för att kringgå specifika antimikrobiella mediatorer, parasit överlevnad i specifika typer av värdceller eller motstånd mot spänningsförhållanden encounterött under toxoplasmos. Vidare kan parasit gener som är viktiga för att motstå värdcellsaktivering i många fall också spela en roll direkt eller indirekt i cysta produktion in vivo under infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Hyclone SH3008101 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29101&productId=3255471&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone FBS Thermo SH3091003 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=11737973&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Hyclone DPBS Thermo SH3002802  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2434305&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone L-glutamine Thermo SH3003401  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3311957&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType
=PROD&hasPromo=0
Hyclone Pen strep Thermo SV30010  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=1309668
6&catalogId=29104&matchedCat
No=SV30010&fromSearch=1&
searchKey=SV30010&highlightPro
ductsItemsFlag=Y&endecaSearch
Query=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3DSV30010%2B%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings= 0.0&xrefEvent=1407777949003_0
&searchType=PROD&hasPromo=0
Hyclone Hanks BSS Thermo SH3003002 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3064595&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
LPS LIST biologicals 201 http://www.listlabs.com/products-tech.php?cat_id=4&product_id=81&keywords
=LPS_from_%3Cem%3EEscherichia_coli%3C/em%3E_O111:B4
IFN-γ Pepro Tech Inc 50-813-664 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?itemdetail='item'&storeId=10652&
productId=2988494&catalogId=29
104&matchedCatNo=50813664&
fromSearch=1&searchKey=murine+ifn+pepro+tech&highlightProductsItemsFlag
=Y&endecaSearchQuery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3Dmurine%2Bifn%2Bpepro%2Btech%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778210608_
12&searchType=PROD&hasPromo
=0
Chamber slides Thermo 177402 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2164545&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well optical plates Thermo 165306 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3010670&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
96-well tissue culture plates Fisher 353072 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3158736&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=0
Tissue culture flast T25 Fisher 156367 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?storeId=10652&productId=127039
67&catalogId=29104&matchedCat
No=12565351&fromSearch=1&
searchKey=156367&highlightProdu
ctsItemsFlag=Y&endecaSearchQu
ery=%23store%3DRE_SC%23nav%3D0%23rpp%3D25%23offSet%3D0%23keyWord%3D156367%23searchType%3DPROD%23SWKeyList%3D%5B%5D&xrefPartType=From&savings
=0.0&xrefEvent=1407778974800_
0&searchType=PROD&hasPromo
=0
Ted Pella EM grade formaldehyde Ted Pella 18505 http://www.tedpella.com/chemical_html/chem3.htm#anchor267712
Triton X-100 Fisher BP151 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=3425922&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Alexa 488 - protein conjugation kit Life Technologies A20181 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A10235
goat serum MP Biomedicals ICN19135680 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2133236&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&crossRefData
=ICN19135680=2&searchType
=PROD&hasPromo=0
Vectashield mounting media Vector Labs H1200 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=428
FITC-conjugated dolichos Vector Labs FL-1031 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
Antibody to LAMP1 Developmental Studies Hybridoma Bank http://dshb.biology.uiowa.edu/LAMP-1
LysoTracker Life Technologies L-7526 https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L7526?ICID=search-product
C57BL6 mice Jackson Laboratories 664 http://jaxmice.jax.org/strain/000664.html
gp91 phox knock out mice Jackson Labaoratories 2365 http://jaxmice.jax.org/strain/002365.html
iNOS knock out mice Jackson Laboratories 2609 http://jaxmice.jax.org/strain/002609.html
sodium nitroprusside ACROS Organics AC21164-0250  https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2627727&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
DETA NONOate ACROS Organics AC32865-0250 https://www.fishersci.com/ecomm/servlet/itemdetail?storeId=10652&langId=-1&catalog
Id=29104&productId=2252389&dis
type=0&highlightProductsItemsFlag
=Y&fromSearch=1&searchType=
PROD&hasPromo=1
Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scharton-Kersten, T. M., Yap, G., Magram, J., Sher, A. Inducible nitric oxide is essential for host control of persistent but not acute infection with the intracellular pathogen Toxoplasma gondii. J Exp Med. 185 (7), 1261-1273 (1997).
  2. Schluter, D., et al. Inhibition of inducible nitric oxide synthase exacerbates chronic cerebral toxoplasmosis in Toxoplasma gondii-susceptible C57BL/6 mice but does not reactivate the latent disease in T. gondii-resistant BALB/c mice. J Immunol. 162 (6), 3512-3518 (1999).
  3. Khan, I. A., Matsuura, T., Fonseka, S., Kasper, L. H. Production of nitric oxide (NO) is not essential for protection against acute Toxoplasma gondii infection in IRF-1-/- mice. J Immunol. 156 (2), 636-643 (1996).
  4. Khan, I. A., Schwartzman, J. D., Matsuura, T., Kasper, L. H. A dichotomous role for nitric oxide during acute Toxoplasma gondii infection in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13955-13960 (1997).
  5. Mordue, D. G., Desai, N., Dustin, M., Sibley, L. D. Invasion by Toxoplasma gondii establishes a moving junction that selectively excludes host cell plasma membrane proteins on the basis of their membrane anchoring. J Exp Med. 190 (12), 1783-1792 (1999).
  6. Mordue, D. G., Sibley, L. D. Intracellular fate of vacuoles containing Toxoplasma gondii is determined at the time of formation and depends on the mechanism of entry. J Immunol. 159 (9), 4452-4459 (1997).
  7. Coppens, I., et al. Toxoplasma gondii sequesters lysosomes from mammalian hosts in the vacuolar space. Cell. 125 (2), 261-274 (2006).
  8. Joiner, K. A., Fuhrman, S. A., Miettinen, H. M., Kasper, L. H., Mellman, I. Toxoplasma gondii: fusion competence of parasitophorous vacuoles in Fc receptor-transfected fibroblasts. Science. 249 (4969), 641-646 (1990).
  9. Dobrowolski, J. M., Sibley, L. D. Toxoplasma invasion of mammalian cells is powered by the actin cytoskeleton of the parasite. Cell. 84 (6), 933-939 (1996).
  10. Kim, S. K., Fouts, A. E., Boothroyd, J. C. Toxoplasma gondii dysregulates IFN-gamma-inducible gene expression in human fibroblasts: insights from a genome-wide transcriptional profiling. J Immunol. 178 (8), 5154-5165 (2007).
  11. Lang, C., et al. Impaired chromatin remodelling at STAT1-regulated promoters leads to global unresponsiveness of Toxoplasma gondii-Infected macrophages to IFN-gamma. PLoS Pathog. 8, e1002483 (2012).
  12. Kim, L., Butcher, B. A., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii interferes with lipopolysaccharide-induced mitogen-activated protein kinase activation by mechanisms distinct from endotoxin tolerance. J Immunol. 172 (5), 3003-3010 (2004).
  13. Leng, J., Butcher, B. A., Egan, C. E., Abdallah, D. S., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii prevents chromatin remodeling initiated by TLR-triggered macrophage activation. J Immunol. 182 (1), 489-497 (2009).
  14. Leng, J., Denkers, E. Y. Toxoplasma gondii inhibits covalent modification of histone H3 at the IL-10 promoter in infected macrophages. PLoS One. 4, e7589 (2009).
  15. Seabra, S. H., de Souza, W., DaMatta, R. A. Toxoplasma gondii partially inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Exp Parasitol. 100 (1), 62-70 (2002).
  16. Butcher, B. A., et al. Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control. PLoS Pathog. , e1002236 (2011).
  17. Ong, Y. C., Reese, M. L., Boothroyd, J. C. Toxoplasma rhoptry protein 16 (ROP16) subverts host function by direct tyrosine phosphorylation of STAT6. J Biol Chem. 285 (37), 28731-28740 (2010).
  18. Saeij, J. P., et al. Toxoplasma co-opts host gene expression by injection of a polymorphic kinase homologue. Nature. 445 (7125), 324-327 (2007).
  19. Jensen, K. D., et al. Toxoplasma polymorphic effectors determine macrophage polarization and intestinal inflammation. Cell Host Microbe. 9 (6), 472-483 (2011).
  20. Rosowski, E. E., et al. Strain-specific activation of the NF-kappaB pathway by GRA15, a novel Toxoplasma gondii dense granule protein. J Exp Med. 208 (1), 195-212 (2011).
  21. Bougdour, A., et al. Host cell subversion by Toxoplasma GRA16, an exported dense granule protein that targets the host cell nucleus and alters gene expression. Cell Host Microbe. 13 (4), 489-500 (2013).
  22. Braun, L., et al. A Toxoplasma dense granule protein, GRA24, modulates the early immune response to infection by promoting a direct and sustained host p38 MAPK activation. J Exp Med. 210 (10), 2071-2086 (2013).
  23. El Hajj, H., et al. ROP18 is a rhoptry kinase controlling the intracellular proliferation of Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 3, e14 (2007).
  24. Etheridge, R. D., et al. The Toxoplasma Pseudokinase ROP5 Forms Complexes with ROP18 and ROP17 Kinases that Synergize to Control Acute Virulence in Mice. Cell Host Microbe. 15 (5), 537-550 (2014).
  25. Niedelman, W., et al. The rhoptry proteins ROP18 and ROP5 mediate Toxoplasma gondii evasion of the murine, but not the human, interferon-gamma response. PLoS Pathog. 8, e1002784 (2012).
  26. Zhao, Y., et al. Virulent Toxoplasma gondii evade immunity-related GTPase-mediated parasite vacuole disruption within primed macrophages. J Immunol. 182 (6), 3775-3781 (2009).
  27. Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
  28. Skariah, S., Bednarczyk, R. B., McIntyre, M. K., Taylor, G. A., Mordue, D. G. Discovery of a novel Toxoplasma gondii conoid-associated protein important for parasite resistance to reactive nitrogen intermediates. J Immunol. 188 (7), 3404-3415 (2012).
  29. Zhao, Z., et al. Autophagosome-independent essential function for the autophagy protein Atg5 in cellular immunity to intracellular pathogens. Cell Host Microbe. 4, 458-469 (2008).
  30. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infect Immun. 62 (5), 1761-1767 (1994).
  31. Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of bradyzoite-specific Toxoplasma gondii antigens in gamma interferon-treated mouse macrophages. Infect Immun. 61 (3), 1141-1145 (1993).
  32. Tobin, C., Pollard, A., Knoll, L. Toxoplasma gondii cyst wall formation in activated bone marrow-derived macrophages and bradyzoite conditions. J Vis Exp. (42), 2091 (2010).
  33. Gajria, B., et al. ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource. Nucleic Acids Res. 36, D553-D556 (2008).
  34. Farrell, A., et al. Whole genome profiling of spontaneous and chemically induced mutations in Toxoplasma gondii. BMC Genomics. 15, 354 (2014).
  35. Farrell, A., et al. A DOC2 protein identified by mutational profiling is essential for apicomplexan parasite exocytosis. Science. 335 (6065), 218-221 (2012).
  36. Brown, K. M., et al. Forward genetic screening identifies a small molecule that blocks Toxoplasma gondii growth by inhibiting both host- and parasite-encoded kinases. PLoS Pathog. 10, e1004180 (2014).
  37. Jammallo, L., et al. An insertional trap for conditional gene expression in Toxoplasma gondii: identification of TAF250 as an essential gene. Mol Biochem Parasitol. 175 (2), 133-143 (2011).
  38. Coleman, B. I., Gubbels, M. J. A genetic screen to isolate Toxoplasma gondii host-cell egress mutants. J Vis Exp. (60), 3807 (2012).
  39. Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. J Vis Exp. (81), e50966 (2013).
  40. Sibley, L. D., Adams, L. B., Fukutomi, Y., Krahenbuhl, J. L. Tumor necrosis factor-alpha triggers antitoxoplasmal activity of IFN-gamma primed macrophages. J Immunol. 147 (7), 2340-2345 (1991).
  41. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  42. Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients. J Vis Exp. Feb. (48), 2348 (2011).
  43. Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. J Vis Exp. (84), e51225 (2014).
  44. Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress. Mol Biochem Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).
  45. Fentress, S. J., et al. Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence. Cell Host Microbe. 8 (6), 484-495 (2010).
  46. Fleckenstein, M. C., et al. A Toxoplasma gondii Pseudokinase Inhibits Host IRG Resistance Proteins. PLoS Biol. 10, e1001358 (2012).
  47. Cirelli, K. M., et al. Inflammasome sensor NLRP1 controls rat macrophage susceptibility to Toxoplasma gondii. PLoS Pathog. 10, e1003927 (2014).
  48. Ewald, S. E., Chavarria-Smith, J., Boothroyd, J. C. NLRP1 is an inflammasome sensor for Toxoplasma gondii. Infect Immun. 82 (1), 460-468 (2014).
  49. Gorfu, G., et al. Dual role for inflammasome sensors NLRP1 and NLRP3 in murine resistance to Toxoplasma gondii. MBio. 5 (1), (2014).
  50. Lees, M. P., et al. P2X7 receptor-mediated killing of an intracellular parasite, Toxoplasma gondii, by human and murine macrophages. J Immunol. 184 (12), 7040-7046 (2010).

Tags

Immunology , makrofager medfödd immunitet intracellulär patogen immun skatteflykt smittsam sjukdom termins genetik parasit
Framåt Genetics skärmar Använda makrofager att identifiera<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Gener Viktigt för Resistance till IFN-γ beroende cell autonoma immunitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B.,… More

Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter